基于激光誘導(dǎo)擊穿光譜技術(shù)分析鱈魚(yú)中8 種元素含量

林雨青,田 野,陳 倩,李 穎,林 洪,*

(1.中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東 青島 266003;2.中國(guó)海洋大學(xué)信息科學(xué)與工程學(xué)院,山東 青島 266100)

隨著人們生活水平的提高,膳食的攝入也更加豐富,但無(wú)論是常量元素、微量元素還是有害重金屬元素,攝入過(guò)多都會(huì)對(duì)人體健康造成損傷。鱈魚(yú)的食用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值很高,富含眾多人體所需常量和微量營(yíng)養(yǎng)元素,年捕撈量巨大[1]。目前,鱈魚(yú)市場(chǎng)需求量在逐年增長(zhǎng),其營(yíng)養(yǎng)和安全性越來(lái)越受到重視,因此,對(duì)鱈魚(yú)體內(nèi)常量和微量營(yíng)養(yǎng)元素的非定向快速檢測(cè)十分必要。目前常用的微量元素檢測(cè)方法有電感耦合等離子體質(zhì)譜發(fā)射光譜法[2-4],該方法結(jié)果精確、檢出限低、靈敏度高[5],但需要昂貴的化學(xué)試劑以及高純度氣體支撐,以進(jìn)行復(fù)雜的樣品預(yù)處理,且處理過(guò)程中排放的有毒廢物不利于環(huán)境和人體健康。原子吸收光譜法的選擇性強(qiáng)、分析范圍廣、靈敏度和精密度較高,但樣品需提前消化,且不能多元素同時(shí)檢測(cè),分析速度慢[6]。

激光誘導(dǎo)擊穿光譜(laser induced breakdown spectroscopy,LIBS)技術(shù)是近年發(fā)展起來(lái)的一種元素分析技術(shù),該技術(shù)采用一束高能量脈沖激光經(jīng)過(guò)聚焦后燒蝕樣品表面,產(chǎn)生瞬態(tài)等離子體,通過(guò)對(duì)等離子體的發(fā)射光譜進(jìn)行分析實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)樣品的定性或定量檢測(cè)[7]。LIBS技術(shù)具有無(wú)需或少量樣品預(yù)處理、無(wú)環(huán)境污染、檢測(cè)速度快、可以進(jìn)行多元素同時(shí)檢測(cè)的優(yōu)勢(shì),在食品分析領(lǐng)域如嬰兒奶粉、茶葉、水果、蔬菜、食用油、谷物、酒、肉類(lèi)等方面的應(yīng)用均有報(bào)道[8-14]。例如,Casado-Gavalda等[15]使用LIBS檢測(cè)添加到牛肝中碎牛肉的銅元素含量;Andersen等[16]使用LIBS定量檢測(cè)新鮮家禽肉類(lèi)中的鈣元素含量;Velioglu等[17]用LIBS成功測(cè)定了牛肉中內(nèi)臟的含量,有效識(shí)別內(nèi)臟摻假問(wèn)題。然而,LIBS在定量檢測(cè)和分析過(guò)程中存在一些挑戰(zhàn)。樣品不均勻、實(shí)驗(yàn)條件波動(dòng)、譜線干擾、基體效應(yīng)等問(wèn)題均會(huì)對(duì)LIBS分析結(jié)果產(chǎn)生很大的影響[18],導(dǎo)致定量精度和準(zhǔn)確度較差。針對(duì)這一問(wèn)題,采用合適的內(nèi)標(biāo)元素進(jìn)行光譜歸一化(內(nèi)標(biāo)法)能夠有效克服實(shí)驗(yàn)條件波動(dòng)和基體效應(yīng)的影響[19]。同時(shí),近年來(lái)也發(fā)展了一系列基于化學(xué)計(jì)量學(xué)的多元分析方法[20-24],如偏最小二乘(partial least square,PLS)法、支持向量機(jī)、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)用于LIBS光譜分析,能夠有效改善LIBS的定量分析性能[25]。

本研究將LIBS技術(shù)用于鱈魚(yú)中8 種元素P、Fe、Al、Mn、K、Mg、Ca、Na的同時(shí)定量分析。制備6 組不同含量的鱈魚(yú)標(biāo)準(zhǔn)樣品,采用電感耦合等離子體發(fā)射光譜(inductively coupled plasma-optical emission spectrometry,ICP-OES)法提供各元素濃度的參考值。選擇5 組樣品繪制各元素的定標(biāo)曲線,1 組樣品作為待測(cè)樣品得到LIBS預(yù)測(cè)含量。采用單變量定標(biāo)、內(nèi)定標(biāo)與PLS 3 種定量方法,通過(guò)比較定標(biāo)曲線的相關(guān)系數(shù)(R2)、預(yù)測(cè)含量的相對(duì)誤差、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)、交叉驗(yàn)證均方根誤差(root mean square error of cross validation,RMSECV)指標(biāo),評(píng)估LIBS對(duì)各元素的定量分析能力,驗(yàn)證該方法用于水產(chǎn)品多種元素的同時(shí)、快速、非定向檢測(cè)的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鱈魚(yú) 市購(gòu);P、Fe、Al、Mn、K、Mg、Ca、Na標(biāo)準(zhǔn)液 國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心;PH-302微晶纖維素 日本旭化成株式會(huì)社;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Dava-200 Nd:YAG調(diào)Q脈沖激光器 鐳寶光電技術(shù)有限公司;AvaSpec-2048-USB2四通道光譜儀 荷蘭Avantes公司;5110等離子體發(fā)射光譜儀 美國(guó)安捷倫公司;FW-4A粉末壓片機(jī) 天津拓普儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

使用實(shí)驗(yàn)室肉類(lèi)攪拌器分別切碎鱈魚(yú)樣品,攪拌器使用前經(jīng)過(guò)抗菌洗滌液和超純水的仔細(xì)清潔,以確保沒(méi)有污染。使用干凈的燒杯將樣品置于105 ℃的鼓風(fēng)干燥箱中烘干,直至恒質(zhì)量。之后,制備系列含量標(biāo)準(zhǔn)品,如表1所示。將烘干后的樣品粉末進(jìn)行壓片處理[26],將樣品粉末與微晶纖維素茹合劑按質(zhì)量比3∶2混合均勻,使用分析天平準(zhǔn)確稱(chēng)量每種含量的混合樣品粉末0.35 g,轉(zhuǎn)移至壓片模具中,用粉末壓片機(jī)在15 MPa的壓力下保持3 min,得到直徑為13 mm的片狀樣品。每個(gè)片狀樣品制作之前都使用無(wú)水乙醇將壓片模具內(nèi)外擦拭干凈,最后采用LIBS系統(tǒng)對(duì)制備的片狀樣品進(jìn)行光譜采集。

按照GB 5009.268—2016《食品中多元素的測(cè)定》中的ICP-OES法作為標(biāo)準(zhǔn)方法,得到各個(gè)樣品中P、Fe、Al、Mn、K、Mg、Ca、Na元素的實(shí)際含量。將每個(gè)含量的樣品粉末在105 ℃的鼓風(fēng)干燥箱中干燥完全,獲得盡可能均勻的樣品,使用HNO3對(duì)樣品進(jìn)行消化。消化后根據(jù)樣品中不同的元素含量使用超純水對(duì)消化液進(jìn)行梯度稀釋。

儀器參數(shù):泵速100 r/min,霧化器壓力0.2 MPa,射頻功率1 150 W,樣品沖洗時(shí)間20 s。對(duì)稀釋后的消化液進(jìn)行檢測(cè),并根據(jù)對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)和信號(hào)強(qiáng)度制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,由各個(gè)元素標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到實(shí)際含量。ICP-OES獲得的各樣品中8 種元素的參考含量如表1所示。

表1 樣品中各元素的參考含量Table 1 Concentrations of P, Fe, Al, Mn, K, Mg, Ca, Na in each sample mg/kg

1.3.2 LIBS光譜檢測(cè)裝置與處理

圖1 鱈魚(yú)樣品多元素分析LIBS實(shí)驗(yàn)裝置Fig. 1 Schematic of the LIBS device used for multi-elemental analysis of cod samples

本實(shí)驗(yàn)采用的LIBS實(shí)驗(yàn)裝置如圖1所示。激光器輸出激光波長(zhǎng)1 064 nm,重復(fù)頻率10 Hz,脈沖寬度10 ns。激光脈沖能量采用75 mJ,經(jīng)擴(kuò)束后由平凸透鏡(f=50 mm)會(huì)聚到樣品表面產(chǎn)生等離子體。等離子體輻射通過(guò)雙透鏡收集器耦合到光纖頭中,光譜儀波段范圍200～850 nm,光譜探測(cè)延時(shí)設(shè)置為1.28 μs,積分時(shí)間為1 ms。在實(shí)驗(yàn)中調(diào)節(jié)樣品表面水平,并通過(guò)十字激光配合CMOS相機(jī)對(duì)樣品表面高度實(shí)時(shí)監(jiān)控。通過(guò)三維電動(dòng)位移平臺(tái)控制樣品的移動(dòng),選擇樣品表面邊長(zhǎng)為7.20 mm的正方形區(qū)域進(jìn)行激光打點(diǎn),在10×10網(wǎng)格中,每個(gè)取樣點(diǎn)打10 次激光脈沖,每10 個(gè)取樣點(diǎn)獲得一張光譜,即每張光譜為100 個(gè)激光脈沖的平均。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)量10 次得到10 張光譜。

在獲得原始光譜后首先進(jìn)行基線去除,之后針對(duì)每種元素選擇合適的特征波長(zhǎng),采用單變量定標(biāo)、內(nèi)定標(biāo)、PLS 3 種方法分別繪制各元素定標(biāo)準(zhǔn)曲線。對(duì)于每種定量方法,統(tǒng)一選用表1中的1、2、3、5、6號(hào)樣品作為己知樣品(共50 張光譜)繪制定標(biāo)曲線,4 號(hào)樣品作為待測(cè)樣品(共10 張光譜)用以驗(yàn)證不同定量方法的預(yù)測(cè)能力。所有的光譜數(shù)據(jù)均采用Matlab R2017進(jìn)行處理(Math Works,United States)。

2 結(jié)果與分析

2.1 特征譜線的選擇

如圖2所示,在200～850 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi),能夠清晰識(shí)別出P、Fe、Al、Mn、K、Mg、Ca、Na 8 種元素的特征譜線。各元素特征譜線的確定根據(jù)文獻(xiàn)調(diào)研結(jié)合NIST數(shù)據(jù)庫(kù)查詢(xún)實(shí)現(xiàn)。對(duì)于每種元素,選擇合適的譜線進(jìn)行定量分析對(duì)后續(xù)的定量結(jié)果至關(guān)重要。本實(shí)驗(yàn)對(duì)于每種元素的特征譜線選取遵循以下3 條原則:1)選擇信噪比高,且附近無(wú)其他元素譜線干擾的譜線;2)對(duì)于含量較高且譜線選擇多的元素(如P、Mg、Ca、Na),選擇下能級(jí)不為基態(tài)的譜線,以減少譜線自吸收效應(yīng)對(duì)定量分析的影響;3)對(duì)含量較低且譜線選擇少的元素(如Fe、Al、Mn、K),選擇下能級(jí)為基態(tài)的譜線,以保證較好的譜線質(zhì)量。此外,在滿足以上原則的基礎(chǔ)上,優(yōu)先選擇各元素的原子線,其原因是原子線受實(shí)驗(yàn)條件波動(dòng)、等離子體狀態(tài)波動(dòng)等因素的干擾更小,更有利于定量分析。最終本實(shí)驗(yàn)所選取的8 種元素的特征譜線如圖2和表2所示。

圖2 鱈魚(yú)樣品8 種元素的典型LIBS光譜Fig. 2 Typical LIBS spectra of 8 elements in cod samples

表2 鱈魚(yú)樣品8 種元素的特征譜線Table 2 Characteristic lines of 8 elements in cod samples

2.2 單變量定標(biāo)法和內(nèi)定標(biāo)法

2.2.1 單變量定標(biāo)法

圖3 8 種元素單變量定標(biāo)曲線Fig. 3 Univariate calibration curves of 8 elements

傳統(tǒng)的單變量定標(biāo)法是以目標(biāo)元素的譜線強(qiáng)度為因變量,樣品中該元素的標(biāo)準(zhǔn)含量為自變量,繪制定標(biāo)曲線進(jìn)行定量分析。本實(shí)驗(yàn)譜線強(qiáng)度采用峰值強(qiáng)度,以ICP-OES測(cè)得的元素含量作為標(biāo)準(zhǔn)含量。8 種元素的單變量定標(biāo)曲線如圖3所示。R2越趨近于1,說(shuō)明擬合效果越好。誤差棒由每組樣品的10 次重復(fù)測(cè)量結(jié)果得到。可以發(fā)現(xiàn),采用單變量定標(biāo)法得到的定標(biāo)曲線普遍不理想,P、Fe、Al、Mg、Na元素的R2均低于0.9,P元素R2僅為0.715 2,相關(guān)性較低。此外,待測(cè)樣品的各元素偏離定標(biāo)曲線較遠(yuǎn),反映了單變量定標(biāo)法對(duì)未知樣品存在較大的預(yù)測(cè)誤差。該結(jié)果說(shuō)明在LIBS用于鱈魚(yú)樣品的定量分析時(shí),傳統(tǒng)的單變量定標(biāo)法受樣品不均勻、基體效應(yīng)、實(shí)驗(yàn)條件波動(dòng)等因素影響較大,其檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性較低,難以滿足檢測(cè)要求。

2.2.2 內(nèi)定標(biāo)法

圖4 8 種元素的內(nèi)定標(biāo)曲線Fig. 4 Internal calibration curves of 8 elements

內(nèi)定標(biāo)法是LIBS技術(shù)中普遍采用的定量方法,該方法選擇樣品中含量固定不變的元素(或含量很高的基體元素)作為內(nèi)標(biāo)元素,通過(guò)待測(cè)元素譜線與內(nèi)標(biāo)元素譜線的比值,繪制定標(biāo)曲線進(jìn)行定量分析。內(nèi)標(biāo)法能夠在一定程度上降低實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的波動(dòng)和樣品基體效應(yīng)所帶來(lái)的影響,獲得較好的定量結(jié)果。由于本實(shí)驗(yàn)采用的鱈魚(yú)樣品為有機(jī)樣品,其基體元素為C、H、O、N,綜合考慮之后選擇譜線較強(qiáng)的CN 388.29 nm的分子譜線作為內(nèi)標(biāo)譜線。如圖4所示,經(jīng)過(guò)內(nèi)定標(biāo)處理后,定標(biāo)曲線的線性相關(guān)性顯著提高,P元素的R2從0.715 2提升到0.822 0,其他7 種元素的R2均在0.925 3以上。同時(shí)各點(diǎn)的誤差棒更小,對(duì)未知樣品的預(yù)測(cè)誤差也普遍降低,反映了采用內(nèi)定標(biāo)法比單變量定標(biāo)法具有更好的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度和精度,定量分析結(jié)果得到明顯改善。

2.3 PLS法

為了進(jìn)一步優(yōu)化LIBS光譜的定量分析結(jié)果,本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步采用PLS方法建立多變量回歸模型用于鱈魚(yú)中各元素的定量分析。PLS方法是一種基于化學(xué)計(jì)量學(xué)統(tǒng)計(jì)分析的多元分析方法,目前在LIBS光譜的定性分類(lèi)和定量檢測(cè)中得到廣泛應(yīng)用[27-30]。該方法能夠有效簡(jiǎn)化數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu),具有較好的分析效果[31]。在建立PLS定量分析模型時(shí),采用全波段光譜數(shù)據(jù)作為模型的輸入變量不僅大大增加了數(shù)據(jù)運(yùn)算量,更重要的是會(huì)引入噪聲和不相關(guān)變量的干擾,從而降低模型的預(yù)測(cè)能力。因此本實(shí)驗(yàn)針對(duì)鱈魚(yú)中的8 種元素,在確定其特征譜線之后,選擇該譜線附近的光譜區(qū)間作為輸入變量,分別建立PLS回歸模型。各元素含量參考值和PLS預(yù)測(cè)值之間的定標(biāo)曲線如圖5所示。

圖5 8 種元素含量參考值與預(yù)測(cè)值的PLS定標(biāo)曲線Fig. 5 PLS calibration curves of 8 elements between reference values and predicted values

由圖5可以看出,對(duì)于5 組訓(xùn)練集樣品,采用PLS方法得到的預(yù)測(cè)值和參考值之間具有很好的相關(guān)性,各元素的R2均有明顯提升,Al、Mn、K、Mg、Ca、Na 6 種元素的R2均在0.991 2以上,Fe與P元素的R2也分別達(dá)到0.984 0和0.926 1。對(duì)于測(cè)試集樣品(圓點(diǎn)),可以發(fā)現(xiàn)離定標(biāo)曲線的偏離程度普遍較小,反映了PLS模型具有較低的預(yù)測(cè)誤差。圖6進(jìn)一步給出了單變量定標(biāo)、內(nèi)定標(biāo)、PLS 3 種方法對(duì)測(cè)試集樣品8 種元素預(yù)測(cè)的相對(duì)誤差。值得注意的是,受樣品個(gè)數(shù)的限制,測(cè)試集中僅包含一組含量的樣品,因此所獲得的預(yù)測(cè)相對(duì)誤差結(jié)果具有一定的偶然性。但從圖6仍可發(fā)現(xiàn),采用PLS方法后,P、Al、Mn、Mg、Na 5 種元素具有最低的相對(duì)誤差。統(tǒng)計(jì)8 種元素相對(duì)誤差的平均值發(fā)現(xiàn),單變量定標(biāo)、內(nèi)定標(biāo)、PLS的平均相對(duì)誤差分別為8.84%、7.02%和5.01%,反映了PLS方法具有最高的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度。以上結(jié)果表明,在LIBS對(duì)鱈魚(yú)中多種元素的同時(shí)定量分析時(shí),PLS方法優(yōu)于傳統(tǒng)的單變量定標(biāo)法和內(nèi)定標(biāo)法,具有更高的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度。后續(xù)工作將進(jìn)一步增加PLS模型中訓(xùn)練集和測(cè)試集樣品個(gè)數(shù),避免模型過(guò)擬合情況,以獲得更好的定量分析結(jié)果。

圖6 3 種方法對(duì)8 種元素的預(yù)測(cè)相對(duì)誤差Fig. 6 Relative prediction errors of 8 elements using the 3 methods

如表3所示,相對(duì)誤差、RSD、RMSECV值越小,說(shuō)明模型預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性、預(yù)測(cè)精度和可信度越高。8 種元素的R2和RMSECV的平均值分別為0.986和0.564,相對(duì)誤差范圍為0.96%～13.27%,平均值為5.01%,RSD范圍為2.02%～7.55%,平均值為4.65%,體現(xiàn)了PLS模型較好的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度和精度。另一方面,比較不同的元素可以發(fā)現(xiàn),PLS模型對(duì)Fe、Al、K、Mg、Ca、Na 6 種元素具有較好的定量結(jié)果,而Mn元素的預(yù)測(cè)相對(duì)誤差較大(13.27%),P元素的R2較低(0.926 1)。其可能的原因?yàn)闃悠分械腗n元素含量較低(8.18～34.90 mg/kg),譜線質(zhì)量較差(圖2),導(dǎo)致定量分析誤差較大;而P為非金屬元素,相對(duì)其他金屬元素檢測(cè)難度更大,且P元素的含量梯度較小(21 539.70～30 096.01 mg/kg),導(dǎo)致定量的線性相關(guān)性較低?？偨Y(jié)以上結(jié)果可以得出,利用LIBS技術(shù)結(jié)合PLS方法能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)鱈魚(yú)中多種元素的同時(shí)定量分析,且具有較高的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度和精度,有效驗(yàn)證了LIBS技術(shù)用于鱈魚(yú)多元素檢測(cè)的可行性。

表3 PLS模型的預(yù)測(cè)結(jié)果指標(biāo)Table 3 Calibration and prediction results from PLS model

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)利用LIBS技術(shù)對(duì)鱈魚(yú)中的P、Fe、Al、Mn、K、Mg、Ca、Na 8 種元素進(jìn)行同時(shí)定量分析,并對(duì)單變量定標(biāo)、內(nèi)定標(biāo)、PLS 3 種定量方法進(jìn)行了比較。結(jié)果表明,內(nèi)定標(biāo)方法比傳統(tǒng)的單變量定標(biāo)方法具有更好的定量效果,定標(biāo)曲線的相關(guān)系數(shù)有明顯提升。而進(jìn)一步的采用PLS方法能夠獲得最佳的定量分析結(jié)果,8 種元素R2和RMSECV的平均值分別為0.986和0.564,相對(duì)誤差范圍在0.96%～13.27%之間,平均值為5.01%,RSD范圍在2.02%～7.55%之間,平均值為4.65%,體現(xiàn)了PLS模型較好的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度和精度。結(jié)果表明LIBS技術(shù)應(yīng)用于鱈魚(yú)中多種元素的快速、非定向檢測(cè)方面效果良好,并有很大潛力推廣至水產(chǎn)品檢測(cè),同時(shí)為今后針對(duì)水產(chǎn)品的便攜式LIBS檢測(cè)儀器開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。