基于生物信息學分析CISD2在肝細胞癌中的表達意義及功能網絡關系

劉發(fā)煇 侯婉云 朱麗蘭 羅春英

【摘要】目的探究CDGSH鐵硫結構域2（CISD2）在肝細胞癌（HCC）發(fā)生發(fā)展中的作用、臨床病理意義及其潛在作用機制。

方法Kaplan Meierplotter分析CISD2 mRNA表達與HCC患者5年生存率的關系;在線網頁工具STRING構建CISD2蛋白相互作用網絡，基因本體論富集分析CISD2蛋白質功能;網頁工具TIMER分析CISD2在HCC中與免疫細胞浸潤含量之間的關系;GSEA分析CISD2高表達在HCC中參與的信號通路。

結果（1）CISD2 mRNA高表達的HCC患者的5年總生存率低于低表達患者;（2）CISD2與B細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞的浸潤呈負相關;（3）CISD2主要參與了細胞內二價鐵硫簇結合，鐵硫簇綁定以及金屬集群綁定;（4）GSEA分析表明CISD2高表達在HCC中促進卟啉和葉綠素代謝，戊糖、葡萄糖醛酸轉換，抗壞血酸和醛酸代謝，氨基糖和核苷酸糖代謝，淀粉和蔗糖代謝等多條代謝通路。

結論（1）在HCC中，CISD2 mRNA高表達與HCC患者的較差預后有關。（2）CISD2可能通過影響腫瘤細胞的鐵離子、能量代謝和腫瘤免疫微環(huán)境促進腫瘤細胞的生存和增殖。

【關鍵詞】CISD2 ;肝細胞癌;生物信息學;預后;功能網絡分析

中圖分類號：R735.7文獻標志碼：ADOI：10.3969/j.issn.10031383.2020.06.003

【Abstract】ObjectiveTo investigate the role，clinicopathological significance and potential mechanism of CDGSH Iron Sulfur Domain 2（CISD2） in the occurrence and development of hepatocellular carcinoma（HCC）.

MethodsKaplanMeierplotter was used to analyze relationship between CISD2 mRNA expression and 5year survival rate of HCC patients.Online web tool STRING was used to build CISD2 protein interaction network，gene ontology enrichment was used to analyze CISD2 protein function.In addition，Web TIMER was used? to analyze relationship between CISD2 and the infiltration of immune cells in HCC，and GSEA was used to analyze the signaling pathways involved in the high expression of CISD2 in HCC.

Results（1） 5year overall survival rate of HCC patients with high CISD2 mRNA expression was lower than that of patients with low CISD2 mRNA expression.（2） CISD2 was negatively correlated with the infiltration of B cells，CD4+T cells，CD8+T cells，macrophages，and dendritic cells.（3） CISD2 mainly involved in the bindings of the ironsulfur group，ironsulfur cluster，and metal cluster.（4） GSEA analysis showed that CISD2 high expression promoted porphyrin and chlorophyll metabolism，pentose and glucuronic acid conversion，ascorbic acid and aldehyde acid metabolism，amino and nucleotide glucose metabolism，and starch and sucrose metabolism in HCC.

Conclusion（1） In HCC，high CISD2 mRNA expression is associated with poor prognosis in HCC patients.（2） CISD2 may promote the survival and proliferation of tumor cells by affecting the iron ion，energy metabolism and tumor immune microenvironment of tumor cells.

【Key words】CISD2;HCC;bioinformatics;prognosis;functional network analysis

肝細胞癌（Hepatocellular Carcinoma，HCC）是臨床上最常見的惡性腫瘤之一，在與癌癥相關的死亡原因中，HCC是死亡率第三的腫瘤[1]。但其潛伏期長，多數患者在肝癌晚期才出現癥狀，由于肝癌的高復發(fā)率和高轉移率，晚期肝癌患者的5年生存率不超過5%。因此，如何在早期對HCC進行準確判斷和檢測對HCC治療具有積極的意義。在過去的20年中，大量的分子標志物被發(fā)現在HCC患者中異常表達，它們都具有潛在的臨床應用價值。然而，HCC的發(fā)病機制復雜，涉及細胞周期調節(jié)和信號轉導等過程，反映細胞的功能以及多個基因在多個步驟中的相互作用，通過篩選與腫瘤形成和進展相關的基因網絡，有可能發(fā)現新的HCC藥物靶點。

CDGSH鐵硫結構域2（CDGSH Iron Sulfur Domain 2，CISD2）是細胞內保護線粒體結構完整以及維持能量代謝功能的關鍵蛋白，由CISD2基因編碼，主要位于線粒體的外膜上[2]。盡管許多實驗已經表明CISD2在多種腫瘤中存在表達異常，但目前CISD2在HCC中表達及其具體作用仍存在爭議：在非酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎中，通過上調CISD2的表達，可特異性地增強Serca2b活性和細胞內氧化應激，幫助維持代謝平衡和逆轉脂肪變性，從而阻止其向HCC的發(fā)展[3];而CHEN等人[4]的實驗表明CISD2在HCC腫瘤組織中高表達并且上調CISD2的表達可促進肝癌細胞的增殖和致瘤性。以上兩種研究表明目前CISD2在HCC中的作用尚不完全清楚，因此本課題利用生物信息學分析從多方面、不同層次探討了CISD2在HCC發(fā)病過程中的交互作用以及相關機制。

1材料與方法

1.1KaplanMeier Plotter分析CISD2 mRNA表達與患者預后相關性

KaplanMeier Plotter（https：//kmplot.com/analysis/）[5]是一款在線預后分析網站，提供HCC的mRNA和miRNA的表達與生存相關性的分析。本實驗利用KaplanMeier Plotter分析了從GEO、EGA和腫瘤基因組圖譜（TCGA）獲得的芯片數據以及RNAseq數據中一共364例HCC患者CISD2 mRNA的表達情況與HCC患者預后的關系。在KaplanMeier Plotter數據分析平臺中，先檢索CISD2基因，然后應用該平臺的在線分析軟件繪制CISD2高低表達的生存曲線。限定條件為總體生存率（OS），生存時間統(tǒng)計最長為60個月。腫瘤病理類型、分期及其病人性別等其他條件不做限制，從而評估CISD2 mRNA表達與HCC患者5年總生存率的關系，結果以P<0.05為有統(tǒng)計學意義。

1.2TIMER分析CISD2 mRNA表達與免疫浸潤含量之間的相關性

TIMER（https：//cistrome.shinyapps.io/timer/）[6～7]是用于系統(tǒng)分析各種癌癥類型的免疫細胞浸潤情況的綜合資源。TIMER數據庫包括來自TCGA的32種癌癥類型10 897個樣本。本實驗分析了來自TCGA的374例HCC患者CISD2 mRNA表達量與六種免疫細胞（B細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、中性粒細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞）含量的相關性，在TIMER數據分析平臺中，通過在“Gene”模塊中輸入CISD2基因以及選擇腫瘤類型“LIHC”（肝細胞性肝癌）即可通過TIMER評估CISD2 mRNA表達與HCC患者免疫細胞浸潤情況的關系，結果以P<0.05為有統(tǒng)計學意義。

1.3CISD2蛋白質相互作用網絡的構建及GO富集分析

蛋白質功能的完整描述需要了解與之特異性結合的所有伴侶蛋白質。STRING[8]（https：//stringdb.org/）通過為大量生物體提供全面但質量受控的蛋白質蛋白質結合體來簡化對這些信息的訪問。該工具關聯了來自高通量實驗，數據庫，文獻的挖掘以及基于基因組環(huán)境分析預測的數據。使用STRING 11.0數據庫收集包含5090個物種中的24 584 628種蛋白之間的相互作用信息，找到“Protein by name”模塊，輸入CISD2基因，選擇物種“Homo sapiens”，并設置最低相互作用分值為0.4后即可獲得CISD2蛋白相互作用網絡。GO富集也被稱為基因本體（Gene Ontology）富集，它涵蓋了生物學的三個方面：細胞組分（cellular component）、分子功能（Molecular Function）、生物過程（biological process）。我們采用R軟件擴展包“cluster profiler”[9]對CISD2蛋白相互作用網絡中的基因進行GO富集分析，以P<0.05為有統(tǒng)計學意義，并用R語言“GO plot”包[10]進行了結果可視化，從而探究CISD2蛋白質功能。

1.4GSEA分析CISD2在HCC中參與的信號通路

基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis，GSEA）[11]是用來評估一個預先定義的基因集的基因在與表型相關度排序的基因表中的分布趨勢，判斷其對表型的貢獻。通過軟件GSEA_4.0.3（https：//www.gseamsigdb.org/gsea/index.jsp）進行分析，該軟件的輸入數據包含兩部分，一個是基因表達矩陣文件，另一個是CISD2基因根據表達值的中位數將腫瘤組織樣本分為高表達組和低表達組文件，GSEA軟件會對基因根據其和表型的相關度從大到小排序，然后判斷基因集內每條注釋下的基因是否富集于表型相關度排序后基因表的上部或下部，從而判斷此基因集內基因的協同變化對表型變化的影響。TCGA計劃是由美國于2006年聯合啟動的項目，它以大規(guī)模測序為主的基因組分析技術為基礎，旨在使用基因組測序和生物信息學來分析癌癥相關的基因突變。迄今為止，TCGA已對來源于11 000位患者的33種腫瘤進行實驗，其中包括10種罕見腫瘤，數據量達2500T。在本實驗中，我們選用從TCGA下載的374例HCC患者基因表達矩陣作為預先定義的基因集，并提取其中CISD2的表達值進行高低分組，利用GSEA軟件分析CISD2表達水平對各種生物通路基因集的作用，按照GSEA軟件默認參數，隨機組合1000次進行富集分析。按總體錯誤率（family wise error rate，FWER）進行排序，并將FWER<0.05的基因集作為顯著富集基因集。

1.5統(tǒng)計學方法

所有的數據分析均采用網頁以及軟件自帶的數據分析功能進行統(tǒng)計學分析，檢驗水準為α=0.05。

2結果

2.1生物信息學分析CISD2與HCC患者的預后相關性結果

生物信息學分析表明，CISD2的mRNA表達水平與HCC患者的總體5年生存率相關（P=0.041）。見圖1。其中CISD2 mRNA高表達患者的5年中位生存時間為36個月，CISD2 mRNA低表達患者的5年中位生存時間為45個月，研究結果表明CISD2 mRNA高表達提示HCC患者預后較差。

2.2CISD2與免疫浸潤含量分析

腫瘤免疫微環(huán)境由腫瘤細胞、間質細胞和浸潤免疫細胞組成。我們利用TIMER初步探究了CISD2表達與免疫細胞浸潤的潛在聯系。結果表明，CISD2與B細胞（P=5.44E04）、CD4+T細胞（P=3.94E06）、CD8+T細胞（P=2.90E03）、巨噬細胞（P=9.22E07）和樹突狀細胞（P=3.19E04）的浸潤有關聯，且都呈負相關。見圖2。

2.3生物信息學分析CISD2的PPI互作網絡及GO富集結果

網頁工具STRING進行PPI分析，發(fā)現SFXN4、COX4I1、WFS1、GIMAP5、TSFM、MRFAP1、CISD3、MTPAP、OPA3、SOD1 共10個基因與CISD2相互作用最為密切，結果如圖3所示。隨后，本實驗使用R語言包“cluster profiler”對這11個蛋白進行了GO富集分析，并用R語言“GO plot”包進行了結果可視化。GO富集分析結果顯示CISD2在分子功能（Molecular Function）方面主要參與了2價鐵硫簇結合（P=0.003）、鐵硫簇綁定（P=0.007）以及金屬集群綁定（P=0.007）。見圖4。

2.4GSEA結果分析

利用GSEA分析CISD2高表達促進的信號通路，分析結果表明，CISD2高表達在HCC中促進卟啉和葉綠素代謝（P=0.002），戊糖、葡萄糖醛酸轉換（P=0.005），抗壞血酸和醛酸代謝（P=0.011），氨基糖和核苷酸糖代謝（P=0.022），淀粉和蔗糖代謝（P=0.023）這些信號通路，表明CISD2在HCC中可能通過調節(jié)細胞的代謝過程促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。見表1。

3討論

HCC是世界許多地區(qū)癌癥相關死亡的主要原因。過去的幾十年里，在了解肝細胞癌的流行病學、危險因素和分子特征方面取得了相當大的研究進展，但HCC的具體分子機制尚不清楚，仍有待進一步探究。目前已有研究證明CISD2在肝癌中表達異常，但其具體分子作用尚未被完全闡明，因此在本實驗中，我們通過生物信息學手段確定了CISD2 mRNA的高表達與HCC患者較差的5年生存率相關，接著為了探究其潛在機制，評估了CISD2 mRNA與HCC患者免疫細胞的浸潤情況。然后通過構建CISD2蛋白質相互作用網絡并且使用GO富集分析，從而了解CISD2蛋白的功能，并通過GSEA富集分析了CISD2在HCC中促進的通路。

為了探究CISD2在細胞中的功能，本課題借助生物信息學的基因本體論分析，探究了CISD2的分子功能。結果表明CISD2主要參與了2價鐵硫簇結合，鐵硫簇綁定。過去10年間，科研人員發(fā)現“鐵依賴”成為癌細胞的一種關鍵表型。盡管這種“鐵依賴”的確切原因在很大程度上是未知的[12～13]，但有人提出，癌細胞需要過量的鐵來支持它們的高代謝率，因為鐵是許多不同蛋白質的輔因子，包括參與DNA和蛋白質合成、糖酵解和呼吸等過程[14]。因此，針對癌細胞對“鐵依賴”的治療方法已經被提出[15]。癌細胞表現出的鐵和活性氧依賴的表型，結合CISD2蛋白對線粒體鐵和活性氧的調控作用以及不同腫瘤中CISD2蛋白的高表達水平，也提示CISD2蛋白可能在支持癌細胞增殖中發(fā)揮關鍵作用。事實上，如上所述，許多研究報告了CISD2蛋白過表達與癌細胞增殖、腫瘤生長和轉移之間的直接聯系。雖然從這些研究中可以明顯看出CISD2蛋白在促進腫瘤方面的作用，但目前仍缺乏CISD2蛋白在腫瘤細胞增殖中作用機制的研究。針對CISD2對腫瘤細胞內鐵調控的研究將會對CISD2蛋白在癌癥增殖中作用機制有進一步的了解。

修復抗腫瘤免疫缺陷一直是癌癥治療中的難題，近年來，免疫療法已逐漸成為治療腫瘤的最有前景的方法。目前觀點普遍認為免疫浸潤與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密不可分的關系。為了初步探究CISD2的表達與HCC中免疫浸潤的關系，我們利用生物信息學的方法對CISD2 mRNA表達水平與不同的免疫細胞浸潤含量進行了表達相關性分析，研究結果表明，CISD2 mRNA表達與B細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞的浸潤含量呈負相關，故推測高表達CISD2通過某種機制降低腫瘤中免疫細胞的含量，增加了肝癌細胞的免疫逃逸，從而促進了腫瘤的增殖，提示今后靶向CISD2的免疫治療策略成為可能，但免疫細胞間的具體相關性，例如CISD2與CD4+T細胞之間的相關性是不是因為CD8+T細胞的影響而產生的，這些都有必要后續(xù)進一步的實驗進行驗證。盡管如此，本研究結果依然表明研究CISD2在HCC中與免疫細胞的關系，將會有助于今后免疫療法在HCC中的治療。最后，本課題還通過GSEA富集分析，探究了高表達的CISD2在HCC中所促進的通路。結果顯示CISD2高表達促進腫瘤細胞的代謝功能，包括卟啉和葉綠素代謝，戊糖、葡萄糖醛酸轉換，抗壞血酸和醛酸代謝，氨基糖和核苷酸糖代謝，淀粉和蔗糖代謝。卟啉主要在人體肝臟內進行合成與利用，同時肝臟也是卟啉代謝異常時病變的好發(fā)部位，張瓔等人[16]的研究表明，卟啉峰值異常升高在原發(fā)性肝癌中表現明顯，同時將甲胎蛋白與卟啉峰值進行聯合應用能有效提高臨床原發(fā)性肝癌的診斷效果;葉綠素作為一種廣泛存在的自然產物，與其衍生物在腫瘤治療中表現出良好的調節(jié)作用，它們作為化療輔助劑或是對肝癌的有效預防在實驗中都得以證明[17]。戊糖、葡萄糖醛酸轉換為腫瘤細胞代謝提供所必需的維生素C，而抗壞血酸和醛酸代謝，氨基糖和核苷酸糖代謝，淀粉和蔗糖代謝都影響了體內正常的糖代謝，這些結果都表明了CISD2可能通過影響腫瘤糖代謝表現出與腫瘤細胞增殖生長相關的特性。石漢平[18]的研究認為腫瘤是一種代謝性疾病，調整腫瘤的治療策略與方向，將腫瘤營養(yǎng)與代謝調節(jié)治療作為腫瘤研究與治療的新方向，將更有利于腫瘤的治療，因此了解CISD2在HCC中的代謝調節(jié)通路也有助于將來在腫瘤中的代謝治療提供一定的參考價值。

綜上所述，我們通過多種生物信息學分析方法，先確定了CISD2 mRNA的高表達與HCC患者較差的預后相關，隨后初步探究了CISD2表達與腫瘤患者免疫細胞浸潤含量的相關性，CISD2蛋白的分子功能以及CISD2在HCC中所參與的信號通路。進一步闡明了CISD2在HCC中的臨床意義以及為后續(xù)的研究提供了一定的理論基礎。

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（收稿日期：2020-04-08修回日期：2020-05-15）

（編輯：王琳葵梁明佩）