易清清，梁冬雨，史俊峰，沙 爽，楊 榮，常 慶△

(1.上海健康醫(yī)學(xué)院附屬嘉定區(qū)中心醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，上海 201800； 2.上海健康醫(yī)學(xué)院分子影像中心，上海 201318；3.上海健康醫(yī)學(xué)院附屬嘉定區(qū)中心醫(yī)院病理科，上海 201800)

甲狀腺癌是人類常見的內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤，近年來世界范圍內(nèi)其發(fā)病率上升趨勢明顯[1]。在我國，甲狀腺癌的發(fā)病率同樣處于上升趨勢，部分地區(qū)近十年增長了近10倍，是目前發(fā)病率上升最快的實(shí)體惡性腫瘤之一[2]。甲狀腺癌的病理分型包括甲狀腺乳頭狀癌(PTC)、甲狀腺濾泡狀腺癌(FTC)、甲狀腺未分化癌(ATC)及甲狀腺髓樣癌(MTC)。PTC和FTC屬于分化的甲狀腺癌，占全部甲狀腺癌的90%。BARF基因位于7q34，其最常見的突變位點(diǎn)為第15號外顯子的密碼子600，在胸腺嘧啶轉(zhuǎn)化為腺苷酸過程中，該突變基因在氨基酸水平上由纈氨酸取代谷氨酸，該位點(diǎn)突變被定義為BRAF V600E[3-5]。BRAF存在30個以上不同的基因突變，但V600E約占90%。研究發(fā)現(xiàn)，BRAF V600E基因突變是PTC最常見的基因突變，突變陽性率為29%～83%，平均為45%，與經(jīng)典型 PTC(乳頭結(jié)構(gòu)和核型改變，核分裂象罕見，沙礫樣鈣化常見)的預(yù)后差直接相關(guān)[6-7]。因此，該突變可作為診斷和判斷預(yù)后的分子生物學(xué)標(biāo)志及治療PTC的靶基因。BRAF V600E基因突變與甲狀腺癌的關(guān)系已成為目前研究的熱點(diǎn)[8-9]。

目前BRAF V600E基因突變檢測的方法有很多，且各有優(yōu)缺點(diǎn)。本文采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)-熒光探針法、微滴式數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)(ddPCR)法、MassARRAY核酸質(zhì)譜法和Sanger測序法，分析2013年收集的35例PTC患者石蠟標(biāo)本(已知新鮮組織2013年用PCR-熒光探針法檢測BRAF V600E基因突變?nèi)栃?BRAF V600E基因突變檢測結(jié)果，為醫(yī)院針對既往保存的石蠟標(biāo)本中BRAF V600E基因突變選擇合適的檢測方法提供參考和依據(jù)。

1 資料與方法

1.1標(biāo)本來源 35例PTC石蠟包埋組織標(biāo)本取自上海健康醫(yī)學(xué)院附屬嘉定區(qū)中心醫(yī)院病理科，患者于2013年在該院確診并手術(shù)取出PTC組織后包埋成蠟塊存檔。35例PTC患者的新鮮組織于2013年進(jìn)行PCR-熒光探針法檢測BRAF V600E基因突變，突變陽性率為100%(35/35)。35例標(biāo)本依次編號為1～35，所有標(biāo)本均經(jīng)10%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，組織切片后經(jīng)病理醫(yī)師復(fù)閱切片明確診斷，并評估腫瘤細(xì)胞含量。

1.2方法

1.2.1DNA提取 常規(guī)消毒所用物品，20 μm連續(xù)切片4～6張，參照35例PTC石蠟包埋組織標(biāo)本的HE染色切片，分別選擇腫瘤細(xì)胞豐富的區(qū)域進(jìn)行刮取，盡量避開非腫瘤區(qū)、壞死區(qū)。使用QIAGEN DNA FFPE Tissue Kit，按照說明書步驟提取基因組DNA，經(jīng)Thermo Fisher?NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)測定DNA純度及水平，其中A260/A280要求在1.8～2.1。

1.2.2PCR-熒光探針法 使用武漢友芝友公司生產(chǎn)的人類BRAF V600E基因突變檢測試劑盒，于Roche?LightCycler480實(shí)時熒光定量PCR儀上檢測BRAF V600E的突變情況，具體操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。最后根據(jù)擴(kuò)增曲線劃定合適的熒光閾值，得到組織標(biāo)本的Ct值并計(jì)算相關(guān)ΔCt值。突變檢測Ct值≥38或無Ct值，則該標(biāo)本為突變陰性；突變檢測Ct值<38，ΔCt值<9，則該標(biāo)本為突變陽性；突變檢測Ct值<38，ΔCt值≥9，則該標(biāo)本為突變陰性。

1.2.3ddPCR法 使用PrimePCRTMddPCRTMBRAF V600E突變檢測試劑盒于QX?200 Bio-Rad微滴式數(shù)字PCR儀上檢測PTC石蠟標(biāo)本BRAF V600E基因突變情況，具體操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。最后由Quanta Soft完成對數(shù)據(jù)的自動處理，獲得靶序列在PCR反應(yīng)體系中的拷貝數(shù)水平(單位：copy/μL)，通過野生型拷貝數(shù)和突變型拷貝數(shù)計(jì)算突變比例。突變比例>0為突變陽性。

1.2.4MassARRAY核酸質(zhì)譜法 整個檢測過程分為兩個階段進(jìn)行。首先設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物，V600E-F：5′-ACG TTG GAT GTT CAA ACT GAT GGG ACC CAC-3′;V600E-R：5′-ACG TTG GAT GTC TTC ATG AAG ACC TCA CAG-3′，富集含BRAF基因15號外顯子的PCR片段。然后針對突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異的探針引物，Unextension primer(UEP)：5′-GAT TTT GGT CTA GCT ACA G-3′，于Agena?MALDI-TOF MassARRAY質(zhì)譜儀上通過單堿基延伸試驗(yàn)獲得突變/野生型位點(diǎn)基因片段混合產(chǎn)物，最后通過質(zhì)譜分離這些差異片段，實(shí)現(xiàn)BRAF V600E基因突變檢測。質(zhì)譜圖中有突變峰為突變陽性。

1.2.5Sanger測序法 使用下列引物擴(kuò)增BRAF基因第15號外顯子。V600P5：5′-AGC ATC TCA CCT CAT CCT AAC ACA-3′;V600P3：5′-CTA GTA ACT CAG CAG CAT CTC AGG-3′。PCR反應(yīng)體系為30.0 μL：模板DNA 2.0 μL，引物P5/P3(10 μmol/L)各0.5 μL，雙蒸水27.0 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。利用核酸外切酶和熱敏磷酸酶純化PCR產(chǎn)物，將純化的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序反應(yīng)，測序產(chǎn)物經(jīng)純化后在ABI 3500XL基因分析儀上進(jìn)行基因測序。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用GraphPad Prism v5.0軟件和SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理和分析，計(jì)數(shù)資料以率或例數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1石蠟標(biāo)本提取DNA的純度與水平檢測結(jié)果 35例PTC石蠟標(biāo)本提取基因組DNA，其純度和水平檢測結(jié)果見圖1。其中標(biāo)本7、8的A260/A280分別為2.45和2.14，純度不符合要求。其余標(biāo)本的A260/A280為1.8～2.1，水平均大于10 ng/μL，符合后續(xù)試驗(yàn)要求。

注：A為提取的基因組DNA純度，n=35；B為提取的基因組DNA水平，n=35。圖1 石蠟標(biāo)本提取的基因組DNA的純度與水平

2.2PCR-熒光探針法檢測結(jié)果 35例PTC石蠟標(biāo)本中，PCR-熒光探針法檢測BRAF V600E基因突變陽性率為80.0%(28/35)。其中標(biāo)本7、20、23、24、30無擴(kuò)增曲線，沒有Ct值，檢測突變結(jié)果為陰性；標(biāo)本6、8的Ct值<38，ΔCt值≥9，檢測突變結(jié)果為陰性；其余標(biāo)本的Ct值<38，ΔCt值<9，檢測突變結(jié)果為陽性。見圖2。

注：結(jié)果為根據(jù)擴(kuò)增曲線和熒光閾值計(jì)算得到的各標(biāo)本ΔCt值。圖2 PCR-熒光探針法檢測BRAF V600E基因突變結(jié)果

2.3ddPCR法檢測結(jié)果 35例PTC石蠟標(biāo)本中，ddPCR法檢測BRAF V600E基因突變陽性率為94.3%(33/35)。其中標(biāo)本7、8的突變比例為0，檢測突變結(jié)果為陰性；其余標(biāo)本的突變比例為0.014%～38.00%，突變結(jié)果檢測均為陽性。ddPCR法檢測BRAF V600E基因突變比例見圖3。

2.4MassARRAY核酸質(zhì)譜法檢測結(jié)果 35例PTC石蠟標(biāo)本中，MassARRAY核酸質(zhì)譜法檢測BRAF V600E基因突變陽性率為74.3%(26/35)。檢測結(jié)果中，標(biāo)本6、7、8、9、11、18、26、30、35的質(zhì)譜圖中無突變峰，為突變檢測陰性；其余標(biāo)本的質(zhì)譜圖中有突變峰，為突變檢測陽性。見圖4。

2.5Sanger測序法檢測結(jié)果 35例PTC石蠟標(biāo)本中，Sanger測序法檢測BRAF V600E基因突變陽性率為60.0%(21/35)。其中標(biāo)本1、2、7、8、9、11、14、23、24、26、30、31、34、35的測序結(jié)果呈陰性，其余標(biāo)本的測序結(jié)果呈陽性。見圖5。

注：根據(jù)BRAF V600E基因突變圖譜計(jì)算得到的各標(biāo)本的突變比例。圖3 ddPCR法檢測BRAF V600E基因突變結(jié)果

注：A提示質(zhì)譜圖中Mass 6 100處有突變峰(用箭頭標(biāo)出)，顯示BRAF V600E密碼子突變陽性；B提示質(zhì)譜圖中Mass 6 100處無突變峰，顯示BRAF V600E密碼子突變陰性。圖4 MassARRAY核酸質(zhì)譜法檢測BRAF V600E基因突變

2.6BRAF V600E基因突變檢測方法的比較 通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在4種檢測方法中，ddPCR法檢測既往收集的PTC石蠟標(biāo)本BRAF V600E基因突變的靈敏度最佳。將其與另外3種檢測方法比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P分別為0.047、0.031、0.015)。

注：A提示測序圖譜中密碼子600的T處有突變峰(用箭頭標(biāo)出)，顯示BRAF V600E密碼子突變陽性；B提示測序圖譜中密碼子600的T處無突變峰，顯示BRAF V600E密碼子突變陰性。圖5 Sanger測序法檢測BRAF基因第15號外顯子突變

3 討 論

各醫(yī)院病理科保存有大量患者腫瘤組織的石蠟標(biāo)本。石蠟標(biāo)本經(jīng)過固定劑、脫水劑、包埋劑等有機(jī)溶劑作用后，其基因組DNA受到一定程度的破壞，發(fā)生降解，使得DNA的純度與水平均降低[10]。因此，與新鮮組織相比，檢測PTC石蠟標(biāo)本中的BRAF V600E基因突變的難度增大，本研究即證實(shí)了這一觀點(diǎn)(與新鮮組織相比，各檢測方法的突變陽性率均未達(dá)100%)。故需要尋找靈敏度更高的方法用于PTC石蠟標(biāo)本中BRAF V600E基因突變的檢測。

以往研究中對BRAF基因突變的檢測方法主要有免疫組織化學(xué)法、限制性片段長度-多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(PCR-RFLP)、高分辨率熔解曲線法、測序技術(shù)以及實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)(qPCR)等[11]。由于檢測方法不同，PTC組織中BRAF V600E基因突變陽性率存在較大差異。國內(nèi)甲狀腺癌BRAF V600E基因突變檢測方法較多，檢測的標(biāo)本類型眾多，檢測的靈敏度、特異度差異較大，因而檢測結(jié)果相距甚遠(yuǎn)。因此，通過試驗(yàn)選出靈敏度高的檢測方法，可以為醫(yī)院后期臨床檢測項(xiàng)目的選擇提供理論依據(jù)，為患者用藥提供指導(dǎo)。

Sanger測序法作為“金標(biāo)準(zhǔn)”，可得到序列的直接信息，對未知突變的檢出具有優(yōu)勢，是直接、有效的檢測基因突變的方法，但該法檢測基因突變的靈敏度較低，試驗(yàn)操作時間長、步驟復(fù)雜、易產(chǎn)生污染[12]。MassARRAY核酸質(zhì)譜法具有較高的特異度和靈敏度，可以在一個平臺上實(shí)現(xiàn)SNP基因分型、基因表達(dá)檢測、基因甲基化分析、病原體分型和進(jìn)行產(chǎn)前診斷的研究。但對于檢測一個位點(diǎn)的突變，其需要設(shè)計(jì)兩次引物進(jìn)行擴(kuò)增，步驟較為煩瑣[13]。以PCR-熒光探針法為平臺的突變檢測技術(shù)，均需根據(jù)已知的突變類型設(shè)計(jì)引物、探針，因此無法檢測出所有可能的突變，但靈敏度較Sanger測序法高，操作簡單，無須對PCR產(chǎn)物進(jìn)行操作，在很大程度上避免了擴(kuò)增產(chǎn)物的污染[14]。ddPCR法作為核酸定量的新技術(shù)，與此前的核酸定量方法相比，該方法的靈敏度、準(zhǔn)確度更高。其與qPCR最主要的區(qū)別在于計(jì)算核酸拷貝數(shù)方法不同，ddPCR法采用了新的定量策略和試驗(yàn)思路，可以對核酸的拷貝數(shù)進(jìn)行絕對定量，相對于qPCR，不需要建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，具有更廣闊的應(yīng)用前景[15]。

本試驗(yàn)采用Sanger測序法檢測BRAF基因第15號外顯子突變，檢測到的突變類型均為V600E突變型，未見其他少見的突變類型。本試驗(yàn)中采用靈敏度最高的ddPCR法檢測35例2013年收集的PTC石蠟標(biāo)本BRAF V600E基因突變(已知新鮮組織2013年用PCR-熒光探針法檢測BRAF V600E基因突變?nèi)栃?，突變陽性率為94.3%(33/35)。其中標(biāo)本7、8用4種方法檢測均呈陰性，可能與其純度不高有關(guān)。ddPCR法無須檢測者分析結(jié)果，其結(jié)果直接由檢測系統(tǒng)顯示，從而大大降低了人為因素對結(jié)果的影響。

4 結(jié) 論

綜上所述，ddPCR法檢測靈敏度較高，對標(biāo)本中DNA的純度和水平要求較低，適用于儲存年份較久的PTC石蠟標(biāo)本BRAF V600E基因突變檢測，可為PTC的診斷及預(yù)后判斷提供依據(jù)。