吳思穎，康 梅，劉 雅，肖玉玲，何 超，謝 軼，馬 瑩

(四川大學(xué)華西醫(yī)院實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)科，四川成都 610041)

隱球菌腦膜炎是由隱球菌引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染，主要累及免疫功能受損人群，如人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV)感染者和器官移植患者，也可引起免疫功能正常者的感染。中樞神經(jīng)系統(tǒng)隱球菌病預(yù)后較差，病死率高，即使經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的抗真菌治療，病死率仍可高達(dá)60%[1]。因此早期診斷和治療尤為重要。常見(jiàn)的致病隱球菌主要包括新生隱球菌和格特隱球菌，主要包括8種基因型：新生隱球菌基因型VNⅠ～Ⅳ，格特隱球菌基因型VGⅠ～Ⅳ[2]。隱球菌的傳統(tǒng)鑒定方法主要依靠生化試驗(yàn)，但是該方法耗時(shí)長(zhǎng)，缺乏及時(shí)性。分子生物學(xué)鑒定和分型方法成本較高且操作復(fù)雜，不適用于實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢測(cè)。基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)是分析非揮發(fā)性生物大分子的一種新型軟電離質(zhì)譜技術(shù)，可用于病原微生物的鑒定[3]。由于其具有快速、靈敏、準(zhǔn)確、高通量及自動(dòng)化等特點(diǎn)，MALDI-TOF MS已成為微生物鑒定領(lǐng)域非常重要的技術(shù)工具和手段。本研究應(yīng)用MALDI-TOF MS對(duì)常見(jiàn)的致病隱球菌進(jìn)行快速鑒定并進(jìn)一步對(duì)隱球菌不同基因型進(jìn)行聚類(lèi)分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2017年6月至2019年11月本院各科室分離的44株隱球菌臨床株。

1.2儀器與試劑 MALDI-TOF MS(Bruker Daltonik GmbH，德國(guó))，API 20C(bioMérieux，法國(guó))，PCR擴(kuò)增儀(ABI，美國(guó))，限制性?xún)?nèi)切酶Sau96Ⅰ、HhaⅠ(New England Biolabs，美國(guó))，Gel Doc XR 凝膠成像系統(tǒng)(BIO-RAD，美國(guó))。沙氏瓊脂平板(鄭州安圖)，α-氰基-4-羥基肉桂酸(HCCA，Bruker Daltonik GmbH，德國(guó))，無(wú)水乙醇(成都科龍)，三氟乙酸(MERCK公司，德國(guó))，乙腈(Tedia公司，美國(guó))，甲酸(Anaqua Chemicals Supply，美國(guó))。

1.3方法

1.3.1隱球菌基因分型 利用URA5基因PCR產(chǎn)物限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(URA5-RFLP)方法對(duì)44株隱球菌臨床株進(jìn)行基因分型。PCR擴(kuò)增引物：URA5(5′-ATG TCC TCC CAA GCC CTC GAC TCC G-3′)，SJ01(5′-TTA AGA CCT CTG AAC ACC GTA CTC-3′)。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性2 min,94 ℃變性45 s,61 ℃退火1 min,72 ℃延伸2 min,35個(gè)循環(huán),最后72 ℃延伸10 min。使用Sau96Ⅰ(10 U/μL)和HhaⅠ(20 U/μL)這兩種限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切。將酶切體系于37 ℃水浴3 h,得到酶切產(chǎn)物。將臨床株和標(biāo)準(zhǔn)菌株的酶切產(chǎn)物10 μL于2%的瓊脂糖凝膠中100 V電泳2.5 h, 以DL2000作為分子量標(biāo)記物，在Gel Doc XR凝膠成像系統(tǒng)中觀(guān)察電泳結(jié)果，比較隱球菌臨床株與8株不同基因型標(biāo)準(zhǔn)菌株的酶切譜型，得出隱球菌臨床株的基因型。隱球菌基因分型標(biāo)準(zhǔn)菌株如下：WM148(VNⅠ),WM626(VNⅡ),WM628(VNⅢ),WM629(VNⅣ),WM179(VGⅠ),WM178(VGⅡ),WM161(VGⅢ)和WM779(VGⅣ)。

1.3.2MALDI-TOF MS鑒定 MALDI-TOF MS系統(tǒng)采用線(xiàn)性正性模式，采集相對(duì)分子質(zhì)量為(2～20)×103的圖譜。采用甲酸提取法，取待測(cè)菌株，加入300 μL水、900 μL乙醇，混勻，加入30 μL 70%甲酸溶液，混勻后再加入30 μL乙腈混勻，離心取1 μL上清液在MALDI靶板上點(diǎn)樣，晾干后添加1 μL HCCA，晾干。每個(gè)樣本置于靶板上的6個(gè)不同位點(diǎn)，即每個(gè)樣本生成6個(gè)合成的圖譜(MSP)。將待鑒定隱球菌的質(zhì)譜數(shù)據(jù)與數(shù)據(jù)庫(kù)中參考菌株的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)匹配程度得到相應(yīng)分值，最終得到鑒定結(jié)果。得分≥2.0表示鑒定到種水平，1.7～<2.0表示鑒定到屬水平，<1.7表示不可信的鑒定結(jié)果。

1.3.3聚類(lèi)分析 使用MALDI Biotype軟件對(duì)44株隱球菌臨床株和8株基因分型標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行聚類(lèi)分析，構(gòu)建MSP聚類(lèi)分析樹(shù)狀圖。

2 結(jié) 果

2.1隱球菌基因分型結(jié)果 44株隱球菌臨床株URA5-RFLP分型結(jié)果顯示，42株為新生隱球菌VNⅠ型，1株為格特隱球菌VGⅠ型，1株為格特隱球菌VGⅡ型。隱球菌基因分型結(jié)果見(jiàn)圖1。

注：A和B為隱球菌基因分型標(biāo)準(zhǔn)菌株和部分臨床株酶切產(chǎn)物電泳圖；圖A中10為格特隱球菌VGⅠ型(臨床株)，9為新生隱球菌VNⅠ型(臨床株)；圖B中10為格特隱球菌VGⅡ型(臨床株)，9為新生隱球菌VNⅠ型(臨床株)；M為標(biāo)記物；1～4分別為新生隱球菌基因型標(biāo)準(zhǔn)菌株WM148(VNⅠ)、WM626(VNⅡ)、WM628(VNⅢ)、WM629(VNⅣ)；5～8分別為格特隱球菌基因型標(biāo)準(zhǔn)菌株WM179(VGⅠ)、WM178(VGⅡ)、WM161(VGⅢ)、WM779(VGⅣ)。圖1 隱球菌基因分型標(biāo)準(zhǔn)菌株和部分臨床株URA5-RFLP分型結(jié)果

2.2MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果 MALDI-TOF MS對(duì)隱球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和臨床株的鑒定結(jié)果與分子生物學(xué)鑒定結(jié)果完全一致。42株隱球菌臨床株鑒定為新生隱球菌，另外2株鑒定為格特隱球菌，鑒定結(jié)果得分為1.975～2.346分。標(biāo)準(zhǔn)菌株的鑒定得分如下，WM148:2.109分；WM626:2.059分；WM628:2.134分；WM629:2.045分；WM179:2.041分；WM178:2.210分；WM161:2.051分；WM779:1.969。

2.3新生隱球菌和格特隱球菌以及不同基因型之間質(zhì)譜圖的特點(diǎn) 新生隱球菌和格特隱球菌之間，以及新生隱球菌和格特隱球菌不同基因型之間，特征蛋白的質(zhì)量和峰的信號(hào)強(qiáng)度存在差異。新生隱球菌VNⅡ型標(biāo)準(zhǔn)菌株WM626在8 000～1 000 m/z有2個(gè)明顯的質(zhì)譜峰，而新生隱球菌其他基因型卻不明顯。格特隱球菌VGⅠ型標(biāo)準(zhǔn)菌株WM179在5 000～6 000 m/z有1個(gè)明顯的質(zhì)譜峰。所有新生隱球菌臨床株的質(zhì)譜圖與VNⅠ型標(biāo)準(zhǔn)菌株WM148更接近。格特隱球菌VGⅠ型臨床株(F14)的質(zhì)譜圖與VGⅠ型標(biāo)準(zhǔn)菌株WM179更相似。格特隱球菌VGⅡ型臨床株(F44)的質(zhì)譜圖與VGⅡ型標(biāo)準(zhǔn)菌株WM178更接近。

2.4聚類(lèi)分析 對(duì)所有隱球菌臨床株和基因分型標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行聚類(lèi)分析，得到MSP聚類(lèi)分析樹(shù)狀圖。從圖中可以看到，新生隱球菌和格特隱球菌分別位于兩個(gè)不同的集群，且新生隱球菌和格特隱球菌不同基因型被區(qū)分開(kāi)。絕大多數(shù)新生隱球菌VNⅠ型臨床株與VNⅠ型標(biāo)準(zhǔn)菌株WM148位于同一集群，格特隱球菌VGⅠ型和VGⅡ型臨床株分別與VGⅠ型標(biāo)準(zhǔn)菌株WM179和VGⅡ型標(biāo)準(zhǔn)菌株WM178位于同一集群。見(jiàn)圖2。

圖2 44株隱球菌臨床株和8株基因分型標(biāo)準(zhǔn)菌株MSP聚類(lèi)分析樹(shù)狀圖

3 討 論

臨床實(shí)驗(yàn)室中隱球菌的傳統(tǒng)鑒定方法主要依靠生化試驗(yàn)和形態(tài)學(xué)檢查，但均不能區(qū)分新生隱球菌和格特隱球菌，而兩者所致感染在臨床表現(xiàn)、體外藥敏試驗(yàn)和治療預(yù)后等方面均存在明顯差異[4]。分子生物學(xué)分型方法如限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)和多位點(diǎn)或全基因組序列分析等，由于價(jià)格昂貴，操作較煩瑣，往往局限在參考實(shí)驗(yàn)室，目前未在臨床常規(guī)使用[5]。MALDI-TOF MS具有經(jīng)濟(jì)、操作簡(jiǎn)單的特點(diǎn)，可快速為臨床提供檢測(cè)結(jié)果，使患者得到即時(shí)的治療。本研究應(yīng)用MALDI-TOF MS對(duì)隱球菌臨床株和標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行快速鑒定，結(jié)果顯示44株隱球菌臨床株和8株基因分型標(biāo)準(zhǔn)菌株的鑒定結(jié)果與分子生物學(xué)鑒定結(jié)果一致，可準(zhǔn)確區(qū)分新生隱球菌和格特隱球菌。劉濤華等[6]對(duì)20株隱球菌的研究發(fā)現(xiàn)，MALDI-TOF MS可作為隱球菌屬分類(lèi)鑒別中有效的輔助手段，相比于多位點(diǎn)序列分析技術(shù)，MALDI-TOF MS更為快捷。ZHANG等[7]研究發(fā)現(xiàn)，MALDI-TOF MS對(duì)新生隱球菌的鑒定具有100%的準(zhǔn)確性，但唯一1株格特隱球菌被錯(cuò)誤鑒定為新生隱球菌。由于國(guó)內(nèi)的隱球菌感染主要以新生隱球菌為主，格特隱球菌屬于散發(fā)病例，因此還需收集更多的格特隱球菌以評(píng)價(jià)MALDI-TOF MS對(duì)格特隱球菌的鑒定能力。黃聲雷等[8]對(duì)兩種MALDI-TOF MS系統(tǒng)進(jìn)行了評(píng)價(jià)，對(duì)于常見(jiàn)的非白色念珠菌，Autoflex MALDI-TOF MS系統(tǒng)鑒定準(zhǔn)確性?xún)?yōu)于Vitek MALDI-TOF MS系統(tǒng)。對(duì)于隱球菌的鑒定，Autoflex MALDI-TOF MS系統(tǒng)是否優(yōu)于Vitek MALDI-TOF MS系統(tǒng)，尚需進(jìn)一步研究。

MALDI-TOF MS不僅能用于病原微生物的鑒定，而且還具有分型能力，可進(jìn)一步應(yīng)用于病原微生物的分型。例如MALDI-TOF MS應(yīng)用于弗勞地枸櫞酸桿菌和黏質(zhì)沙雷菌的分型，其結(jié)果與全基因組序列分析具有較好的一致性[9]。基于MALDI-TOF MS的聚類(lèi)分析可對(duì)哈維弧菌進(jìn)行溯源性分析[10]。MALDI-TOF MS也可用于真菌的分型。CHAO等[11]利用MALDI-TOF MS聚類(lèi)分析可區(qū)分皺褶假絲酵母菌復(fù)合體中的發(fā)酵假絲酵母菌和季也蒙假絲酵母菌。FIRACATIVE等[12]研究發(fā)現(xiàn)，新生隱球菌和格特隱球菌不同基因型之間的質(zhì)譜峰圖存在差異，聚類(lèi)分析發(fā)現(xiàn)新生隱球菌與格特隱球菌不同基因型分別位于不同的集群，相同基因型則位于同一集群。POSTERARO等[13]運(yùn)用MALDI-TOF MS對(duì)82株隱球菌(72株新生隱球菌、10株格特隱球菌)進(jìn)行聚類(lèi)分析，其中81株(98.8%)被準(zhǔn)確歸于相應(yīng)的基因型，僅1株VGⅡ型格特隱球菌被錯(cuò)誤地歸于VGⅠ集群。SIQUEIRA等[14]納入隱球菌不同基因型建立數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)一步評(píng)估該數(shù)據(jù)庫(kù)用于區(qū)分新生隱球菌和格特隱球菌不同基因型的能力，結(jié)果顯示該數(shù)據(jù)庫(kù)可對(duì)所有新生隱球菌和格特隱球菌基因型進(jìn)行正確鑒定。本研究中隱球菌臨床株和不同基因型的標(biāo)準(zhǔn)菌株聚類(lèi)分析發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)VNⅠ型臨床株與VNⅠ型標(biāo)準(zhǔn)菌株位于同一集群，僅少數(shù)VNⅠ型臨床株位于另一集群。推測(cè)基于MALDI-TOF MS的聚類(lèi)分析可能會(huì)受到樣品蛋白制備以及菌株蛋白表達(dá)量的影響。在進(jìn)行分型或亞種水平鑒定時(shí)，需要識(shí)別更多的具有重現(xiàn)性的質(zhì)譜峰，需要設(shè)置更多的平行組。此外，對(duì)未知病原菌的分型鑒定必須要有足夠多的已知菌株的數(shù)據(jù)庫(kù)，方可實(shí)現(xiàn)最佳匹配，提高其鑒定分型能力[15]。本研究中44株經(jīng)過(guò)分子生物學(xué)確認(rèn)基因型的隱球菌已經(jīng)全部納入數(shù)據(jù)庫(kù)中。由于本研究中所有新生隱球菌臨床株均為VNⅠ型，且只有2株格特隱球菌，應(yīng)該納入更多隱球菌基因型以評(píng)價(jià)MALDI-TOF MS對(duì)隱球菌的分型能力。

4 結(jié) 論

綜上所述，MALDI-TOF MS作為一種快速的鑒定方法可以準(zhǔn)確區(qū)分新生隱球菌和格特隱球菌，且可作為一種潛在的分型方法對(duì)新生隱球菌和格特隱球菌不同基因型進(jìn)行區(qū)分。