艾曉莉，林佳麗，劉達(dá)玉，顏 軍*，何 楠，郭添榮，3

（1.成都大學(xué) 四川抗菌素工業(yè)研究所，四川 成都 610052；2.四川省食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院，四川 成都 611731；3.成都市食品藥品檢驗(yàn)研究院，四川 成都 610000）

米酒具有口味酸甜和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高的特點(diǎn)[1-2]，米酒中某些維生素和礦物質(zhì)含量堪比葡萄酒，并含有酚類物質(zhì)和活性肽等活性成分[3]，米酒的酒精度一般在3%vol～14%vol之間[4]。隨著消費(fèi)者健康意識(shí)的增加，低醇飲品發(fā)展迅速，如低醇的葡萄酒和低醇啤酒占有越來越大的市場(chǎng)份額。我國(guó)目前并沒有低醇飲品的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，研究表明，低醇飲品的酒精度一般在0.5%vol～1.0%vol[5]，并且更加符合消費(fèi)者的健康觀[6-7]。因此，在保證風(fēng)味成分與口感無影響時(shí)，酒精度越低的米酒，其市場(chǎng)前景將會(huì)更廣闊。復(fù)合型米酒利用不同原料之間的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)與風(fēng)味物質(zhì)互補(bǔ)的優(yōu)勢(shì)，提升單一性原料的食用價(jià)值。目前，復(fù)合型米酒的研究熱點(diǎn)主要為蔬菜水果類[8-10]，糧食類[11-12]，保健類[13-14]。由于原料或者發(fā)酵工藝的影響，導(dǎo)致這三類米酒的酒精含量很難＜1.0%。并且，蔬菜水果類米酒由于其不耐高溫的性質(zhì)，發(fā)酵工藝較為繁瑣。本實(shí)驗(yàn)以富含人體必需氨基酸、礦物質(zhì)、維生素、活性物質(zhì)、花色苷[15-18]等成分的黑糯米、血糯米、黑糯玉米為原料研制低醇復(fù)合米酒，將單因素試驗(yàn)與響應(yīng)面法相結(jié)合，探究物料比、酒曲添加量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間對(duì)低醇復(fù)合米酒發(fā)酵工藝的影響。彌補(bǔ)了普通米酒營(yíng)養(yǎng)和風(fēng)味物質(zhì)單一、酒精度高的缺陷，且滿足現(xiàn)代人對(duì)酒類產(chǎn)品健康營(yíng)養(yǎng)與高感官品質(zhì)的雙向需求。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑糯米、血糯米：貴州黔南；黑糯玉米（脫皮脫胚）：山東菏澤；甜酒曲：廣東順德尚川生物科技有限公司；葡萄糖（純度99.6%）：中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院；麥芽糖：上海起發(fā)實(shí)驗(yàn)試劑有限公司；氫氧化鈉、氯化鉀、乙酸鈉、乙醇（均為分析純）：天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；硫酸、鹽酸（均為分析純）：成都市科隆化學(xué)品有限公司；苯酚（分析純）：天津市永大化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

800Y型粉碎機(jī)：永康市鉑歐五金制品有限公司；LRH-250型生化培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；JYL-C19V型料理機(jī)：九陽(yáng)股份有限公司；Scientific Sorvall ST16R離心機(jī)：美國(guó)賽默飛世爾科技公司；ME204電子天平：瑞士梅特勒-托利多公司；DMA 4100M全自動(dòng)酒精分析儀：奧地利安東帕公司；Lambda 35紫外可見分光光度計(jì)：美國(guó)鉑金埃爾默公司；855型自動(dòng)電位滴定儀：瑞士萬(wàn)通公司；1260型液相色譜儀（配示差折光檢測(cè)器）：美國(guó)安捷倫公司；HH-2型恒溫水浴鍋：上海力辰邦西儀器科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 低醇復(fù)合米酒工藝流程及操作要點(diǎn)

操作要點(diǎn)：

黑糯玉米粒的制備：選擇脫皮脫胚的黑糯玉米，經(jīng)粉碎機(jī)打碎，過10目篩，收集黑糯玉米粒。

浸泡：選擇無異味、無霉變的黑糯米、血糯米和過10目篩的黑糯玉米粒，用水充分洗2次，加入常溫自來水，浸泡24 h后瀝干。

蒸熟、冷卻：將瀝干后的谷物置于沸水蒸鍋蒸30 min，蒸熟的谷物應(yīng)是皮硬內(nèi)軟、松散不糊、米粒內(nèi)無粉質(zhì)白心；為了避免花色苷與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的流失，選擇將蒸好后的谷物倒入干凈滅菌容器中攤涼的方法，冷卻至約30 ℃。

酒曲活化：按比例稱量（精確到0.000 1g）甜酒曲，倒入已滅菌冷卻的容器中，以料水比2∶1（g∶mL）加入燒沸冷卻后的溫水（約30 ℃）活化30 min。

拌曲、罐裝：將攤涼后的物料中倒入活化好的甜酒曲中，攪拌后的谷物與酒曲應(yīng)是分布均勻，谷物吸水后不會(huì)糊在一起；將混勻后的谷物置于已滅菌的大肚米酒罐，用已滅菌勺子和筷子輕輕壓平谷物表面，并在中間戳一個(gè)直徑約為1 cm的洞，保鮮膜加蓋密封。

發(fā)酵：將罐裝好的谷物放入生化培養(yǎng)箱，28 ℃恒溫發(fā)酵48 h。

殺菌：巴氏殺菌（60 ℃、20 min）[19]冷卻后即得成品。

1.3.2 發(fā)酵工藝優(yōu)化

（1）單因素試驗(yàn)

參照1.3.1的工藝流程和操作要點(diǎn)，分別對(duì)混合物料（黑糯米∶血糯米∶黑糯玉米）質(zhì)量比（1∶1∶1、2∶1∶1、2∶2∶1、1∶2∶2）、酒曲添加量（0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%）、發(fā)酵溫度（26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃）、發(fā)酵時(shí)間（36 h、42 h、48 h、54 h、60 h）進(jìn)行發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)考察，以酒精度、總酸（以乳酸計(jì)）、總糖（以葡萄糖計(jì)）、還原糖、感官評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，研究各因素對(duì)低醇復(fù)合米酒品質(zhì)的影響。

（2）響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，利用Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以玉米添加量（A），酒曲添加量（B），發(fā)酵溫度（C）及發(fā)酵時(shí)間（D）為影響因素，低醇復(fù)合米酒感官評(píng)分（Y）為響應(yīng)值，采用4因素3水平的響應(yīng)面分析法設(shè)計(jì)試驗(yàn)，Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 低醇復(fù)合米酒發(fā)酵工藝優(yōu)化Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken tests design for fermentation process optimization of low-alcohol compound rice wine

1.3.3 低醇復(fù)合米酒品質(zhì)分析

低醇復(fù)合米酒酒精度含量的測(cè)定參考國(guó)標(biāo)GB5009.225—2016《酒中乙醇濃度的測(cè)定》密度計(jì)法；總酸含量測(cè)定參考國(guó)標(biāo)GB12456—2008《食品中總酸的測(cè)定》pH電位法；總糖[20]含量測(cè)定參考苯酚-硫酸顯色法；還原糖含量測(cè)定參考國(guó)標(biāo)GB 5009.8—2016《食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖的測(cè)定》中的高效液相色譜法；總花色苷含量測(cè)定：采用體積分?jǐn)?shù)為60%乙醇（含有0.1%HCl）超聲提取，參考梁振等[21]pH示差法。

感官評(píng)分：感官品評(píng)人員從滋味、香氣、外觀和風(fēng)格4個(gè)方面對(duì)低醇復(fù)合米酒進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，對(duì)各項(xiàng)目進(jìn)行打分，取平均值作為產(chǎn)品的綜合分?jǐn)?shù)，滿分100分。參考地方標(biāo)準(zhǔn)DBS61/0004—2018《洋縣黑米酒》和DB52/T935—2014《惠水黑糯米酒》的感官要求，建立低醇復(fù)合米酒感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 低醇復(fù)合米酒感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standards of low-alcohol compound rice wine

續(xù)表

2 結(jié)果與分析

2.1 低醇復(fù)合米酒發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.1.1 不同物料比對(duì)低醇復(fù)合米酒品質(zhì)的影響

圖1 不同物料比對(duì)低醇復(fù)合米酒理化（A）及感官（B）指標(biāo)的影響Fig.1 Effects of different material ratios on physicochemical (A) and sensory (B) indexes of low-alcohol compound rice wine

如圖1所示，不同物料比對(duì)4個(gè)理化指標(biāo)和感官評(píng)分均有影響，可能受不同糧食種類、吸水率和淀粉種類等的影響，物料（黑糯米∶血糯米∶黑糯玉米）質(zhì)量比為1∶2∶2和2∶2∶1酒精度相對(duì)高于物料（黑糯米∶血糯米∶黑糯玉米）質(zhì)量比2∶1∶2與1∶1∶1，但后者風(fēng)味不足；由于黑糯玉米經(jīng)過脫皮脫胚，花色苷損失較大，因此，黑糯玉米含量高的物料比，米酒感官評(píng)分相對(duì)偏低。在一定加量的范圍內(nèi)，不同的物料被糖化利用的程度不一樣[22]，物料（黑糯米∶血糯米∶黑糯玉米）質(zhì)量比為1∶1∶1和1∶2∶2分別存在總酸和還原糖偏高的現(xiàn)象，酸甜比例失調(diào)；物料（黑糯米∶血糯米∶黑糯玉米）質(zhì)量比2∶1∶2的總酸與還原糖均偏低，米酒的滋味與風(fēng)格均較差；物料（黑糯米∶血糯米∶黑糯玉米）質(zhì)量比2∶2∶1的還原糖、總酸含量相對(duì)較高，酸甜比例恰當(dāng)，色澤呈清亮的寶石紅，可能與物料色素在不同pH下顯色不同有關(guān)[23]。因此，最適物料（黑糯米∶血糯米∶黑糯玉米）質(zhì)量比為2∶2∶1。

2.1.2 不同酒曲添加量對(duì)低醇復(fù)合米酒品質(zhì)的影響

圖2 不同酒曲添加量對(duì)低醇復(fù)合米酒理化（A）及感官（B）指標(biāo)的影響Fig.2 Effects of different Jiuqu addition on physicochemical (A) and sensory (B) indexes of low-alcohol compound rice wine

如圖2所示，酒曲添加量為0.2%時(shí)，酵母菌所用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)少，酒精度和總酸含量低，這是因?yàn)榫魄腔煌耆?，淀粉含量高，還原糖含量低，酒體寡淡，甜度不夠；酒曲添加量為0.4%時(shí)，根霉生長(zhǎng)旺盛，淀粉轉(zhuǎn)化率達(dá)到最高值，還原糖、酒精度和總酸升高，此時(shí)米酒酸甜比例恰當(dāng)，具有香甜的麥芽糖風(fēng)味和醇類、酯類等揮發(fā)性香氣物質(zhì)；當(dāng)添加量持續(xù)增加，由于根霉含量的增加，微生物可用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)增加，酒精度升高，微生物自身生長(zhǎng)消耗太多的糖分，導(dǎo)致產(chǎn)品酸甜比例失調(diào)；酒曲添加量達(dá)到1.0%時(shí)，酒精度和總酸均達(dá)到最大值，還原糖降低，產(chǎn)品口味不佳，甚至有苦味產(chǎn)生。因此，最佳酒曲添加量為0.4%。

2.1.3 不同發(fā)酵溫度對(duì)低醇復(fù)合米酒品質(zhì)的影響

如圖3所示，發(fā)酵溫度為26 ℃時(shí)，可能因?yàn)榘l(fā)酵溫度過低，導(dǎo)致根霉生長(zhǎng)緩慢，酶活力降低，發(fā)酵不完全，淀粉轉(zhuǎn)化率低，還原糖含量低，酵母菌可用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)偏少或受溫度影響[24]，導(dǎo)致酒精度偏低，米酒偏酸。發(fā)酵溫度為28 ℃時(shí)，發(fā)酵罐中溫度恰當(dāng)，適合糖化酶分泌、還原糖積累和酵母菌的繁殖，酸甜適中，酒體豐富；溫度為30 ℃后，根霉自身生長(zhǎng)過于旺盛，抑制了酵母菌的生長(zhǎng)，導(dǎo)致糖酵解代謝受影響、酒體風(fēng)格欠佳；發(fā)酵溫度高于32 ℃之后，根霉快速繁殖，糖化酶活力升高，還原糖急劇升高，酒精度和酸度快速上升，但是在此高溫下，發(fā)酵出的米酒粗糙，并具有略微的刺鼻感和澀味，可能是由于酵母產(chǎn)生的雜醇油等副產(chǎn)物[25]。因此，最佳發(fā)酵溫度為28 ℃。

圖3 不同發(fā)酵溫度對(duì)低醇復(fù)合米酒理化（A）及感官（B）指標(biāo)的影響Fig.3 Effects of different fermentation temperature on physicochemical(A) and sensory (B) indexes of low-alcohol compound rice wine

2.1.4 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)低醇復(fù)合米酒品質(zhì)的影響

圖4 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)低醇復(fù)合米酒理化（A）及感官（B）指標(biāo)的影響Fig.4 Effects of different fermentation time on physicochemical (A)and sensory (B) indexes of low-alcohol compound rice wine

如圖4所示，發(fā)酵時(shí)間為36 h，米酒糖化時(shí)間不足，大量的根霉處在自身生長(zhǎng)階段，酵母菌可用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不足，未能及時(shí)進(jìn)行后酵過程，導(dǎo)致香氣物質(zhì)缺乏；發(fā)酵時(shí)間為42 h時(shí)，各指標(biāo)均呈正相關(guān)而持續(xù)增長(zhǎng)，由于酵母菌還未達(dá)到最活躍階段，產(chǎn)品酒體風(fēng)格尚有欠缺；發(fā)酵時(shí)間在48 h時(shí)，根霉持續(xù)生長(zhǎng)，總糖轉(zhuǎn)化率達(dá)到最高值，酵母、醋酸菌和乳酸菌等可利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)增多，酒體諧調(diào)，風(fēng)味飽滿；隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，酒精度持續(xù)升高，在60 h時(shí)，米酒的酒精度升高至1.49%vol，過高的酒精度不符合對(duì)產(chǎn)品低醇的追求。因此，最佳發(fā)酵時(shí)間48 h。

2.2 低醇復(fù)合米酒發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取合適的梯度進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。由于響應(yīng)面試驗(yàn)的比例必須呈連續(xù)性，同時(shí)血糯米的添加量在單因素試驗(yàn)中呈正效應(yīng)，因此，保持血糯米比值不變，將物料比由比值轉(zhuǎn)換為玉米添加量百分比（玉米含量/物料總含量×100%），考察玉米添加量對(duì)發(fā)酵工藝的影響。

2.2.1 發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，利用Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以玉米添加量（A），酒曲添加量（B），發(fā)酵溫度（C）及發(fā)酵時(shí)間（D）為影響因素，低醇復(fù)合米酒感官評(píng)分（Y）為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面分析法設(shè)計(jì)試驗(yàn)，Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果見表3。

續(xù)表

2.2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析

使用Design-Expert V8.6.0.1軟件對(duì)表3的數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表4。以玉米添加量（A）、酒曲添加量（B）、發(fā)酵溫度（C）和發(fā)酵時(shí)間（D）為影響因素，感官評(píng)分（Y）為響應(yīng)值，得到低醇復(fù)合米酒發(fā)酵工藝優(yōu)化多元二次回歸方程如下：

由表4可知，回歸模型極顯著（P＜0.01），失擬項(xiàng)檢驗(yàn)不顯著（P＞0.05），表明該試驗(yàn)?zāi)Ｐ统浞謹(jǐn)M合此試驗(yàn)數(shù)據(jù)，即可利用此模型確定低醇復(fù)合米酒的最佳發(fā)酵工藝。玉米添加量、發(fā)酵溫度和酒曲添加量對(duì)低醇復(fù)合米酒的感官評(píng)分影響極顯著（P＜0.01），發(fā)酵時(shí)間對(duì)低醇復(fù)合米酒的感官評(píng)分影響不顯著（P＞0.05）。

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

2.2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)分析各因素交互影響

圖5 各因素間交互作用對(duì)低醇復(fù)合米酒感官得分影響的響應(yīng)面及等高線Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on sensory scores of low-alcohol compound rice wine

由圖5可知，玉米添加量和發(fā)酵溫度的曲線最陡，其次是酒曲添加量，最后是發(fā)酵時(shí)間，酒曲添加量與發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度與發(fā)酵時(shí)間交互影響極顯著，這與表4的方差分析結(jié)果一致。通過軟件分析出低醇復(fù)合米酒的最佳釀造工藝為物料質(zhì)量比（黑糯米∶血糯米∶黑糯玉米）37.26∶40.00∶22.74、酒曲添加量0.45%、發(fā)酵溫度28.42 ℃、發(fā)酵時(shí)間48.29 h。此優(yōu)化條件下，感官評(píng)分的理論值為93.24分。為方便實(shí)際操作，將低醇復(fù)合米酒的最佳釀造工藝修正為物料質(zhì)量比（黑糯米∶血糯米∶黑糯玉米）37∶40∶23、酒曲添加量0.45%、發(fā)酵溫度28 ℃、發(fā)酵時(shí)間48 h，在此優(yōu)化條件下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到的復(fù)合米酒感官評(píng)分為93.10分，與理論值93.24分相差不大，證明該模型預(yù)測(cè)結(jié)果合理可靠。

2.3 理化指標(biāo)分析

經(jīng)測(cè)得低醇復(fù)合米酒在最佳發(fā)酵工藝條件下的主要理化指標(biāo)為：總酸10.82 g/kg，總糖28.74 g/100 g，酒精度0.91%vol，其中花色苷含量為247.4 mg/kg，能與部分干紅葡萄酒的花色苷含量相媲美[26]。

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化低醇復(fù)合發(fā)酵工藝為：物料質(zhì)量比（黑糯米∶血糯米∶黑糯玉米）為37∶40∶23、酒曲添加量0.45%、發(fā)酵溫度28 ℃、發(fā)酵時(shí)間48 h。在此優(yōu)化發(fā)酵工藝下釀造的米酒，感官評(píng)分為93分，較普通糯米米酒具有酒精度低（0.91%vol）、富含花色苷（247.4 mg/kg）的優(yōu)勢(shì)。該研究結(jié)果為一種新型的米酒發(fā)酵工藝和擴(kuò)大米酒消費(fèi)市場(chǎng)提供參考和理論支持，具有一定的應(yīng)用前景。