雷嬌嬌 田力 袁偉

摘要：為明確貴陽花溪久安茶樹炭疽病的病原菌，利用組織分離法和柯赫氏法則對病原菌進行分離與驗證，利用形態(tài)學與rDNA-ITS對致病菌進行鑒定，同時對致病菌的生物學特性進行系統(tǒng)研究。結果表明，引起久安茶樹炭疽病的病原菌為膠孢炭疽菌（Colletotrichun gloeosporioides）;生物學特性測定結果表明，C. gloeosporioides適宜生長條件：在溫度為28 ℃的條件下，以OA培養(yǎng)基和SNA培養(yǎng)基作為培養(yǎng)基，半光照，pH值為5～7，以乳糖作碳源，以牛肉膏作氮源。通過本研究明確了花溪久安茶炭疽病病原，可以為該地區(qū)茶樹炭疽病病害流行及防控提供理論依據(jù)。

關鍵詞：茶樹;炭疽病;病原菌分離;生物學特性;膠孢炭疽菌

中圖分類號：S435.711 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）11-0100-06

收稿日期：2019-05-29

基金項目：現(xiàn)代生態(tài)農(nóng)業(yè)創(chuàng)新性示范基地建設（編號：091821104022292027-4）;貴州大學“SRT計劃”項目[編號：貴大SRT字（2018）293號];貴州省大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃[編號：貴大（?。﹦?chuàng)字2019（155）]。

作者簡介：雷嬌嬌（1995—），女，貴州織金人，主要從事林木病理學相關研究。E-mail：980435499@qq.com。

通信作者：于 存，博士，講師，主要從事森林病理學相關研究。E-mail：chifengyucun@163.com。 ?近年來，貴州省大力發(fā)展茶產(chǎn)業(yè)，至2019年茶樹種植面積約已達50萬hm2[1]。而且隨著2019年兩會代表孫志剛在審議政府工作報告中提到“要喝沒有污染的茶到貴州來”，可見茶葉產(chǎn)業(yè)在貴州經(jīng)濟發(fā)展及扶貧攻堅中起到了重要的作用。在貴州省的茶樹集中連片栽植過程中，有大量病蟲害發(fā)生，對茶產(chǎn)業(yè)造成嚴重的威脅。貴州省茶樹主要病蟲害包括茶餅病、茶白星病、茶圓赤星病、茶輪紋葉枯病、茶輪斑病、茶煤病、茶炭疽病等[2-3]。其中，茶葉炭疽病是茶樹重要的葉部病害之一，該病害的發(fā)生可引起茶葉部壞死、影響茶的光合作用、嚴重者導致其死亡。以往的報道中有關茶樹炭疽病病原菌的種類主要包括山茶刺孢菌（Colletotrichun camelliae）、雕刻刺盤孢菌（C.carveri）、馬尤斯刺盤孢菌（C.majus）、殼皮炭疽菌（C.crassipes）、膠孢炭疽菌（C.gloeosporioides）、果生刺盤孢菌（C.fructicola）、暹羅刺盤孢菌（C.siamense）、尖孢炭疽菌（C.acutatum）、河南刺盤孢菌（C.henanense）、江西刺盤孢菌（C.jiangxiense）等[4]。不同病原菌在引起植物發(fā)病的過程中受溫度、濕度、pH值、碳源、氮源等環(huán)境因素的影響，明確病原菌的生物學特性，可為防治該病害采取有效措施奠定基礎[5]。

貴州省貴陽市花溪區(qū)久安鄉(xiāng)位于黔中腹地，久安鄉(xiāng)土壤呈酸性，有機成分含量高，非常適合茶樹生長，是適宜生產(chǎn)優(yōu)質有機生態(tài)茶葉的地方[6]。2013年，久安鄉(xiāng)生態(tài)精品茶示范園區(qū)被列入“5個100工程”，截至2015年，建成面積為666.67 hm2的規(guī)?；藴驶?、設施完善的特色精品茶園。近年來，隨著茶園面積的不斷擴大，加之茶園被列入歐盟有機認證和雨林認證，不允許使用化學農(nóng)藥防治病蟲害的發(fā)生，進而導致久安鄉(xiāng)茶園內病蟲害頻發(fā)。近年來，久安鄉(xiāng)茶場茶樹炭疽病發(fā)生較嚴重，而茶樹炭疽病致病菌種類仍未明確，因此，開展該地區(qū)茶樹炭疽病致病菌鑒定及病原致病性研究對于當?shù)夭鑸@茶樹炭疽病病害防治具有重要意義。本研究將從形態(tài)學以及分子生物學對茶樹炭疽病病原菌進行分離與鑒定，對其生物學特性作出探索，為進一步了解久安鄉(xiāng)茶場的炭疽病病害防控提供重要的參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

燕麥瓊脂（OA）培養(yǎng)基：30 g燕麥，20 g瓊脂，1 L 蒸餾水;合成低營養(yǎng)瓊脂（SNA）培養(yǎng)基：1 g KH2PO4，2 g KNO3，0.5 g MgSO4·7H2O，0.5 g KCl，20 g瓊脂，0.2 g葡萄糖，0.2 g蔗糖，1 L蒸餾水;馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基：200 g馬鈴薯，20 g葡萄糖，20 g瓊脂，1 L蒸餾水;馬鈴薯蔗糖瓊脂（PSA）培養(yǎng)基：200 g馬鈴薯，20 g蔗糖，20 g瓊脂，1 L 蒸餾水;茶汁培養(yǎng)基：20 g葡萄糖，3 g CaCO3，50 g 茶葉，20 g瓊脂，1 L蒸餾水。

1.2 試驗方法

1.2.1 茶樹炭疽病病原菌的分離與驗證 于貴陽市花溪區(qū)久安鄉(xiāng)茶園采集患有炭疽病的5張典型葉片。利用組織分離法對5張病葉進行病原菌的分離。將分離菌株離體回接至刺傷和未刺傷的茶樹葉片上，用脫脂棉進行保濕在28 ℃條件下培養(yǎng)，以相同處理接種PDA菌餅的葉片作為對照。以上試驗均重復5次。

1.2.2 茶樹炭疽病病原菌的鑒定 利用形態(tài)學與核糖體DNA基因內轉錄間隔區(qū)（rDNA-ITS）測序結合的方法對“1.2.1節(jié)”中可以引起茶樹炭疽病的病原菌進行鑒定。利用形態(tài)學方法[7]，主要對病原菌菌落特征、顏色、菌絲及孢子大小等進行觀察;rDNA-ITS鑒定參考李婕等的方法[8-9]，首先利用十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrimethylammonium ammonium bromide，簡稱CTAB）法提取致病菌總DNA，利用真菌通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）進行序列擴增，得到序列后，通過NCBI的Blast進行序列的比對分析，同時利用MEGA 7.0進行包含致病菌ITS序列在內的系統(tǒng)進化樹，綜合形態(tài)學與分子生物學的方法進行病原菌的鑒定。

1.2.3 茶樹炭疽病病原菌生物學特性測定 分別將茶樹炭疽病病原菌菌株接種至不同培養(yǎng)基（OA培養(yǎng)基、SNA培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、PSA培養(yǎng)基、茶汁培養(yǎng)基），并設置不同碳源（麥芽糖、蔗糖、淀粉、果糖、乳糖）、不同氮源（尿素、硫酸銨、硝酸銨、硝酸鈉、牛肉膏、蛋白胨）、不同溫度（15、20、25、28、30、35 ℃）、不同光照（全光照、半光照、全黑暗）、不同pH值（4、5、6、7、8、9）。以上處理分別在培養(yǎng)3、4、5、6、7、8、9、10 d后測定菌落生長半徑，分析不同因素對茶炭疽病病原菌生長的影響。以上處理均重復3次。

2 結果與分析

2.1 茶樹炭疽病的分離及回接驗證

茶樹炭疽病野外發(fā)病癥狀如圖1-a。茶樹炭疽病發(fā)生初期，在葉片上形成灰色病斑，病斑處凹陷，后期易破碎，病健交界處明顯。病斑上的小黑點即為分生孢子盤，寄生于葉片表皮下，后期分生孢子穿破表皮，隨風雨飛散，作為病原物再次侵染茶樹[8]。利用組織分離法從5個不同發(fā)病茶葉中分離純化得到5株菌株，分別命名為TJ2-1、TJ2-2、TJ2-3、TJ2-4、TJ2-5。將5株菌株分別接種至刺傷和未刺傷茶樹葉片上，結果表明，在刺傷葉片上菌株TJ2-1可以引起茶樹炭疽病相同癥狀（圖1-b）。而在未刺傷葉片上5株菌株都未引起茶葉發(fā)病。對發(fā)病離體葉片采取組織分離法分離病原菌，同樣得到了與TJ2-1相同的菌株。由此可以確定菌株TJ2-1為茶樹炭疽病的病原菌。菌株 TJ2-1 主要通過傷口侵入到茶樹葉片內引起發(fā)病。

2.2 茶樹炭疽病病原菌鑒定

病原菌在溫度為28 ℃，PDA培養(yǎng)基暗培養(yǎng)條件下，菌落生長速度為0.9 cm/d，菌落白色至淺灰色，氣生菌絲較長，毯狀，邊緣較整齊，背面一般會形成黑色物質（圖2-a），培養(yǎng)后期于菌落中心產(chǎn)生橙黃色分生孢子堆。菌絲有隔（圖2-b），分生孢子橢圓形（圖2-c），兩端鈍圓，淺灰色，表面粗糙，中間凹陷，大小為（7.3～20.0 μm）×（2.0～5.0 μm）。分生孢子上易產(chǎn)生分生孢子附著孢，附著孢呈不規(guī)則形、球形，表面黑色或灰黑色，表面灰

色顆粒狀物明顯，大小為（6.1～10.2 μm）×（4.5～6.8 μm）。參照魏景超的《真菌鑒定手冊》以及邵力平等的《真菌分類學》等書籍，鑒定茶樹炭疽病病原菌屬于膠孢炭疽菌（Colletotrichun gloeosporioides）[10-11]。

擴增菌株TJ2-1的rDNA-ITS獲得長度為541 bp的分子序列，GenBank登錄號為MK757870。NCBI的Blast比對結果顯示，該序列與GenBank登錄號為KF836743.1的C. gloeosporioides的序列覆蓋度為100%，序列相似性為100%。由圖3可知，菌株TJ2-1的ITS序列與膠孢炭疽菌聚為一類，親緣關系較近，而與C. theobromicola菌株間遺傳距離較遠，具有相對遠的親緣關系。由此結合形態(tài)學與分子生物學鑒定茶樹炭疽病致病菌為膠孢炭疽菌。

2.3 茶樹炭疽病病原菌生物學特性觀察

2.3.1 光照對膠孢炭疽菌生長的影響 由圖4可知，在不同光照條件下，菌株均可生長，在相同培養(yǎng)時間內，不同光照處理對菌絲生長影響差異不明顯。不同時間光照對膠孢炭疽菌生長的影響結果顯示，在培養(yǎng)初期3～8 d時全黑暗條件下更有利于菌落生長。而培養(yǎng)至9 d開始，半光照更利于膠孢炭疽菌的生長。不同光照及時間內， 全光照對菌落

生長均較全黑暗和半光照生長緩慢。由此可見，茶樹常年處在高山多霧，日照少的自然條件下，是炭疽病嚴重發(fā)生的原因之一。

2.3.2 不同pH值對膠孢炭疽菌菌絲生長的影響 由圖5可知，在pH值為4～9時，菌絲均可生長，在培養(yǎng)3～5 d時，pH值=7時更利于菌絲生長，而在培養(yǎng) 6～10 d時適宜菌絲生長的pH值范圍為 5～6。結合茶樹的生長條件可知，在中性偏酸性的條件下更有利于膠孢炭疽菌的生長。

2.3.3 不同氮源對膠孢炭疽菌生長的影響 由圖6可知，以尿素作為氮源時，菌落在不同時間均沒有生長。以牛肉膏作為氮源時，更利于菌絲的生長，以硝酸鈉、硫酸銨、硝酸銨、蛋白胨作為氮源對菌落生長的促進效果依次減弱。

2.3.4 不同碳源對膠孢炭疽菌生長的影響 由圖7可知，在培養(yǎng)3～4 d時，不同碳源條件下菌絲長勢基本一致。5 d以后，以乳糖和果糖作為碳源更利于菌絲的生長。綜合評價不同碳源對膠孢炭疽菌生長影響的排序為乳糖>果糖>麥芽糖>蔗糖>淀粉。

2.3.5 不同培養(yǎng)基對菌絲生長的影響 由圖8可知，在培養(yǎng)初期OA培養(yǎng)基、SNA培養(yǎng)基更利于菌落

的生長，在培養(yǎng)后期不同培養(yǎng)基對菌落生長的影響差異不明顯。綜合分析，不同培養(yǎng)基對膠孢炭疽菌生長影響的排序為OA培養(yǎng)基>SNA培養(yǎng)基>PSA培養(yǎng)基>PDA培養(yǎng)基>茶汁培養(yǎng)基。

2.3.6 不同溫度對菌絲生長的影響 由圖9可知，在溫度為15～30 ℃范圍內，膠孢炭疽菌均可生長，而當溫度高于35 ℃時菌落的停止生長。在不同溫度范圍內，28 ℃更利于膠孢炭疽菌的生長，溫度由28 ℃逐漸降低或升高，膠孢炭疽菌的生長均呈下降趨勢。因此，夏季是炭疽病流行的高發(fā)時期，應注意病害的預防監(jiān)測。

3 討論與結論

貴州茶區(qū)普遍存在高海拔、多云霧、寡日照、氣候冷涼等特點，茶輪斑病、炭疽病等病害的發(fā)生與蟲害相比更為嚴重[12]。而對病害的有效防治須要準確掌握引起病害的病原菌[13]。以往研究中報道的茶樹炭疽病病原菌主要為炭疽菌屬，本研究明確貴陽花溪久安茶炭疽病病原為膠孢炭疽菌。對病原菌生物學特性的了解可以有助于從病原角度了解病害發(fā)生發(fā)展及指導防治措施的制定[14-15]。膠孢炭疽菌生物學特性結果表明， 不同溫度對膠孢炭

疽生長的影響差異明顯，其中當溫度為28 ℃時更利于菌株的生長，當溫度下降或上升均不利于菌株的生長，由此推斷該病害更容易發(fā)生在 28 ℃ 左右的夏季，這與實際調查發(fā)現(xiàn)的該地區(qū)茶樹炭疽病多發(fā)生在夏季（夏季平均溫度為23～30 ℃）的結果相符。病原菌在引起病害過程中要經(jīng)歷接觸、侵入、潛育、發(fā)病等4個發(fā)病歷程，其中潛育期時間長短決定了該病害發(fā)生周期的長短，也決定了一種病害再侵染周期的長短。而在病原菌潛育期過程中主要以吸收營養(yǎng)，增加自身的生長為主。因此，了解病原菌所需要的營養(yǎng)條件，可以判斷其在不同條件下病原菌生長的速度及潛育期的長短，進而合理地制定防治措施。在本研究中，膠孢炭疽菌以SNA培養(yǎng)基、OA培養(yǎng)基作為培養(yǎng)基，以乳糖作為碳源，以牛肉膏作為氮源，pH值為5～7時更利于其生長，而不同光照處理對膠孢炭疽菌的影響差異不明顯，以初期黑暗條件，后期半光照條件更利于菌株的生長，因此，可以將茶樹盡量種植在光照充足的地域以減緩茶樹炭疽病的發(fā)生。通過本研究明確了貴陽花溪久安茶樹炭疽病的病原及其生物學特性，為該地區(qū)今后茶樹炭疽病的有效防治奠定了基礎，可以為今后該病原菌的進一步研究提供理論依據(jù)。

參考文獻：

[1]貴州省農(nóng)業(yè)科學院. 貴茶十講[N]. 貴州日報，2019-03-20（12）.

[2]施 利，江 健，王 勇，等. 貴州茶樹病蟲害防控現(xiàn)狀及對策建議[J]. 茶葉，2015，41（3）：146-149，153.

[3]劉 霞，江 健，詹金碧，等. 湄潭縣危害茶樹的主要病蟲害調查[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學，2011，39（9）：77-80.

[4]韓長志. 炭疽菌屬真菌分類研究現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢[J]. 中國植保導刊，2015，35（6）：24-30.

[5]朱迎迎，李 敏，高兆銀，等. 火龍果炭疽病病原菌的鑒定及生物學特性研究[J]. 南方農(nóng)業(yè)學報，2016，47（1）：59-66.

[6]汪圣洪，胡嘉歡，周博楊. 貴陽花溪久安茶葉園區(qū)氣候適宜性分析及減災對策[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學，2018，46（30）：176-179.

[7]Weir B S，Johnston P R，Damm U. The Colletotrichum gloeosporioides species complex[J]. Studies in Mycology，2012，73（1）：115-180.

[8]李 婕，李永川，楊 虹，等. 甘蔗黑腐病病原菌的鑒定[J]. 云南大學學報（自然科學版），2014，36（1）：139-143.

[9]劉小玉，余鳳玉，付登強，等. 油茶炭疽病病原菌的分離與鑒定[J]. 中國果菜，2018，38（11）：40-42.

[10]魏景超. 真菌鑒定手冊[M]. 上海：上海科學技術出版社，1979.

[11]邵力平，沈瑞祥，張素軒，等. 真菌分類學[M]. 北京：中國林業(yè)出版社，1984.

[12]劉 威. 茶樹炭疽病的病原鑒定及其遺傳多樣性分析[D]. 福州：福建農(nóng)林大學，2013.

[13]王珊珊，乜蘭春，李 潘，等. 植物病原真菌毒素的分類、致病機制及應用前景[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2019，47（3）：94-97.

[14]文小東，宋星陳，王 勇，等. 茶輪斑病病原菌（Pseudopestalotiopsis camelliae-sinensis）生物學特性研究[J]. 中國植保導刊，2018，38（10）：19-25.

[15]陳全助，陳慧潔，郭文碩，等. 桉樹焦枯病菌（Calonectria pseudoreteaudii）生物學特性測定[J]. 福建林學院學報，2014，34（4）：328-332.呂中偉，吳文瑩，張 柯，等. 水溶肥施肥模式對陽光玫瑰葡萄養(yǎng)分含量及果實品質的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2020，48（11）：106-111.