郝婧瑋 張 蕾 秦金玲

摘要：為了解川牛膝多糖聯(lián)合維生素C抑制腫瘤細(xì)胞活性作用，采用超聲波提取法從川牛膝根中提取川牛膝多糖（RCP），經(jīng)Sevage法除去蛋白，并采用30%雙氧水脫色、濃縮、凍干，得到川牛膝粉針劑，通過苯酚硫酸法制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)而測得多糖含量。體外聯(lián)合維生素C作用于肝癌HepG-2細(xì)胞，采用噻唑藍(lán)（MTT）法研究對 HepG-2 細(xì)胞的抑制作用。結(jié)果表明，川牛膝多糖與維生素C均可抑制肝癌HepG-2細(xì)胞的增殖，當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為5、50、100、200 mg/mL時(shí)，對肝癌HepG-2的抑制率分別為19.7%、62.1%、59.1%、65.1%。當(dāng)維生素C的濃度為0.1、02、0.3、0.4 mmol/L時(shí)，對肝癌HepG-2的抑制率為10%、11%、12%、54%。研究結(jié)果提示兩者對腫瘤的抑制均呈劑量依賴性，當(dāng)兩者聯(lián)合用藥時(shí)，兩者呈協(xié)同增效抗腫瘤作用，隨著兩者濃度的增加抑制率逐漸增強(qiáng)，對HepG-2細(xì)胞的最大抑制率可達(dá)84.2%。

關(guān)鍵詞：川牛膝多糖;維生素C;肝癌;HepG-2細(xì)胞

中圖分類號： R735.7;R285.5 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）11-0192-04

收稿日期：2019-05-17

基金項(xiàng)目：黑龍江省教育廳項(xiàng)目（編號：1353MSYQN009）;黑龍江省牡丹江市科學(xué)技術(shù)計(jì)劃（編號：Z2018s074）;黑龍江省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃（編號：201810233031）。

作者簡介：郝婧瑋（1985—），女，遼寧寬甸人，碩士，講師，主要從事腫瘤藥理學(xué)研究。Tel：（0453）6511042;E-mail：swxhjw@126.com。 ?牛膝為莧科多年生草本植物，主要分為懷牛膝（Achyrnthes bidentata）和川牛膝（Cyathula capitata）2種?！吨腥A人民共和國藥典（2015年版）》上記載，牛膝有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、逐痕通經(jīng)、引血下行之功效[1]。川牛膝主產(chǎn)于四川省、貴州省、云南省、福建等地，具有活血、利尿、降血糖、保肝、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等功效。近年來，對川牛膝的抗腫瘤研究較多，其多糖成分[3] CoPS1、CoPS2、CoPS3被認(rèn)為是其主要活性成分并具有抗腫瘤作用[4]。陳紅等人觀察了川牛膝多糖對小鼠肉瘤、小鼠肝癌的抑制作用及對環(huán)磷酰胺（Cy）所致正常及荷瘤小鼠外周白細(xì)胞減少的影響[5]，表明川牛膝多糖對小鼠肝癌（S180）的抑制率為21.99%～42.21%;對環(huán)磷酰胺（Cy）所致正?；蚝闪鲂∈笸庵苎准?xì)胞減少有極顯著的回升作用，說明川牛膝多糖不僅有抗腫瘤作用，還能減輕Cy所致外周白細(xì)胞減少。宋軍等對川牛膝多糖對小鼠肝癌細(xì)胞H22抑制作用研究表明，Cy對肝癌細(xì)胞H22（腹水型）有強(qiáng)烈的抑制作用[6]。川牛膝多糖對小鼠肝癌細(xì)胞H22（腹水型）有一定的抑制作用，其抑瘤作用及機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

作為生物體內(nèi)普遍存在的一類生物大分子，來源于中藥的多糖[7-9]已超過200種，諸多研究表明多糖具有促進(jìn)機(jī)體免疫力、抗菌、抗病毒、抗寄生蟲、抗腫瘤、抗輻射、抗衰老、抗炎、降血脂等生物活性，目前在臨床上已用于治療肝炎、艾滋病、癌癥和許多其他疾病[10-15]。有研究發(fā)現(xiàn)，維生素C不僅可以保護(hù)細(xì)胞，還可以抑制和殺傷腫瘤細(xì)胞，維生素C有抗胃癌、宮頸癌[16-17]作用。本研究以川牛膝根中提取的川牛膝多糖（RCP），在體外聯(lián)合維生素C作用于肝癌HepG-2細(xì)胞，研究對HepG-2細(xì)胞的抑制作用，旨在探討川牛膝多糖抗腫瘤作用機(jī)制，為抗腫瘤藥物機(jī)制的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞株與試劑 細(xì)胞株，人肝癌HepG-2，由哈爾濱工業(yè)大學(xué)傳代保種。川牛膝，產(chǎn)地為四川。維生素C，天津市永大化學(xué)試劑有限公司;胎牛血清，賽默飛世爾生物化學(xué)制品（北京）有限公司;PBS沖液，瑞楚生物;胰蛋白酶-EDTA溶液，源葉生物;DMSO，岳陽湘茂醫(yī)藥化工有限公司;DMEM培養(yǎng)基，美國Gibco公司。

1.1.2 主要儀器 超聲波清洗機(jī)（SB-5200DT），購于寧波新芝生物科技有限公司;冷凍干燥機(jī)（FD-1），購于北京博醫(yī)康技術(shù)公司;旋片真空泵（2XZ-2），浙江黃巖求精真空泵廠制造;電熱恒溫水浴鍋（HWS28），購于上海一恒科技有限公司;超級恒溫水浴（HH-601），購于江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司;手提式壓力蒸汽滅菌器（XFS-280），購于浙江新豐醫(yī)療器械有限公司;電熱鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9055A），購于上海一恒科學(xué)技術(shù)有限公司;循環(huán)水真空泵（SHZ-D3），購于鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;生物安全柜（BHC-1300IIA2），購于薊州凈化;超低溫冰箱（U410-86），購于Peppercorn公司;紫外分光光度計(jì)（722N），購于北京普析通用儀器有限公司;電子天平（BSA224S-CW），購于賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司;Synergy HTX（SILFTA），購于美國伯騰儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 牛膝多糖粗提取物的提取 稱取川牛膝粉末500 g，按料液比1 g ∶ 13 mL加入蒸餾水浸泡 1.5 h，60 ℃ 超聲提取2 h，過濾、棄濾渣，合并提取液。90 ℃ 濃縮，待濃縮液呈黏稠狀，冷卻，按照濃縮液與乙醇比1 ∶ 9的體積比加入無水乙醇，攪拌均勻，靜置過夜。棄上清、取沉淀、洗滌，即為川牛膝多糖粗提取物。將多糖粗提取物加適量蒸餾水使其溶解，得多糖粗提取液。

1.2.2 牛膝多糖粗提取物的精制與凍干 按5 ∶ 1（多糖粗提取液∶ 30%過氧化氫）體積比加30%過氧化氫脫色素，溫度控制在50 ℃，脫色2～4 h，期間用氨水調(diào)pH值保持在8.0左右。重復(fù)處理5次后，溶液由橙黃變?yōu)榻该鳡睿暈槊撋瓿?。按Sevage試劑與多糖粗提取液以1 ∶ 3的體積比于分液漏斗中萃取3次，分離上層多糖提取物。將處理后的多糖置于50 ℃恒溫水浴鍋中水浴、濃縮，將濃縮液倒在若干培養(yǎng)皿中，使溶液鋪滿皿底薄薄一層，放在 -80 ℃ 冰箱中預(yù)凍24 h，取出放置冷凍干燥機(jī)中-200 ℃，8 h凍干，密封冷藏，備用。

1.2.3 苯酚硫酸法制定葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線 稱取01 g葡萄糖，倍比稀釋得100 μg/mL的葡萄糖溶液。稱取5 g苯酚，置100 mL容量瓶中定容，制得5%苯酚溶液，避光保存。分別取9支25 mL干燥的具塞比色管，編號依次為0～8號，0號作空白組校正，1～8 號分別加入0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、16、1.8 mL葡萄糖溶液，再加蒸餾水補(bǔ)至2 mL，后加入0.8 mL 5%苯酚試液、5 mL 98%濃硫酸，充分振蕩，蒸餾水補(bǔ)至9 mL。100 ℃沸水浴15 min，冷卻，490 nm處測吸光度。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線精密度測定 稱取0.1 g葡萄糖，定容至50 mL，制成2 mg/mL葡萄糖樣液，精確吸取250 μL樣液于50 mL容量瓶中，加水定容至刻度，得10 μg/mL的葡萄糖供試液。取5支具塞試管，編號依次為0～4號，0號為空白組，1～4號為試驗(yàn)組，每組分別吸取1 mL葡萄糖供試液，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線法測得每組葡萄糖的吸光度，求RSD值。

1.2.5 川牛膝凍干粉多糖百分含量測定 稱取川牛膝多糖凍干粉0.1 g，配制成0.06 mg/mL 川牛膝多糖供試液。按照標(biāo)準(zhǔn)曲線法測量川牛膝多糖在490 nm處的吸光度，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程得到川牛膝多糖相當(dāng)于葡萄糖的濃度，根據(jù)公式（1）得出川牛膝多糖的百分含量：

式中：A為川牛膝多糖的百分含量，%;C為川牛膝多糖相對于葡萄糖的濃度（μg/mL）;D為稀釋倍數(shù);m為稱取干燥恒質(zhì)量的川牛膝凍干粉的質(zhì)量（mg）。

1.2.6 細(xì)胞的復(fù)蘇與傳代 取出凍存細(xì)胞，融化，采用DMEM洗去凍存液。轉(zhuǎn)移至含有0.5 mL 10%胎牛血清、3.5 mL DMEM的培養(yǎng)皿中，放入CO2恒溫培養(yǎng)箱，24 h后觀察細(xì)胞生長狀況并更換培養(yǎng)液。當(dāng)細(xì)胞鋪滿皿底時(shí)，開始傳代。棄去細(xì)胞培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，加適量胰酶，37 ℃消化1 min，加適量血清，終止胰酶消化反應(yīng)。離心、棄上清，加2 mL DMEM吹打均勻。各吸取1 mL細(xì)胞液分別置于含0.5 mL胎牛血清和3.5 mL DMEM的培養(yǎng)皿中，輕輕振蕩，混勻，于倒置顯微鏡觀察。放入CO2恒溫培養(yǎng)箱中，24 h后觀察細(xì)胞生長狀況。

1.2.7 不同濃度牛膝多糖作用于HepG-2腫瘤細(xì)胞 取對數(shù)期細(xì)胞懸液，置96孔板中，每孔80 μL，于CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育，過夜，使細(xì)胞鋪滿孔底。分別取0.025、0.250、0.500、1.000 g川牛膝多糖，溶于1 mL DMEM中配制成0.025、0.250、0.500、1.000 g/mL 的多糖培養(yǎng)液，每個(gè)質(zhì)量濃度梯度設(shè)2個(gè)復(fù)孔，以不加多糖的細(xì)胞作空白對照。在每孔中加入20 μL不同質(zhì)量濃度梯度的多糖培養(yǎng)液，孵育24 h，倒置顯微鏡觀察。每孔加入20 μL MTT，注意遮光，放培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)，棄去多糖培養(yǎng)液。 每孔加100 μL二甲基亞砜，振搖10 min，用酶標(biāo)儀在 490 nm 下測量吸光度。

1.2.8 不同濃度維生素C作用于HepG-2腫瘤細(xì)胞 分別取0.02、0.04、0.05、0.07 g維生素C溶于1 mL培養(yǎng)基中，配制成0.1、0.2、0.3、0.4 mmol/L的維生素C液，每個(gè)濃度梯度設(shè)2個(gè)復(fù)孔，以不加藥孔作為空白孔。其他步驟同“1.2.7”節(jié)。

1.2.9 不同質(zhì)量濃度川牛膝多糖聯(lián)合不同濃度維生素C作用于HepG-2腫瘤細(xì)胞 將維生素C（01、0.2、0.3、0.4 mmol/L）和多糖（0.025、0.250、0.500、1.00 g/mL）按不同濃度或質(zhì)量濃度梯度從小到大聯(lián)合用藥，每組設(shè)2個(gè)復(fù)孔。以細(xì)胞原液作空白孔，其他步驟同“1.2.7”節(jié)。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線與川牛膝多糖含量的測定

葡萄糖在吸收光490 nm所得的曲線回歸方程為y=0.009x+0.1 256，r2=0.932 2。葡萄糖質(zhì)量濃度在20～90 μg/mL與吸光度呈良好的線性關(guān)系。精密度RSD=2.6%<5%，說明試驗(yàn)精密度良好。計(jì)算得川牛膝的百分含量為64.8%，其中C=38.93 μg/mL，D=1 666.7，m=100 mg。

由表1可知，將0.06 mg/mL川牛膝多糖供試液設(shè)2平行對照組于490 nm處，測得吸光度值，代入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線得到川牛膝多糖相對于葡萄糖的含量為64.8%。試驗(yàn)采用的是超聲波輔助提取法，收率高于浸漬法。

2.2 川牛膝多糖對HepG-2腫瘤細(xì)胞活性的抑制

由圖2可知，川牛膝多糖（RCP）體外有很好的抗腫瘤活性，在川牛膝多糖（RCP）體外作用于HepG-2細(xì)胞24 h內(nèi)，抗腫瘤效果呈劑量依賴性，隨著劑量增高抑制率也隨之增高。川牛膝多糖（RCP）質(zhì)量濃度這50 mg/mL時(shí)，抑制率達(dá)到621%，隨后再增加川牛膝多糖（RCP）的質(zhì)量濃度，抑制率增加幅度變小。當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為100 mg/mL時(shí)，抑制率為591%，接近50%，可將100 mg/mL川牛膝多糖作為細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）。川牛膝多糖質(zhì)量濃度為200 mg/mL時(shí)，抑制率達(dá)到651%，為最大抑制率。

2.3 維生素C對HepG-2腫瘤細(xì)胞活性的抑制

維生素C體外也有抗腫瘤活性，24 h內(nèi)，隨著維生素C濃度的增高，抑制率也呈上升趨勢，抗腫瘤活性呈劑量依賴性。維生素C濃度為0.4 mmol/L時(shí)，抑制率為54%（圖3），接近50%，可將0.4 mmol/L維生素C看作半數(shù)抑制濃度（IC50）。

2.4 川牛膝多糖聯(lián)合維生素C對HepG-2腫瘤細(xì)胞活性的抑制

由圖4可知，不同質(zhì)量濃度或濃度組合的川牛膝多糖（5、50、100、200 mg/mL）與維生素C（0.1、02、0.3、0.4 mmol/L）聯(lián)合作用于HepG-2細(xì)胞 24 h，MTT法檢測并計(jì)算出對細(xì)胞的的抑制率，結(jié)果呈現(xiàn)劑量依賴性，當(dāng)川牛膝多糖濃度固定時(shí)，隨著維生素C濃度的上升，抑制率逐漸升高。200 mg/mL的川牛膝多糖與維生素C的聯(lián)合抗腫瘤活性是所有組合中的最佳組合。當(dāng)維生素C濃度為0.4 mmol/L，多糖質(zhì)量濃度為200 mg/mL，抑制率達(dá)到最大值84.2%。0.2 mmol/L維生素C與不同質(zhì)量濃度多糖聯(lián)合對細(xì)胞的抑制率均很接近。

3 討論

3.1 苯酚硫酸法測定條件因子選擇

苯酚硫酸法測多糖含量的原理為多糖在硫酸作用下水解成單糖，再與苯酚結(jié)合在吸收光為 490 nm 處的最大吸收值。由于不同多糖的組成不同，苯酚硫酸法采用的苯酚用量、濃硫酸用量也不盡相同。通過對川牛膝多糖苯酚硫酸法測定條件因子水平研究，本研究選擇為5%苯酚0.8 mL、98%濃硫酸5 mL。

3.2 多糖凍干噴瓶現(xiàn)象

在做多糖凍干粉時(shí)，出現(xiàn)噴瓶現(xiàn)象，可能是由于多糖的預(yù)凍不完全，冷凍干燥機(jī)升溫過快導(dǎo)致試品部分液化，易在真空減壓條件下出現(xiàn)噴瓶現(xiàn)象。也可能由于多糖濃縮液中有機(jī)試劑殘留過多，導(dǎo)致噴瓶。處理的方法為增加多糖預(yù)凍時(shí)間，控制冷凍干燥機(jī)升溫速度，提高多糖濃縮溫度，減少濃縮液體積，必要時(shí)進(jìn)行旋蒸去除多糖中殘留的有機(jī)試劑。

3.3 多糖及維生素C體外抑制HepG-2腫瘤細(xì)胞活性

肝癌是嚴(yán)重危害人類健康的病癥之一，死亡率極高，目前化學(xué)藥物在市場上占據(jù)主導(dǎo)地位。但是化學(xué)藥物對人體危害極大，耐藥性產(chǎn)生概率極高，且單一用藥難以控制病情發(fā)展[18-20]。研究天然活性成分的抗腫瘤作用是科學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)熱門話題。試驗(yàn)根據(jù)MTT法測得川牛膝多糖、維生素C單獨(dú)作用及兩者不同濃度聯(lián)合的體外抗腫瘤活性，證明了川牛膝體外的抗腫瘤活性。早有研究表明維生素C有助于預(yù)防胃癌、宮頸癌，對肝癌的研究鮮有研究。本試驗(yàn)證明維生素C在體外對Hep-2肝癌細(xì)胞的抗腫瘤活性，維生素C抗腫瘤活性比較低，可能與配制濃度太小有關(guān)，也可能是因?yàn)榕渲凭S生素C溶液時(shí)，未及時(shí)采取遮光措施導(dǎo)致維生素C分解，藥效減弱。兩者聯(lián)用時(shí)，總體效果比單獨(dú)抗腫瘤活性高，說明兩者體外抗腫瘤具有協(xié)同作用?？赡苁怯捎诰S生素C影響Hep-2肝癌細(xì)胞HIF的表達(dá)和川牛膝多糖的抗腫瘤作用共同誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。

4 結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)，川牛膝多糖、維生素C、川牛膝多糖聯(lián)合維生素C均能抑制肝癌HepG-2細(xì)胞增殖活性，聯(lián)合用藥抑制率比兩者單用要大。藥物作用細(xì)胞的24 h內(nèi)，當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為5、50、100、200 mg/mL 時(shí)，對細(xì)胞的抑制率分別為19.7%、621%、591%、65.1%。當(dāng)維生素C的濃度為01、0.2、03、0.4 mmol/L時(shí)，對肝癌HepG-2細(xì)胞的抑制率為10%、11%、12%、54%，說明兩者對腫瘤的抑制均呈劑量依賴性，且川牛膝多糖在低質(zhì)量濃度時(shí)抗腫瘤活性就較大。維生素C在低濃度時(shí)抗腫瘤活性小，高濃度時(shí)明顯增加。兩者聯(lián)合用藥對肝癌HepG-2的抑制率最高可達(dá)84.2%。

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