楊永恒 侯孟蘭 張婷

摘要：為了研究甜菊β-葡萄糖苷酶在甜菊糖苷降解代謝中的作用，分別采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，簡稱HPLC）和分光光度計法對甜菊糖苷含量和β-葡萄糖苷酶活性進(jìn)行同步檢測分析。結(jié)果表明，不同甜菊品種中具有高甜菊苷（stevioside，簡稱St）含量的中山5號、大葉1號具有較高的β-葡萄糖苷酶活性;在中山5號開花期植株的不同器官中，β-葡萄糖苷酶活性與甜菊糖苷含量的變化趨勢較一致，其中葉片中的β-葡萄糖苷酶活性、甜菊糖苷含量均最高，花中次之，莖中較低，根中均最低;中山5號3個主要生長時期葉片中的β-葡萄糖苷酶活性隨生長發(fā)育的推進(jìn)而逐漸升高，其甜菊糖苷含量則隨生長發(fā)育的推進(jìn)先升后降，現(xiàn)蕾期最高。研究結(jié)果可為后續(xù)甜菊β-葡萄糖苷酶及其基因的研究奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：甜菊;甜菊糖苷;β-葡萄糖苷酶;分解代謝

中圖分類號： S566.901;Q556+.2 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）11-0187-05

收稿日期：2019-06-19

基金項目：江蘇省自然科學(xué)基金青年基金（編號：BK20160600）。

作者簡介：楊永恒（1985—），女，陜西洋縣人，博士，助理研究員，主要從事甜菊遺傳育種研究。Tel：（025）84347086;E-mail：yyh8576@126.com。

通信作者：徐曉洋，博士，助理研究員，主要從事甜菊遺傳育種研究。Tel：（025）84347086;E-mail：intergoogle@126.com。 ?甜菊（Stevia rebaudiana Bertoni）別稱甜葉菊，是原產(chǎn)于南美洲的菊科（Asteraceae）甜菊屬（Stevia）宿根性多年生草本植物[1]，因其葉片含有高甜度（高達(dá)蔗糖的250～450倍）、低熱量（低至蔗糖的1/300）的甜菊糖苷（steviol glycosides）而得名[2]。甜菊糖苷俗稱甜菊糖，目前已經(jīng)作為天然低熱量甜味劑廣泛應(yīng)用于食品、飲料、醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域，并且有越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，甜菊糖苷具有預(yù)防和輔助治療肥胖癥、糖尿病、高血壓、高血糖以及消炎、抗氧化、抗菌、抗癌和增強(qiáng)免疫力等藥用價值[3]。

甜菊糖苷是以甜菊醇（steviol）為苷元的四環(huán)二萜類糖苷，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)50多種甜菊糖苷組分，主要包括甜菊單糖苷（steviolmonoside）、甜菊雙糖苷（steviolbioside）、甜菊苷（stevioside，簡稱St）、萊鮑迪苷A（rebaudioside A，簡稱RA）、萊鮑迪苷B（rebaudioside B）、萊鮑迪苷C（rebaudioside C）、萊鮑迪苷D（rebaudioside D）、杜爾克苷A（dulcoside A）等[4]，各種甜菊糖苷組分因其苷元甜菊醇C13和C19位發(fā)生糖基化的糖基種類和數(shù)量不同而性質(zhì)迥異[5]。有研究發(fā)現(xiàn)，甜菊葉片內(nèi)甜菊糖苷的積累隨生長發(fā)育的推進(jìn)而變化[6]。由于糖苷積累是合成與分解、糖基化與去糖基化的動態(tài)平衡，因此催化糖苷分解的酶[糖苷酶（glycosidases）]，尤其是β-葡萄糖苷酶（β-glucosidases，EC 3.2.1.21）在甜菊糖苷分解代謝和組分轉(zhuǎn)化中起著相當(dāng)重要的作用，然而目前在甜菊中尚未見相關(guān)報道。β-葡萄糖苷酶又稱 β-D-葡萄糖苷水解酶，可以水解結(jié)合于苷元末端非還原性的β-D-糖苷鍵，同時釋放β-D-葡萄糖苷和相應(yīng)配基[7]。β-葡萄糖苷酶廣泛存在于自然界中，在不同的生物體中，β-葡萄糖苷酶的生物學(xué)功能也各不相同。植物來源的β-葡萄糖苷酶被認(rèn)為具有較為廣泛的生理功能，包括參與植物細(xì)胞壁的降解、木質(zhì)化作用、植物激素的共價激活、宿主防御、香味前體的水解等[8]。盡管目前已有大量關(guān)于β-葡萄糖苷酶作為植物醇系香味物質(zhì)產(chǎn)生的關(guān)鍵酶的研究，在人參皂苷[9]、大豆異黃酮苷[10]、茶樹香葉醇苷[11]等萜類糖苷降解中的關(guān)鍵作用也有很多報道，然而在以其萜類糖苷而聞名的甜菊中的相關(guān)研究很少，目前僅有一些利用微生物來源的β-葡萄糖苷酶進(jìn)行甜菊糖苷組分轉(zhuǎn)化[12]的報道。

為了明確甜菊β-葡萄糖苷酶在甜菊糖苷降解代謝中的作用，本研究對不同品種、不同器官、不同生長時期甜菊的β-葡萄糖苷酶活性和甜菊糖苷含量進(jìn)行同步測定分析，以期為后續(xù)甜菊β-葡萄糖苷酶及其基因的研究，以及通過抑制甜菊糖苷的降解從而提高其含量的育種工作等奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

本試驗選擇甜菊糖苷總含量和組分種類有差異的6個甜菊品種進(jìn)行試驗，供試品種均種植于江蘇省中國科學(xué)院植物研究所的甜菊資源圃內(nèi)，各品種的來源及特征見表1。

本試驗所用主要儀器為LC-100高效液相色譜儀（上海伍豐科學(xué)儀器有限公司）、Sapphire C18反相色譜柱（蘇州賽分科技有限公司，250 mm×4.6 mm，5 μm）。

1.2 研究方法

1.2.1 取樣方法 2016年8月于甜菊現(xiàn)蕾期分別采集6個甜菊品種植株頂部的10對葉片，每對葉片分為2份，1份用液氮速凍，用于β-葡萄糖苷酶的提取和酶活性的測定，另1份于105 ℃殺青后于 70 ℃ 烘干，用于甜菊糖苷含量的測定。在品種比較的基礎(chǔ)上，選擇糖苷酶活性最高的品種中山5號，分別采集其開花期的根、莖、葉、花序4個器官樣品，每份樣品至少選擇5株混勻后一分為二，分別用液氮速凍、105 ℃殺青后烘干，用于酶活性和糖苷含量的測定。2017年5—10月分別采集中山5號快速生長期、現(xiàn)蕾期、開花期的葉片，進(jìn)行不同生長時期酶活性和糖苷含量的測定，取樣方法同上。

1.2.2 甜菊β-葡萄糖苷酶的提取 參考宋曉青的方法[13]并略加改進(jìn)。取1.0 g甜菊樣品，置于預(yù)冷的研缽中，加入約5 mL pH值為7.0的 50 mmol/L 磷酸緩沖液、適量石英砂和等量聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，簡稱PVP），在冰上研磨至勻漿后全部轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，并用少量pH值為7.0的50 mmol/L磷酸緩沖液沖洗研缽、研錘3～4次，合并洗液至同一50 mL離心管中，定容至20 mL，混勻后于4 ℃、10 000 g離心10 min，取上清液作為粗酶液。粗酶液用20%～40%飽和度的硫酸銨鹽析初步純化后于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 甜菊β-葡萄糖苷酶活性的測定 （1）對硝基苯酚（p-nitrophenol，簡稱pNP）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。準(zhǔn)確稱量139.0 mg pNP，用蒸餾水溶解并定容至 1 000 mL。分別吸取1、2、3、4、5、6 mL pNP溶液至100 mL容量瓶中，用1 mol/L Na2CO3溶液定容并將其混勻，使pNP的終濃度分別為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 μmol/L。以蒸餾水為空白對照，在410 nm波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)、pNP濃度為橫坐標(biāo)，繪制pNP標(biāo)準(zhǔn)曲線。β-葡萄糖苷酶活性（U/g）的計算公式如下：

酶活性=Y×V2×VK×V1×m×T。

式中：Y為酶促反應(yīng)的吸光度;V2為總反應(yīng)液體積（mL）;V為酶液的總提取量（mL）;K為對硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率;V1為反應(yīng)體系中的酶液體積（mL）;m為試樣質(zhì)量（g）;T為反應(yīng)時間（min）。

（2）甜菊β-葡萄糖苷酶活性的測定。參考金璐等的研究方法[14]，在同一試管中分別加入600 μL “1.2.2”節(jié)的酶液、200 μL pH值7.0的磷酸緩沖液和200 μL 10 mmol/L 對硝基苯酚-β-D-葡萄糖苷（4-nitrophenyl β-D-glucopyranoside，簡稱pNPG），混勻后置于37 ℃的恒溫水浴鍋內(nèi)反應(yīng)1 h。反應(yīng)結(jié)束后，加入2 mL 1 mol/L Na2CO3終止反應(yīng)。反應(yīng)液于4 000 r/min離心10 min后，取上清液，于410 nm波長處進(jìn)行比色，對加熱失活的酶液進(jìn)行同樣處理作為空白對照。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各樣品β-葡萄糖苷酶的活性。

1.2.4 甜菊糖苷含量的測定 分別取各烘干樣品，于研缽中磨成均勻的細(xì)粉，準(zhǔn)確稱取0.200 g粉末置于15 mL離心管中，再加入10 mL蒸餾水，于沸水浴中提取2 h，然后于4 000 r/min離心10 min，吸取上清液，使用孔徑為0.22 μm的濾膜過濾后，按照GB 8270—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑 甜菊糖苷》中的高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，簡稱HPLC）測定和計算各樣品中甜菊苷、萊鮑迪苷A和以9種組分計的總甜菊糖苷含量。流動相中V乙腈 ∶ V磷酸鈉緩沖液=32 ∶ 68;流速為1.0 mL/min，檢測波長為210 nm，進(jìn)樣量為 20 μL，柱溫為40 ℃。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 本研究中所有試驗均設(shè)3次重復(fù)，用SPSS 17.0和Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同甜菊品種葉片中的β-葡萄糖苷酶活性和甜菊糖苷含量

如圖1所示，在相同生長條件下，不同品種甜菊植株現(xiàn)蕾期葉片中的β-葡萄糖苷酶活性存在顯著差異，其中中山5號、大葉1號的酶活性較高，分別為0.42、0.43 U/g，中山8號的酶活性也較高，為 0.37 U/g，中山6號的酶活性較低，為0.31 U/g，而守田3號、江甜2號的酶活性較其他品種偏低，分別為 0.25、0.24 U/g。

如圖2所示，中山5號、大葉1號甜菊均為高甜菊苷品種，其甜菊苷含量占總苷含量的比例大于90%;中山6號、江甜2號為高萊鮑迪苷A品種，萊鮑迪苷A含量占總苷含量的比例均大于80%;中山6號、中山8號的總苷含量較高，占干葉質(zhì)量的比例均大于15%。

同步分析各品種甜菊葉片的β-葡萄糖苷酶活性、甜菊糖苷含量發(fā)現(xiàn)，高甜菊苷品種中山5號、大葉1號均具有較高的β-葡萄糖苷酶活性。由于目前關(guān)于甜菊糖苷生物合成途徑的研究已經(jīng)明確，甜菊苷作為前體經(jīng)糖基轉(zhuǎn)移酶的催化進(jìn)一步合成萊鮑迪苷A及其他糖苷組分，而萊鮑迪苷A水解掉1個糖基即生成甜菊苷，因此不同甜菊品種的甜菊糖苷組分種類與含量差異可能與其β-葡萄糖苷酶活性的差異有關(guān)。

2.2 中山5號甜菊不同器官中的β-葡萄糖苷酶活性、甜菊糖苷含量

如圖3所示，中山5號甜菊葉片、花中的β-葡萄糖苷酶活性較高，分別為0.56、0.55 U/g;莖中次之，為0.48 U/g;根中最低，僅為0.33 U/g。

由圖4看出，中山5號甜菊葉片中甜菊糖苷含量最高，約占葉干質(zhì)量的13.45%;花中較低，占花干質(zhì)量的 4.24%;莖中含少量糖苷，約占莖干質(zhì)量的0.59%;根中甜菊糖苷含量最低，僅占根干質(zhì)量的0.12%。

同步分析可知，中山5號甜菊的不同器官中β-葡萄糖苷酶活性、甜菊糖苷含量具有相似趨勢，其花序中較高的β-葡萄糖苷酶活性可能與花中有較多β-葡萄糖苷酶參與香氣成分的釋放有關(guān)。

2.3 不同生長時期中山5號甜菊葉片中的β-葡萄糖苷酶活性和甜菊糖苷含量

對中山5號甜菊快速生長期、現(xiàn)蕾期、開花期葉片中的β-葡萄糖苷酶活性進(jìn)行測定，如圖5所示，快速生長期甜菊葉片中的β-葡萄糖苷酶活性為015 U/g，現(xiàn)蕾期甜菊葉片中的β-葡萄糖苷酶活

性為0.42 U/g，開花期甜菊葉片中的β-葡萄糖苷酶活性為0.55 U/g。可見隨著甜菊的生長，其葉片中的β-葡萄糖苷酶活性逐漸增強(qiáng)。

由圖6可以看出，3個生長時期甜菊葉片中的糖苷含量同樣存在差異，其中快速生長期總苷含量約占干質(zhì)量的10.21%;現(xiàn)蕾期糖苷含量最高，約占干質(zhì)量的13.26%;開花期的糖苷含量略有下降，占干質(zhì)量的12.21%。開花期甜菊葉片中的甜菊糖苷含量下降、β-葡萄糖苷酶活性升高，表明兩者之間存在負(fù)相關(guān)，而快速生長期甜菊葉片中的糖苷含量和酶活性都較低的原因可能是植株處于旺盛生長時期，次生代謝產(chǎn)物剛剛開始積累，參與分解代謝的β-葡萄糖苷酶在該時期的活動較少。

3 討論與結(jié)論

3.1 不同品種甜菊葉片中β-葡萄糖苷酶活性和甜菊糖苷含量的差異

本研究選用的6個甜菊品種分別為2個高甜菊苷含量品種、2個高萊鮑迪苷A含量品種和2個中間類型品種。甜菊苷通常是較原始甜菊品種中的主要組分，因其具有后苦味而被淘汰，萊鮑迪苷A等組分因具有更高的甜度和更佳的味質(zhì)而倍受人們歡迎。在甜菊糖苷生物合成途徑中甜菊苷是萊鮑迪苷A及其他糖苷組分的前體物質(zhì)，萊鮑迪苷A水解掉1個葡萄糖基即生成甜菊苷。Nakano等早在1998年就研究發(fā)現(xiàn)，微生物來源的β-葡萄糖苷酶可參與甜菊糖苷的水解，可使甜菊苷水解成甜菊雙糖苷，同時還能將萊鮑迪苷A水解成萊鮑迪苷B[15-16]。本研究結(jié)果表明，不同糖苷含量類型的甜菊植株現(xiàn)蕾期葉片中的β-葡萄糖苷酶活性存在顯著差異，其中高甜菊糖苷品種中山5號、大葉1號均具有較高的β-葡萄糖苷酶活性。因此，不同品種的甜菊糖苷組分種類和含量差異可能與其β-葡萄糖苷酶的功能差異有關(guān)，這為后續(xù)篩選甜菊糖苷特異的β-葡萄糖苷酶活性低的種質(zhì)用于選育高糖苷積累的新品種奠定了理論基礎(chǔ)。

3.2 甜菊不同器官中β-葡萄糖苷酶活性和甜菊糖苷含量的分析

在甜菊中山5號開花期植株的不同器官中，β-葡萄糖苷酶活性與甜菊糖苷含量的變化趨勢較一致，其中葉片中的β-葡萄糖苷酶活性和甜菊糖苷含量均最高，花中次之，莖中較低，根中均為最低。花中的β-葡萄糖苷酶活性與葉片中的β-葡萄糖苷酶活性非常接近，可能與花中有較多β-葡萄糖苷酶參與香氣成分的釋放有關(guān)。植物的香味物質(zhì)通常以糖苷形式儲存，在水解酶作用下逐步釋放[17]，因此β-葡萄糖苷酶在花[13，18-20]、果[21-23]、茶[11，24-26]增香中的應(yīng)用多有報道。

3.3 甜菊不同生長時期葉片中β-葡萄糖苷酶活性和甜菊糖苷含量的分析

對甜菊中山5號3個主要生長時期葉片中β-葡萄糖苷酶活性的檢測結(jié)果表明，β-葡萄糖苷酶活性隨生長發(fā)育的推進(jìn)逐漸升高，這與鐘嫻發(fā)現(xiàn)的平潭水仙中β-葡萄糖苷酶的活性隨水仙花的生長逐漸升高的結(jié)果一致[27]。甜菊糖苷含量隨生長發(fā)育的推進(jìn)先升后降，在現(xiàn)蕾期達(dá)到最高值，這可能因為快速生長期植株處于旺盛生長階段，次生代謝產(chǎn)物剛剛開始積累，同時參與分解代謝的β-葡萄糖苷酶在該時期活動較少;而開花期甜菊葉片開始衰老，分解代謝較為旺盛，使其甜菊糖苷含量逐漸降低。

綜上所述，在甜菊不同品種間，以及相同品種的不同器官和不同生長發(fā)育時期，β-葡萄糖苷酶活性都存在顯著差異，并且與甜菊糖苷含量有一定相關(guān)性。作為甜菊β-葡萄糖苷酶的初步研究結(jié)果，本研究得出，β-葡萄糖苷酶參與甜菊糖苷分解代謝，可為今后甜菊中β-葡萄糖苷酶及其基因的研究奠定基礎(chǔ)。

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