浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院 杭州 310006

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，血管新生既是動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)不穩(wěn)定斑塊形成的關(guān)鍵，又是改善心肌缺血有效的代償途徑[1]。因此，在促進(jìn)缺血心肌區(qū)血管新生和抑制斑塊內(nèi)血管新生的臨床決策中，存在著內(nèi)在的矛盾，如何在治療中兼顧這對(duì)矛盾是現(xiàn)實(shí)存在的難題。目前研究多將兩者孤立開(kāi)來(lái)作為獨(dú)立的對(duì)象，而將兩者結(jié)合進(jìn)行同步研究，國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)有報(bào)道。痰瘀同治(Tanyu Tongzhi，TYTZ)是目前中醫(yī)防治AS和改善心肌缺血的主要治法治則[2-3]。前期工作中已經(jīng)證實(shí)TYTZ方能夠通過(guò)抑制大鼠AS斑塊內(nèi)血管新生，穩(wěn)定并消退AS斑塊[4]；臨床研究也證實(shí)，TYTZ方能夠顯著改善冠心病患者的心肌缺血癥狀[5]，這提示TYTZ方對(duì)AS斑塊內(nèi)和缺血心肌區(qū)的血管新生具有雙向調(diào)節(jié)作用。已知自噬與血管新生關(guān)系密切，不同環(huán)境下的自噬對(duì)血管新生存在不同的作用[6]。因此，本研究擬建立心肌缺血和AS斑塊內(nèi)血管新生的雙靶點(diǎn)小鼠模型，采用CD31免疫組化染色法評(píng)價(jià)TYTZ方對(duì)心肌缺血區(qū)和AS斑塊內(nèi)血管新生的不同作用，同時(shí)觀察自噬標(biāo)志性蛋白微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)Ⅱ/Ⅰ表達(dá)水平的變化，分析其中的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8周齡雄性C57BL/6J小鼠10只，雄性載脂蛋白E基因敲除(Apolipoprotein E gene Knockout，ApoE-/-)小鼠20只，體重均為20～24g，由上海斯萊克公司提供［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(滬)2017-0005］，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心屏障環(huán)境實(shí)驗(yàn)室［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(浙)2018-0012］。實(shí)驗(yàn)期間，遵循3R原則給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物人道主義關(guān)懷，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查號(hào)［ZSLL-2017-107］。

1.1.2 藥物與試劑 TYTZ方由石菖蒲、全瓜蔞、陳皮、薤白、丹參、水蛭、郁金、茯苓組成，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)制劑中心加工為流浸膏，含生藥2g·mL-1。異丙腎上腺素原藥購(gòu)自美國(guó)Sigma公司 (批號(hào)：SLBH1026V)；抗LC3Ⅱ/Ⅰ抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司(批號(hào)：ab48394)；CD31鼠單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司(批號(hào)：3528S)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組、造模與給藥方法 取ApoE-/-小鼠20只，隨機(jī)分為模型對(duì)照組和TYTZ組，每組10只，飼喂高脂飼料 (小鼠基礎(chǔ)飼料+15%豬油+1.25%膽固醇)；另取C57BL/6J小鼠10只作為正常對(duì)照組，飼喂基礎(chǔ)飼料。飼喂4周后，模型對(duì)照組和TYTZ組腹部皮下多點(diǎn)注射100mg/kg異丙腎上腺素針，持續(xù)2d；正常對(duì)照組皮下注射等量0.9%氯化鈉注射液。造模成功后4周分別開(kāi)始藥物干預(yù)，根據(jù)人與小鼠的換算系數(shù)決定給藥劑量，按TYTZ方成人劑量換算后的小鼠等效劑量的5倍，TYTZ組給予TYTZ方流浸膏2 145mg/(kg·d)灌胃(蒸餾水稀釋成0.4mL)；模型對(duì)照組和正常對(duì)照組給予等量蒸餾水灌胃，均連續(xù)給藥6周。

1.2.2 標(biāo)本取材 試驗(yàn)結(jié)束后，過(guò)量麻醉處死動(dòng)物，開(kāi)胸后小心分離并剪取心臟及整條主動(dòng)脈。主動(dòng)脈分段橫切留存，心臟按短軸面留取心肌標(biāo)本，模型對(duì)照組和TYTZ組留取心肌梗死邊緣區(qū)組織送檢。各組標(biāo)本分類(lèi)編號(hào)，一部分放入液氮凍存，另一部分直接冷凍切片。

1.2.3 免疫組化檢測(cè)各組心肌和主動(dòng)脈新生血管密度 對(duì)各組標(biāo)本行內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物CD31染色，內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)染為棕黃色即為陽(yáng)性表達(dá)。以Imaging System檢測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞平均光密度值(mean optical density，MOD)，作為評(píng)價(jià)新生血管密度的定量指標(biāo)。

1.2.4 Western blot檢測(cè)各組心肌和主動(dòng)脈的LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)水平 提取病理組織總蛋白后采用Western blot測(cè)定各組LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白的表達(dá)，以凝膠圖象處理系統(tǒng)分析各組目的蛋白條帶與內(nèi)參照β-actin蛋白條帶的比值，即為L(zhǎng)C3Ⅱ/Ⅰ蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有數(shù)據(jù)以±s表示，兩組之間均數(shù)比較采用Bonferroni檢驗(yàn)，多組之間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組心肌組織內(nèi)新生血管密度比較 免疫組化染色顯示，TYTZ組新生血管表達(dá)最豐富。與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組及TYTZ組的CD31表達(dá)均顯著增加(P＜0.05)；與模型對(duì)照組比較，TYTZ組CD31表達(dá)明顯增加(P＜0.05)。見(jiàn)圖1、2。

2.2 各組主動(dòng)脈新生血管密度比較 免疫組化染色顯示，與正常對(duì)照組比較，TYTZ組與模型對(duì)照組CD31表達(dá)均明顯增加(P＜0.05)；而與模型對(duì)照組比較，TYTZ組的CD31表達(dá)則明顯減低(P＜0.05)。見(jiàn)圖3、4。

圖1 各組心肌組織CD31免疫組化染色(100×)Fig.1 The imaging of myocardial tissue with CD31 immunohistochemical staining in each group(100×)

2.3 各組心肌組織LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)比較 與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組和TYTZ組的LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)均明顯增高(P＜0.05)；與模型對(duì)照組比較，TYTZ組的LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)明顯增高(P＜0.05)。見(jiàn)圖5。

2.4 各組主動(dòng)脈LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)比較 與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組的LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)水平明顯增高(P＜0.05)；與模型對(duì)照組比較，TYTZ組的LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)水平顯著降低(P＜0.05)。見(jiàn)圖6。

3 討論

圖2 各組心肌組織新生血管密度比較Fig.2 The density of neovascularization of myocardial tissue in each group

圖3 各組主動(dòng)脈CD31免疫組化染色(100×)Fig.3 The imaging of aorta with CD31 immunohistochemical staining in each group(100×)

血管新生一方面是改善心肌缺血的有價(jià)值的補(bǔ)償手段，另一方面又是導(dǎo)致AS斑塊不穩(wěn)定的核心因素，血管新生的兩方面作用正逐漸吸引著研究者的興趣。在臨床工作中，當(dāng)一項(xiàng)干預(yù)措施具有拮抗AS斑塊內(nèi)新生血管的作用時(shí)，它也可能具有抑制缺血心肌內(nèi)微血管形成的不良作用；或者當(dāng)一項(xiàng)干預(yù)措施有利于缺血心肌內(nèi)微血管形成時(shí)，它同樣也可能促進(jìn)AS斑塊內(nèi)新生血管形成，從而加重斑塊的不穩(wěn)定性。所以臨床醫(yī)師必須意識(shí)到，在臨床上已經(jīng)被廣泛應(yīng)用的各種抗心肌缺血的中藥制劑，或是在腫瘤治療中各種抗血管新生的藥物，都存在安全性風(fēng)險(xiǎn)[7]。目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者多將AS斑塊或缺血心肌內(nèi)的血管新生孤立開(kāi)來(lái)，分別對(duì)其進(jìn)行研究。而將兩種不同病理環(huán)境中的血管新生結(jié)合在同一動(dòng)物模型中，同步研究一種干預(yù)措施對(duì)兩者的不同作用，國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)于報(bào)道。

圖4 各組主動(dòng)脈新生血管密度比較Fig.4 The density of neovascularization in aorta in each group

圖5 各組心肌組織LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)比較Fig.5 Comparison of LC3Ⅱ/Ⅰ protein expression of myocardial tissue in each group

圖6 各組主動(dòng)脈LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)比較Fig.6 Comparison of LC3Ⅱ/Ⅰ protein expression of aorta in each group

自噬與血管新生關(guān)系密切。體外研究發(fā)現(xiàn)，阻斷自噬發(fā)生可阻斷血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子介導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞遷移和管型形成，抑制血管新生[8]。反之，通過(guò)上調(diào)自噬信號(hào)分子能夠激活血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2，促進(jìn)新生血管形成[9]。上述研究表明，激活自噬能夠促進(jìn)血管新生，而下調(diào)自噬水平則抑制血管新生。但在腫瘤內(nèi)病理性血管新生的研究提示，內(nèi)皮抑素在上調(diào)自噬水平的同時(shí)卻能夠抑制腫瘤內(nèi)病理性血管新生[10]。自噬究竟是抑制還是促進(jìn)血管新生，與自噬存在的兩面性有關(guān)，只有恰當(dāng)水平的自噬才能發(fā)揮其保護(hù)作用，這也可以說(shuō)明自噬對(duì)血管生成的影響[11]。國(guó)內(nèi)外關(guān)于自噬的研究目前多局限于腫瘤和眼底病理性血管新生領(lǐng)域，而有關(guān)自噬是否參與心肌缺血區(qū)或AS斑塊內(nèi)血管新生的研究目前尚未見(jiàn)報(bào)道。

TYTZ是中醫(yī)防治AS和改善心肌缺血的主要治法治則[2-3]。本課題組在經(jīng)典古方“瓜萎薤白半夏湯”和“血府逐瘀湯”基礎(chǔ)上，結(jié)合長(zhǎng)期臨證經(jīng)驗(yàn)總結(jié)形成了TYTZ方，方劑組成包括全瓜蔞、薤白、石菖蒲、郁金、丹參、水蛭、茯苓、陳皮，具有除濕祛痰、活血化瘀之功效。前期研究證實(shí)，TYTZ方具有抑制AS斑塊內(nèi)血管新生的作用[4]。長(zhǎng)期大量的臨床實(shí)踐也發(fā)現(xiàn)，TYTZ方對(duì)冠心病痰瘀互結(jié)證具有顯著的臨床療效[5]。這些研究提示TYTZ方對(duì)AS斑塊內(nèi)和缺血心肌區(qū)的血管新生可能存在雙向調(diào)節(jié)作用，但其中作用機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

采用皮下多點(diǎn)注射異丙腎上腺素針的方法對(duì)ApoE-/-小鼠進(jìn)行干預(yù)，本研究團(tuán)隊(duì)在國(guó)內(nèi)外首次成功建立了心肌缺血和AS斑塊內(nèi)血管新生的雙靶點(diǎn)小鼠模型[12]。進(jìn)一步對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物CD31進(jìn)行免疫組化染色，檢測(cè)了TYTZ方對(duì)單一實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)心肌缺血區(qū)和AS斑塊內(nèi)新生血管密度的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在心肌缺血區(qū)，TYTZ組CD31表達(dá)明顯高于模型對(duì)照組；而在主動(dòng)脈斑塊中，TYTZ組CD31表達(dá)明顯低于模型對(duì)照組，證實(shí)了TYTZ方在抑制AS斑塊內(nèi)血管新生的同時(shí)能夠促進(jìn)心肌缺血區(qū)的血管新生。

LC3Ⅱ/Ⅰ是最早發(fā)現(xiàn)的自噬標(biāo)志性蛋白，LC3Ⅱ/Ⅰ的表達(dá)量與自噬小體數(shù)量正相關(guān)，是反映細(xì)胞自噬活性的關(guān)鍵指標(biāo)，也是目前最常用的自噬水平檢測(cè)標(biāo)志物[13]。本研究結(jié)果顯示，模型對(duì)照組心肌組織中LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)水平顯著高于正常對(duì)照組，而TYTZ組的LC3Ⅱ/Ⅰ表達(dá)水平又顯著高于模型對(duì)照組，這提示TYTZ方通過(guò)進(jìn)一步上調(diào)自噬蛋白表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)心肌缺血區(qū)內(nèi)血管新生；在主動(dòng)脈中，模型對(duì)照組的LC3Ⅱ/Ⅰ表達(dá)水平顯著高于正常對(duì)照組，TYTZ組的LC3Ⅱ/Ⅰ表達(dá)水平則低于模型對(duì)照組，這提示激活自噬也能夠促進(jìn)AS斑塊內(nèi)血管新生，而TYTZ方通過(guò)下調(diào)斑塊內(nèi)自噬蛋白表達(dá)水平，抑制斑塊內(nèi)血管新生。而且本研究提示，自噬蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ表達(dá)水平與血管新生程度相應(yīng)。

上述研究結(jié)果表明，TYTZ方對(duì)心肌缺血區(qū)和AS斑塊內(nèi)的自噬水平存在雙向調(diào)節(jié)作用，這可能是該方對(duì)血管新生雙向調(diào)節(jié)作用的重要機(jī)制。