馮保云 李蓉 賴鐘雄 林玉玲

摘 ?要：為研究文心蘭熱激蛋白70基因（命名為OnHSP70）的分子特性及表達(dá)特點(diǎn)，以文心蘭‘檸檬綠（Oncidium hybridum ‘Honey Angel）為材料，采用RT-PCR技術(shù)克隆OnHSP70，利用生物信息學(xué)方法分析其分子特性，通過qRT-PCR技術(shù)分析其在不同組織及不同非生物脅迫處理下的表達(dá)特點(diǎn)。生物信息學(xué)分析表明：該基因開放閱讀框?yàn)?944 bp，編碼647個(gè)氨基酸，翻譯的蛋白為穩(wěn)定蛋白，屬于HSP70超家族，其蛋白二級結(jié)構(gòu)由41.11%的α-螺旋、17.77%的延伸鏈、7.73%的β-轉(zhuǎn)角和33.38%的無規(guī)卷曲組成，具有2個(gè)高度保守的功能域。聚類分析表明：該蛋白與鐵皮石斛和深圳擬蘭的HSP70親緣關(guān)系較近。qRT-PCR分析表明：文心蘭HSP70在4種不同組織器官中具有表達(dá)差異性，在花中的表達(dá)量最高;高溫處理后基因的表達(dá)量明顯上升;40 ℃高溫脅迫4 h時(shí)表達(dá)量達(dá)峰值;茉莉酸甲酯及水楊酸處理時(shí)表達(dá)量呈現(xiàn)下調(diào)響應(yīng)。本研究為后期該基因功能研究及提高文心蘭對高溫的適應(yīng)性提供理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：文心蘭;HSP70;克隆;非生物脅迫;表達(dá)分析

中圖分類號：Q786;Q949.718.43 ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Abstract： In order to study the molecular characteristics of the heat shock protein gene （named OnHSP70） and its expression patterns in O. hybridum ‘Honey Angel， OnHSP70 was cloned by RT-PCR， its molecular characteristics was analyzed by bioinformatics， and its expression patterns in different tissues and under different abiotic stress treatment were carried out by qRT-PCR. Bioinformatics analysis showed that the open reading frame of the gene was 1944 bp， encoding 647 amino acids， and the translated protein was a stable protein belonging to the HSP70 superfamily. The secondary structure of the protein consisted of 41.11% α-helix， 17.77% extended chain， 7.73% β-turn and 33.38% random coil， and had two highly conserved functional domains. Clustering analysis showed the protein had closely relative to HSP70 from Dendrobium catenatum and Apostasia shenzhenica. qRT-PCR analysis showed OnHSP70 differentially expressed in four tissues and the highest expression level was found in flowers; the expression of OnHSP70 gene increased significantly after high temperature treatment， and reached the peak under 40 ℃ for 4 h treatment; OnHSP70 showed down-regulated under methyl jasmonate and salicylic acid treatment. The study would provide a theoretical basis for studying the gene function and improving the adaptability to high temperature of Oncidium hybridum.

Keywords： Oncidium hybridum; HSP70; cloning; abiotic stress; expression analysis

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.04.016

文心蘭（Oncidium hybridum）是蘭科（Orchi-daceae）文心蘭屬（Oncidium），又名吉祥蘭、舞女蘭、金蝶蘭等。起源于美洲熱帶地區(qū)，喜濕潤和半陰環(huán)境，屬于熱帶氣生蘭。植株輕盈、花莖自然下垂、花朵奇特、靜時(shí)形似優(yōu)雅舞者，動(dòng)又如翩翩金蝶，是世界重要的切花和盆花種類之一，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。商業(yè)用文心蘭多為花色優(yōu)美、常年開花的優(yōu)良雜交種。文心蘭生長發(fā)育進(jìn)程受溫度影響較大，福建省地處東南沿海，屬于溫暖濕潤的亞熱帶氣候，是文心蘭的適宜栽植區(qū)，但不同區(qū)域氣候差異性較大。福州等地夏季持續(xù)35 ℃以上高溫，極易導(dǎo)致植株生長發(fā)育不良，不僅會(huì)影響當(dāng)季切花的質(zhì)量，而且高溫易造成假鱗莖皺縮[1]，從而影響秋、冬季開花的產(chǎn)量和品質(zhì)，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，并且隨著溫室效應(yīng)的加劇，極端高溫天氣頻發(fā)，提高文心蘭植株的抗高溫能力是育種與栽培的研究目標(biāo)之一[2]。

熱激蛋白（heat shock protein， HSP），又稱為熱休克蛋白。當(dāng)生物有機(jī)體受到多種生物（病害等）或非生物脅迫時(shí)（如高溫、冷害等）會(huì)使其基因表達(dá)增強(qiáng)[3-4]，是生物有機(jī)體最保守的保護(hù)機(jī)制之一。1962年在果蠅研究中，熱激蛋白被首次發(fā)現(xiàn)，之后大量實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明熱激蛋白功能廣泛。一般地，HSPs作為分子伴侶參與蛋白質(zhì)的折疊與去折疊，協(xié)助蛋白質(zhì)正確裝配，參與蛋白質(zhì)運(yùn)輸和降解[5]。按分子量的大小可將HSPs分為：HSP100、HSP90、HSP70、HSP60、HSP40和小分子HSP等6個(gè)超基因家族。其中HSP70是在生物體內(nèi)分布最廣、研究最多且在熱激蛋白家族中進(jìn)化上最保守的一類熱激蛋白，根據(jù)功能不同可將HSP70分為：參與哺乳動(dòng)物細(xì)胞功能的結(jié)構(gòu)型熱激蛋白HSP73、參與多種脅迫響應(yīng)的誘導(dǎo)型熱激蛋白HSP72、定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的葡萄糖結(jié)合蛋白GRP75以及定位于線粒體的GRP75等[6]。關(guān)于植物HSP70的研究起步較晚。近年來發(fā)現(xiàn)，HSP70主要分布于細(xì)胞質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體和葉綠體中[7]，不僅與植物的生長發(fā)育有關(guān)[8-12]，還參與植物的非生物脅迫及病害脅迫響應(yīng)[13-15]。通過對HSP70功能的相關(guān)研究，有望利用基因工程育種提高作物的抗逆性，但HSP70在植物中的分子伴侶作用機(jī)制和脅迫相關(guān)響應(yīng)的機(jī)理還有待進(jìn)一步的探究發(fā)現(xiàn)。

HSP70屬于誘導(dǎo)型熱激蛋白，在正常細(xì)胞內(nèi)表達(dá)量較低，應(yīng)激脅迫下能被高度誘導(dǎo)，修復(fù)錯(cuò)誤折疊蛋白或降解已損傷的蛋白質(zhì)以維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，提高植物對逆境的耐受性[16-18]。迄今為止，對蘭科植物HSP70的研究均側(cè)重于其對冷脅迫的作用。4 ℃低溫脅迫能夠顯著誘導(dǎo)鐵皮石斛[19]和蝴蝶蘭[20]HSP70的表達(dá)，且能維持一段時(shí)間的高表達(dá)量;孔倩倩[21]研究發(fā)現(xiàn)，水楊酸處理對高溫脅迫下文心蘭生理生化作用的影響，但文心蘭HSP70對高溫脅迫和激素處理（水楊酸、茉莉酸甲酯）的響應(yīng)情況尚未見有關(guān)報(bào)道。因此，本研究以文心蘭‘檸檬綠（Oncidium hybridum‘Honey Angel）為材料，克隆獲得文心蘭HSP70，利用qRT-PCR技術(shù)對不同組織部位及不同非生物脅迫處理下文心蘭HSP70進(jìn)行表達(dá)分析，以期為研究文心蘭熱激蛋白功能及其在遭受逆境脅迫過程中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

本研究以文心蘭‘檸檬綠為材料（由福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所提供），進(jìn)行文心蘭開花期不同組織部位和苗期不同脅迫的處理。其中，不同組織部位包括根、假鱗莖、葉片和花;溫度處理為將文心蘭置于25（正常生長溫度）、30、35、40 ℃處理24 h后進(jìn)行整株取樣;高溫處理為將文心蘭置于40 ℃培養(yǎng)條件下，于處理后0、4、8、24 h后進(jìn)行整株取樣;水楊酸處理為0.5 mmol/L的SA噴灑文心蘭葉片，于0、1、3、6、12、24、48 h進(jìn)行葉片取樣;茉莉酸甲酯處理為0.2 mmol/L的MeJA噴灑文心蘭葉片，于0、1、3、6、12、24、48 h進(jìn)行葉片取樣。上述處理均重復(fù)3次，取材后用液氮速凍，并放置?80 ℃冰箱中備用。上述材料處理方法參照李蓉等[22]文獻(xiàn)。

1.2 ?方法

1.2.1 ?文心蘭總RNA提取及其cDNA第一鏈合成 ?參照Invitrogen公司的TRIzol試劑盒說明書分別提取文心蘭的各個(gè)組織部位及不同處理的總RNA。采用Thermo超微量核酸檢測儀測定RNA濃度，再用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的純度和濃度。采用SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit試劑盒（TaKaRa）和PrimeScriptTM RT Reagent Kit 試劑盒（TaKaRa）逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，分別用于基因克隆和qRT-PCR分析。

1.2.2 ?OnHSP70基因的篩選與克隆 ?從NCBI數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站獲得1條石斛HSP70的cDNA序列，登錄號為XP_020694708.1。根據(jù)此cDNA序列設(shè)計(jì)引物OnHSP70-ORF-F和OnHSP70-ORF-R（表1）。以文心蘭‘檸檬綠的cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增該基因的ORF序列。以上引物均由福州尚亞生物技術(shù)有限公司合成。

PCR擴(kuò)增體系共25 μL：DreamTaq? Green PCR Master Mix （2） 12.5 μL、ddH2O 9.5 μL、cDNA 1 μL、OnHSP70-ORF-F 1 μL、OnHSP70- ORF-R 1 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃ 5 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 20 s，循環(huán)數(shù)為35，最后72 ℃延伸5 min。參照Gel/PCR Extraction Kit試劑盒說明書將獲得的目的片段進(jìn)行回收，用pMD18-T載體連接10 h后轉(zhuǎn)入T1中，進(jìn)行TA克隆并挑選陽性克隆菌落搖菌，然后進(jìn)行菌液PCR擴(kuò)增，凝膠電泳比對后將有目的條帶的菌液送至上海鉑尚生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.3 ?OnHSP70生物信息學(xué)分析 ?通過NCBI中CDD在線工具進(jìn)行OnHSP70保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測;同源性分析使用DNAMAN 6.0軟件進(jìn)行氨基酸序列的多重比對，聚類分析時(shí)采用 MEGA6.0中的NJ法（Neighbor-joining）進(jìn)行HSP70基因進(jìn)化樹的構(gòu)建。利用ExPASy-ProtParam tool分析蛋白的基本理化性質(zhì)，用TMHMM Server 分析跨膜結(jié)構(gòu)域，通過 SignalP 4.1 Server預(yù)測信號肽，NetPhos預(yù)測磷酸化位點(diǎn)，LocTree 3預(yù)測蛋白亞細(xì)胞定位;利用 SOP-MA預(yù)測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)，用SWISS-MODEL 預(yù)測蛋白三級結(jié)構(gòu)[23]。

1.2.4 ?qRT-PCR分析 ?利用羅氏LightCycler 480儀器，通過qRT-PCR檢測OnHSP70基因在文心蘭不同組織部位和不同脅迫處理下的表達(dá)情況。根據(jù)已獲得序列，按照qRT-PCR引物設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)特異性引物OnHSP70-qRT-F和OnHSP70- qRT-R（表1）。采用SYBR? Premix Ex Taq? II Kit（TaKaRa）進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系共20 μL：SYBR II酶10 μL、sdH2O 7.4 μL、cDNA 1 μL、上下游引物各0.8 μL。qRT-PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，循環(huán)數(shù)為45次。

1.3 ?數(shù)據(jù)處理

通過2-?ΔCT法計(jì)算獲得OnHSP70的相對表達(dá)量[22]。用SPSS 19.0對OnHSP70的表達(dá)量進(jìn)行差異顯著性分析，再用Excel畫圖。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?OnHSP70基因的克隆

以文心蘭‘檸檬綠cDNA為模板，擴(kuò)增OnHSP70基因的開放閱讀框，測序結(jié)果得到1條1994 bp片段（登錄號：MT133659;圖1），包含以ATG為起始密碼子，以TAG為終止密碼子的ORF共1944 bp，編碼647個(gè)氨基酸（圖2）。該基因編碼的氨基酸序列具有3部分HSP70家族的特征序列：IDLGTTYS、IFDLGGGTFDVSLL和VLVGGSTRIPRVQQ;指紋序列VPAYFND以及C末端典型的特征基序EEVD[24]。由克隆得到的基因所推出的氨基酸序列在NCBI上進(jìn)行BLASTp分析，發(fā)現(xiàn)與其它植物的HSP70具有90%以上的相似性;NCBI-CDS預(yù)測該蛋白在1～647肽鏈區(qū)間具有HSP70和Dnak等結(jié)構(gòu)域，屬于HSP70超家族（圖3），這些結(jié)果表明克隆得到的基因?yàn)槲男奶m的HSP70基因，將其命名為OnHSP70。

2.2 ?OnHSP70聚類分析與氨基酸同源性分析

采用MEGA6.0鄰位歸并法，以文心蘭、鐵皮石斛、鳳梨、煙草和柑橘等20種植物HSP70基因編碼的氨基酸序列為基礎(chǔ)進(jìn)行聚類分析。結(jié)果表明，單子葉植物與雙子葉植物的HSP70在進(jìn)化方向上沒有顯著差別，OnHSP70在進(jìn)化上與鐵皮石斛和深圳擬蘭的進(jìn)化方向一致性較高，但與蝴蝶蘭的進(jìn)化方向有一定差距（圖4）。將進(jìn)化樹中蘭科植物（文心蘭、鐵皮石斛、深圳擬蘭和蝴蝶蘭）及模式植物（擬南芥、水稻和煙草）的氨基酸序列進(jìn)行多重比對后，結(jié)果顯示其整體一致性為94.4%，且該蛋白氨基酸序列N端的保守性高于C端，C端最后100個(gè)氨基酸變化很大，但C末端均存在高度保守的基序結(jié)構(gòu)EEVD（圖5）。

2.3 ?OnHSP70理化性質(zhì)的生物信息學(xué)分析

OnHSP70理化性質(zhì)的生物信息學(xué)分析表明：HSP70分子式為C3104H5006N856O992S25，原子數(shù)為9983個(gè)，分子量為70.99 kDa，正電氨基酸（Arg+ Lys）殘基數(shù)為82個(gè)，負(fù)電氨基酸（Asp+Glu）殘基數(shù)為102個(gè)，理論等電點(diǎn)PI為5.06。平均親水性系數(shù)為?0.402，脂溶性系數(shù)為83.37，不穩(wěn)定系數(shù)為32.55，屬于親水性的穩(wěn)定蛋白。SignalP 4.1 Server 預(yù)測OnHSP70不含信號肽，表明其不屬于分泌蛋白。LocTree 3預(yù)測該蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)中（可信度為95%）;跨膜螺旋結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)OnHSP70有由內(nèi)向外4個(gè)和由外向內(nèi)3個(gè)跨膜螺旋結(jié)構(gòu)。磷酸化位點(diǎn)分析結(jié)果顯示：OnHSP70共有51個(gè)磷酸化位點(diǎn)，包括21個(gè)Ser位點(diǎn)，23個(gè)Thr位點(diǎn)和7個(gè)Tyr位點(diǎn)。二級結(jié)構(gòu)分析顯示（圖6）：OnHSP70有41.11%的α-螺旋（α-helices），17.77%的延伸鏈（extended strand），7.73%的β-轉(zhuǎn)角（β-turn）以及33.38%的無規(guī)則卷曲（random coil）。蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)如圖7所示。

2.4 ?不同組織器官中OnHSP70的表達(dá)分析

以Actin為內(nèi)參基因，分析了OnHSP70在文心蘭不同組織器官的表達(dá)模式。qRT-PCR結(jié)果表明，OnHSP70在文心蘭的根、莖、葉和花中均有表達(dá)，其在花中的表達(dá)量最高，約為其他器官表達(dá)量的9～12倍，與其他器官的表達(dá)量有顯著差異（圖8）。

2.5 ?溫度處理下OnHSP70的表達(dá)分析

以正常培養(yǎng)溫度（25 ℃）的文心蘭為對照，分析高溫條件下OnHSP70的表達(dá)情況。結(jié)果如圖9所示，以常溫下OnHSP70的表達(dá)量為對照，該基因在30 ℃處理時(shí)輕微下調(diào)響應(yīng)，但與對照組差異不顯著，而30 ℃到40 ℃時(shí)呈顯著上調(diào)響應(yīng)，尤其是40 ℃時(shí)該基因表達(dá)量為對照的9.5倍（圖9）。40 ℃處理不同時(shí)間的文心蘭中，OnHSP70在4 h時(shí)表達(dá)量達(dá)最高值，隨后表達(dá)量不斷下降，但是一直處于上調(diào)表達(dá)狀態(tài)（圖10）。

2.6 ?茉莉酸甲酯和水楊酸處理下OnHSP70的表達(dá)分析

以未噴施激素的文心蘭葉片作為對照，分析茉莉酸甲酯及水楊酸處理不同時(shí)長后的表達(dá)情況。用0.2 mmol/L的茉莉酸甲酯處理后，OnHSP70整體呈現(xiàn)下調(diào)響應(yīng)，且6 h的表達(dá)量出現(xiàn)波動(dòng)，整體來看處理時(shí)間越長表達(dá)量越低（圖11）。0.5 mmol/L的水楊酸處理初期（1 h時(shí)）表達(dá)量升高，且在處理1 h時(shí)有明顯的單峰響應(yīng)，其相對表達(dá)量約為對照組的1.38倍，隨后逐漸下降，隨著處理時(shí)長增加相對表達(dá)量逐漸下降（圖11）。

3 ?討論

3.1 ?OnHSP70分子特性分析

植物熱激蛋白是植株在應(yīng)激狀態(tài)下產(chǎn)生的一類與抗逆性有關(guān)的蛋白。HSP70熱激蛋白是HSPs家族中的重要一員，在自然界所有生物體中廣泛存在并且高度保守[2]。本研究克隆獲得的OnHS?- P??70，與鐵皮石斛和深圳擬蘭的HSP70同源性較高。盡管不同物種在進(jìn)化上具有顯著差異性，但是HSP70基因在植物中的進(jìn)化是保守的[25]，該家族成員都含有1個(gè)N端核酸結(jié)合區(qū)（nucleotide約45 kDa的核酸結(jié)合區(qū)，能夠水解ATP，C端存在約25 kDa的底物結(jié)合區(qū)可以與多肽底物暴露在外部未折疊的疏水域特異性結(jié)合，SBD和NBD通過一絞合鏈結(jié)構(gòu)連接，發(fā)揮分子伴侶功能[26-28]。在HSP70亞家族中不同定位的蛋白質(zhì)氨基酸C末端有特定的高度保守序列，如PECDVLDADFT?DSK、PEAEYEEAKK、EEVD和HDEL分別定位于質(zhì)體、線粒體、細(xì)胞質(zhì)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。本研究中文心蘭OnHSP70基因編碼蛋白的C末端具有典型的特征基序EEVD，蛋白質(zhì)定位分析顯示其存在于細(xì)胞質(zhì)中，與細(xì)胞質(zhì)型HSP70蛋白結(jié)構(gòu)特點(diǎn)相一致[29]。推測OnHSP70能夠在逆境脅迫時(shí)通過調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理功能，作為分子伴侶參與蛋白質(zhì)的正確裝配，以維持蛋白質(zhì)的特定構(gòu)象[30]。

3.2 ?OnHSP70在不同組織器官中的表達(dá)具有差異性

熱激蛋白作為看家蛋白參與植物的生長發(fā)育過程，因此在不同組織部位中均有表達(dá)，但是細(xì)胞質(zhì)型HSP70在不同物種的不同組織器官中的表達(dá)量具有較大的差異性。在臘梅成熟葉中HSP70的表達(dá)量最高[24];在蝴蝶蘭根中該基因表達(dá)水平最高，花中表達(dá)水平最低[20];在紫花苜蓿研究中發(fā)現(xiàn)，該基因在花中表達(dá)量明顯高于其他器官[31]。本研究對OnHSP70表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，其在文心蘭不同器官中均有表達(dá)，在花中響應(yīng)最顯著。此結(jié)果與紫花苜蓿的研究結(jié)果相一致，而與同為蘭科的蝴蝶蘭差異較大，原因可能是蝴蝶蘭開花需要進(jìn)行低溫春化，而文心蘭則在較高溫度仍能正常開花。推測該基因在文心蘭花發(fā)育階段起重要作用，參與文心蘭花形態(tài)建成。

3.3 ?高溫能顯著誘導(dǎo)OnHSP70的表達(dá)

已有大量的研究表明溫度與HSP70的表達(dá)密切相關(guān)。高溫脅迫能促進(jìn)小麥[32]、海帶[33]、水稻[34-35]、玉米[36]、花生[37]、豌豆[38]、煙草[39]和紫莖澤蘭[30]等HSP70的表達(dá)，說明HSP70在逆境中發(fā)揮其分子伴侶作用，通過維持植物生長發(fā)育相關(guān)蛋白的穩(wěn)定構(gòu)象，提高植株應(yīng)對不利環(huán)境的能力。本研究表明，高溫對OnHSP70的表達(dá)存在非常明顯的誘導(dǎo)作用，高溫雖不利于有機(jī)體大部分蛋白質(zhì)的合成，但OnHSP70為穩(wěn)定蛋白，在脅迫初期該基因的應(yīng)激響應(yīng)顯著，能通過短時(shí)間內(nèi)的大量表達(dá)以修復(fù)因高溫變性或合成受阻的蛋白質(zhì)，從而保護(hù)其它蛋白質(zhì)免受傷害，適應(yīng)高溫環(huán)境，降低植株的損傷[40]。隨著處理時(shí)長的增加，OnHSP70后期響應(yīng)呈現(xiàn)下降趨勢，這與HSP70在其他植物中的研究結(jié)果一致。推測原因是熱激基因長時(shí)間處于較高的表達(dá)狀態(tài)不利于植株的生長[41-42]。因此，在緩解了植物高溫脅迫造成的不良影響后，HSP70的表達(dá)量就會(huì)下降。

3.4 ?水楊酸和茉莉酸甲酯處理OnHSP70的響應(yīng)情況

水楊酸和茉莉酸甲酯都能夠作為信號分子對逆境作出應(yīng)答反應(yīng)，誘導(dǎo)合成、參與和調(diào)控植物的多種生理生化過程，從而提高植物的抗逆性。已有研究結(jié)果表明，水楊酸與香蕉[43]、水稻[34]、玉米[36]、蝴蝶蘭[44]等幼苗耐熱性的形成有關(guān);水楊酸可以通過調(diào)節(jié)植物體內(nèi)脯氨酸含量緩解高溫脅迫對龍須菜產(chǎn)生的不利影響[45-46]。鄒清成等[47]通過對蝴蝶蘭的研究表明，茉莉酸甲酯作為生物調(diào)節(jié)劑能夠提高幼苗抗逆性;茉莉酸甲酯還可以通過調(diào)節(jié)水稻葉片胡蘿卜素含量緩解孕穗期的高溫傷害[48]。本研究OnHSP70對茉莉酸甲酯呈現(xiàn)明顯下調(diào)響應(yīng)，在水楊酸誘導(dǎo)1 h時(shí)上調(diào)響應(yīng)，之后表達(dá)量下降，整體呈現(xiàn)先上調(diào)后下調(diào)的響應(yīng)特征?？赡苁怯捎谒畻钏岷蛙岳蛩峒柞ピ谧鳛樾盘柗肿诱{(diào)節(jié)植物抗性作用途徑時(shí)相對獨(dú)立，且HSP70的抗逆作用機(jī)制與水楊酸和茉莉酸甲酯存在協(xié)同作用[49]。

綜上所述，OnHSP70由647個(gè)氨基酸構(gòu)成，是穩(wěn)定蛋白，屬于HSP70超家族，具有1個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)域，且C末端存在EEVD序列，蛋白亞細(xì)胞定位于細(xì)胞質(zhì)。盡管不同植物的HSP70在進(jìn)化方向差異較大，但通過同源性分析顯示OnHSP70與其他植物的氨基酸序列具有極高的相似度。OnHSP70表達(dá)模式分析表明：該基因在文心蘭的不同組織部位中均有表達(dá)，且具有顯著差異性，在花中表達(dá)量最高;該基因能夠顯著響應(yīng)高溫脅迫，尤其在40 ℃處理4 h時(shí)表達(dá)量達(dá)峰值;該基因?qū)λ畻钏岷蛙岳蛩峒柞コ尸F(xiàn)出不同的響應(yīng)特征，但整體呈現(xiàn)出下調(diào)的趨勢。上述結(jié)果說明，OnHSP70在文心蘭生長發(fā)育過程中發(fā)揮作用，且參與文心蘭對環(huán)境脅迫的適應(yīng)性，為該基因功能的研究及提高文心蘭對高溫的適應(yīng)性提供參考，本試驗(yàn)研究結(jié)果也對后期開展文心蘭耐高溫品種的選育具有積極意義。

參考文獻(xiàn)

[1] 羅遠(yuǎn)華， 王振波， 黃敏玲， 等. 高溫脅迫對文心蘭頂葉若干生理指標(biāo)的影響[J]. 福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2017， 32（6）： 625-629.

[2] 楊 ?學(xué)， 葉 ?煒， 李永清， 等. 南茜文心蘭軟腐病病原分離鑒定及致病性分析[J]. 亞熱帶植物科學(xué)， 2017， 46（3）： 201-208.

[3] S Lindquist A， Craig E A. The heat-shock proteins[J]. Annual Review of Genetics， 1988， 22（3）： 631-677.

[4] 王明強(qiáng)， 張道遠(yuǎn). 植物熱激蛋白70基因家族及其生物學(xué)功能研究進(jìn)展[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)， 2015， 34（2）： 421-428.

[5] Ritossa F. A new puffing pattern induced by temperature shock and DNP in Drosophila[J]. Experientia， 1962， 18（12）： 571-573.

[6] Welch W J. Mammalian stress response： cell physiology， structure/function of stress proteins， and implications for medicine and disease[J]. Physiological Reviews， 1992， 72（4）： 1063-1081.

[7] 齊 ?妍， 徐兆師， 李盼松， 等. 植物熱激蛋白70的分子作用機(jī)理及其利用研究進(jìn)展[J]. 植物遺傳資源學(xué)報(bào)， 2013， 14（3）： 507-511.

[8] 張毓婷， 王敏華， 陳家棟， 等. 雷蒙德氏棉HSP70基因家族的進(jìn)化分析及其同源基因在陸地棉中的表達(dá)分析[J]. 遺傳， 2014， 36（09）： 921-933.

[9] Guo M， Liu JH， Ma X， et al. Genome-wide analysis of the Hsp70 family genes in pepper （Capsicum annuum L.） and functional identification of CaHsp70-2 involvement in heat stress[J]. Plant Science， 2016， 252： 246-256.

[10] Huang XY， Tao P， Li BY， et al. Genome-wide identification， classification， and analysis of heat shock transcription factor family in Chinese cabbage （Brassica rapa pekinensis）[J]. Genetics & Molecular Research， 2015， 14（1）： 2189-2204.

[11] Latijnhouwers M， Xu X M， Mller S G. Arabidopsis stromal 70-kDa heat shock proteins are essential for chloroplast development[J]. Planta， 2010， 232（3）： 567-578.

[12] Wang Y， Lin S， Song Q， et al. Genome-wide identification of heat shock proteins （Hsps） and Hsp interactors in rice： Hsp70s as a case study[J]. BMC Genomics， 2014， 15（1）： 344.

[13] Liu J X， Wang R M， Liu W Y， et al. Genome-wide characterization of heat-shock protein 70s from Chenopodium quinoa and expression analyses of Cqhsp70s in response to drought stress[J]. Genes， 2018， 9（2）： 35.

[14] Yer E N， Baloglu M C， Ziplar U T， et al. Drought-responsive Hsp70 gene analysis in Populusat genome-wide level[J]. Plant Molecular Biology Reporter， 2016， 34（2）： 483-500.

[15] Duan Y H， Guo J， Ding K， et al. Characterization of a wheat HSP70 gene and its expression in response to stripe rust infection and abiotic stresses[J]. Molecular Biology Reports， 2011， 38（1）： 301-307.

[16] 黃小云， 陶 ?鵬， 李必元， 等. 植物熱激轉(zhuǎn)錄因子基因家族的研究進(jìn)展[J]. 浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2014， 1（9）： 1323-1332， 1336.

[17] Velazquez J M， Lindquist S. Hsp70： nuclear concentration during environmental stress and cytoplasmic storage during recovery[J]. Cell， 1984， 36（3）： 655-662.

[18] Mayer M P， Bukau B. Hsp70 chaperones： cellular functions and molecular mechanism[J]. Cellular and Molecular Life Sciences， 2005， 62（6）： 670-684.

[19] 李東賓， 高燕會(huì)， 斯金平， 等. 鐵皮石斛HSP70基因的克隆及冷脅迫表達(dá)分析[J]. 中國中藥雜志， 2013， 38（20）： 3446-3452.

[20] 袁秀云， 許申平， 王默霏， 等. 蝴蝶蘭熱激蛋白基因PhHsp70序列分析及對冷脅迫的響應(yīng)[J]. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2018， 45（3）： 519-525.

[21] 孔倩倩. 高溫脅迫下文心蘭對外源水楊酸的生理響應(yīng)及WRKY基因的克隆[D]. 福州： 福建農(nóng)林大學(xué)， 2017， 21-22.

[22] 李 ?蓉， 吳曉佩， 王雪晶， 等. 文心蘭RFNR的克隆、亞細(xì)胞定位及其與LFNR不同的脅迫響應(yīng)機(jī)制研究[J]. 園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45（11）： 2164-2176.

[23] 郭艷芳， 王叢巧， 李 ?蓉， 等. 文心蘭PAD4基因克隆及表達(dá)分析[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2018， 39（12）： 2436-2445.

[24] 阮文進(jìn)， 門維婷， 馬 ?婧， 等. 蠟梅熱激蛋白基因CpHSP70-1的克隆、亞細(xì)胞定位與表達(dá)分析[J]. 西南大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2016， 38（1）： 43-52.

[25] 陳 ?旭， 石 ?壘， 朱 ?璐， 等. 植物HSP70蛋白家族分子進(jìn)化特征及其表達(dá)模式分析[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)， 2017， 36（10）： 4282-4294.

[26] Wilbanks S M， Delucaflaherty C， Mckay D B. Structural basis of the 70-kilodalton heat shock cognate protein ATP hydrolytic activity. I.Kinetic analyses of active site mutants [J]. Journal of Biological Chemistry， 1994， 269（17）： 12893-12898.

[27] Nelson R J. The translation machinery and 70 kD heat shock protein cooperate in protein synthesis [J]. Cell， 1992， 71（1）： 97-105.

[28] Kang P J， Ostermann J， Shilling J， et al. Requirement for hsp70 in the mitochondrial matrix for translocation and folding of precursor proteins [J]. Nature， 1990， 348（6297）： 137-143.

[29] 王宇萍， 蔣建東. 熱休克蛋白70的結(jié)構(gòu)和功能[J]. 中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào)， 2010， 32（2）： 305-313.

[30] 肖艷萍， 宮偉娜， 萬方浩， 等. 紫莖澤蘭熱激蛋白70基因的克隆與序列分析[J]. 中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào)， 2010， 12 （1）： 111-117.

[31] 栗振義. 紫花苜蓿熱激蛋白基因MsHSP70的克隆及功能分析[D]. 北京： 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院， 2015： 25-27.

[32] 安艷秋， 藺瑞明， 馮 ?晶， 等. 小麥熱激蛋白基因TaHSP70克隆及其在植物防衛(wèi)和抗逆反應(yīng)中的表達(dá)分析[J]. 分子植物育種， 2011， 9（4）： 402-409.

[33] 袁艷敏， 劉福利， 梁洲瑞， 等. 海帶hsp70基因的克隆、分析及轉(zhuǎn)錄水平定量研究[J]. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展， 2018， 39（4）： 152-158.

[34] 黃上志， 黃祥富， 林曉東， 等. 熱激對水稻幼苗耐冷性及熱激蛋白合成的誘導(dǎo)[J]. 植物生理與分子生物學(xué)學(xué)報(bào)， 2004， 30（2）： 189-194.

[35] 王 ?群， 方榮祥. 水稻熱激蛋白70基因的序列及熱誘導(dǎo)表達(dá)[J]. 中國科學(xué)（B輯 化學(xué) 生命科學(xué) 地學(xué)）， 1995， 25（12）： 1263-1272.

[36] 李慧聰， 郭秀林， 王冬梅， 等. 玉米熱激蛋白70基因?qū)囟让{迫的響應(yīng)[J]. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2010， 33 （6）： 12-15， 25.

[37] 李 ?翠， 侯 ?蕾， 任 ?麗， 等. 花生熱激蛋白AhHSP70與熱激因子AhHSF基因的克隆及表達(dá)分析[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2015， 47（4）： 1-7.

[38] Zhang L， Zhao H K， Dong Q L， et al. Genome-wide analysis and expression profiling under heat and drought treatments of HSP70 gene family in soybean （Glycine max L.） [J]. Frontiers in Plant Science， 2015， 6： 773-795.

[39] 陳二龍， 范志勇， 王松峰， 等. 煙草Hsp70基因家族的鑒定及NtHsp70Chl基因的表達(dá)分析[J]. 中國煙草科學(xué)， 2018， 39（2）： 8-15， 16.

[40] 張 ?楊， 孫 ?明， 楊海燕， 等. 菊花腦熱激蛋白70基因的克隆及表達(dá)分析[J]. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào) （自然科學(xué)版）， 2014， 40（2）： 153-156.

[41] 趙真真， 韓瑩琰， 李雅博， 等. 葉用萵苣熱激蛋白LsHsp70-1707基因的克隆及表達(dá)分析[J]. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2015， 20（5）： 171-178.

[42] Krebs R A， Holbrook S H. Reduced enzyme activity following Hsp70 overexpression in Drosophila melanogaster[J]. Biochemical Genetics， 2001， 39（1-2）： 73-82.

[43] 馮 ?斗， 禤維言， 黃政樹， 等. 茉莉酸甲酯對低溫脅迫下香蕉幼苗的生理效應(yīng)[J]. 果樹學(xué)報(bào)， 2009， 26（3）： 390-393.

[44] 楊華庚， 顏速亮， 陳慧娟， 等. 高溫脅迫下外源茉莉酸甲酯、鈣和水楊酸對蝴蝶蘭幼苗耐熱性的影響[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào)， 2011， 27（28）： 150-157.

[45] 顧穎慧. 龍須菜熱激蛋白70（HSP70）基因克隆及熱激下的表達(dá)模式分析[D]. 青島： 中國海洋大學(xué)， 2011.

[46] 朱招波， 孫 ?雪， 徐年軍， 等. 水楊酸對龍須菜抗高溫生理的影響[J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào)， 2012， 36（8）： 1304-1312.

[47] 鄒清成， 朱開元， 劉慧春， 等. 外源茉莉酸甲酯對非生物脅迫下蝴蝶蘭幼苗葉綠素?zé)晒夂涂寡趸笜?biāo)的影響[J]. 植物生理學(xué)報(bào)， 2011， 47（9）： 913-917.

[48] 劉 ?霞， 唐 ?設(shè)， 竇 ?志， 等. 茉莉酸甲酯對武運(yùn)粳24和寧粳3號灌漿早期高溫脅迫生理特性的影響[J]. 中國水稻科學(xué)， 2016， 30（3）： 291-303.

[49] 陸 ?雯， 潘璐琪， 王雪艷. 水楊酸及茉莉酸介導(dǎo)植物抗病性的研究進(jìn)展[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2013， 41（10）： 40-43.