魯小龍,徐海波

四川大學(xué)華西廣安醫(yī)院 檢驗(yàn)科(廣安 638000)

漿膜腔積液標(biāo)本的有形成分分析(如有核細(xì)胞計(jì)數(shù))目前仍以手工顯微鏡鏡檢檢測(cè)法為常用方法[1]，該方法沿用多年，具有操作過程復(fù)雜、重復(fù)性差、易受操作者影響、不易標(biāo)準(zhǔn)化等缺點(diǎn)。隨著儀器自動(dòng)化的發(fā)展，檢驗(yàn)工作者一直在探索利用儀器法檢測(cè)原理對(duì)漿膜腔積液進(jìn)行檢測(cè)，但各類報(bào)道關(guān)于漿膜腔積液檢測(cè)儀器法檢測(cè)的結(jié)論不一[2-11]。Sysmex XN-2000血細(xì)胞分析儀結(jié)合多種細(xì)胞分析檢測(cè)技術(shù)，采用專門的體液檢測(cè)通道，是少數(shù)可以應(yīng)用于體液細(xì)胞檢測(cè)的血細(xì)胞分析儀之一。本研究收集136例臨床患者的漿膜腔積液標(biāo)本，分別用XN-2000血細(xì)胞分析儀的體液模式(以下簡(jiǎn)稱儀器法)和顯微鏡鏡檢計(jì)數(shù)法進(jìn)行計(jì)數(shù)(以下簡(jiǎn)稱手工法)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集2018年1-12月四川大學(xué)華西廣安醫(yī)院臨床科室送檢的各類漿膜腔積液標(biāo)本136例，其中男83例，女53例;胸水75例，腹水61例。年齡16～93歲；所有標(biāo)本采集后用EDTA-K2抗凝劑處理，均無肉眼可見的凝塊，排除血性、膿性標(biāo)本，標(biāo)本采集后，在2 h內(nèi)完成檢測(cè)(包括儀器及手工檢測(cè))。

1.2 儀器與試劑

Sysmex XN-2000血細(xì)胞分析儀(日本Sysmex公司)，原裝配套試劑及質(zhì)控品(稀釋液：G9473,溶血?jiǎng)￤NR：A9053，染液WNR：A9083，溶血?jiǎng)￤DF：A9050，染液WDF：9113，溶血?jiǎng)㏒LS：A9019，質(zhì)控品：00781102)，經(jīng)校準(zhǔn)后的改良Neupauer計(jì)數(shù)板，微量毛細(xì)吸管，蓋玻片，日本Olympus CX-31雙目顯微鏡，一次性塑料試管，分析純冰醋酸溶液。

1.3 檢測(cè)步驟與方法

每份標(biāo)本收到后分別按以下兩種方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.1 儀器法檢測(cè) 按Sysmex XN-2000血細(xì)胞分析儀儀器操作手冊(cè)進(jìn)行檢測(cè)，每次檢測(cè)體液標(biāo)本前，儀器切換到手動(dòng)體液模式，自動(dòng)進(jìn)行儀器本底檢測(cè)，確保檢測(cè)通道中計(jì)數(shù)為0，防止攜帶污染。檢測(cè)操作同手動(dòng)檢測(cè)血細(xì)胞樣本，上機(jī)前充分混勻標(biāo)本，肉眼觀察是否有凝塊，防止產(chǎn)生氣泡。開蓋上機(jī)后，按“開始”按鈕自動(dòng)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類檢測(cè)。

1.3.2 手工法檢測(cè) 由長(zhǎng)期從事臨床檢驗(yàn)的高年資技術(shù)人員，按《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》第4版[12]要求，先加冰醋酸1～2滴到小試管內(nèi)，轉(zhuǎn)動(dòng)試管使管內(nèi)壁沾有冰醋酸，后棄去冰醋酸，滴加混勻的漿膜腔積液標(biāo)本3～4滴進(jìn)入試管，數(shù)分鐘后，混勻充入加有蓋玻片的計(jì)數(shù)池，顯微鏡下按白細(xì)胞計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)有核細(xì)胞數(shù)。每份計(jì)數(shù)樣本均計(jì)數(shù)2次，取均值作為檢測(cè)結(jié)果，最后將有核細(xì)胞數(shù)結(jié)果換算成106個(gè)/L。

1.4 分組

以手工法檢測(cè)有核細(xì)胞總數(shù)計(jì)數(shù)結(jié)果為參考標(biāo)準(zhǔn)，將所有標(biāo)本分為A組(≤100×106個(gè)/L)和B組(>100×106個(gè)/L)兩組,A組樣本數(shù)為29例，B組樣本數(shù)為107例。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)，對(duì)不符合正態(tài)分布數(shù)據(jù)進(jìn)行非參數(shù)Spearman雙變量相關(guān)性分析和配對(duì)非參數(shù)秩和檢驗(yàn)，計(jì)算線性回歸方程。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α除特別說明外均設(shè)定為0.05。

2 結(jié)果

2.1 儀器法WBC重復(fù)性檢測(cè)

選擇A組和B組中樣本各1例，分別代表低值組和高值組，每個(gè)標(biāo)本連續(xù)復(fù)測(cè)11次，去除第1次檢測(cè)結(jié)果，變異系數(shù)均<5.0%(表1)。

表1 XN-2000檢測(cè)WBC精密度

2.2 儀器法和手工法檢測(cè)漿膜腔積液有核細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果比較

經(jīng)正態(tài)分布檢驗(yàn)分析，兩種方法有核細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果的P值(sig.)在A組中依次為0.007、0.045，在B組中依次為0.000、0.000(P<0.05)，故均不符合正態(tài)分布。經(jīng)非參數(shù)相關(guān)性分析，A組與B組兩種方法的Spearman相關(guān)系數(shù)分別為0.913、0.998，呈顯著性正相關(guān)(P<0.001)；兩組中儀器法相對(duì)于手工法計(jì)數(shù)結(jié)果的線性回歸方程為分別為：y=0.945x+8.932，y=1.006x+26.959。儀器法較手工法檢測(cè)結(jié)果偏高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表2)。

表2 兩組數(shù)據(jù)配對(duì)非參數(shù)秩和檢驗(yàn)結(jié)果(×106個(gè)/L)

3 討論

漿膜腔積液有形成分計(jì)數(shù)在臨床醫(yī)生診斷漏出液、滲出液，胸腹膜炎癥和惡性腫瘤中具有重要意義[12]。手工法計(jì)數(shù)漿膜腔積液細(xì)胞雖然被認(rèn)定為參考方法[13]，但其缺點(diǎn)也顯而易見：手工計(jì)數(shù)精度差，不同人員重復(fù)性差，操作時(shí)間長(zhǎng)、過程繁瑣(人工吸樣、充池、沉淀、顯微鏡調(diào)整，離心制片、染色等)，分析過程很難做到標(biāo)準(zhǔn)化，生物安全方面還存在交叉感染風(fēng)險(xiǎn)，不易進(jìn)行質(zhì)量控制等[14]。

XN-2000血細(xì)胞分析儀體液模式采用直流電阻/射頻電阻檢測(cè)法(RF/DC檢測(cè))，液壓聚集法(DC檢測(cè))、半導(dǎo)體流式細(xì)胞細(xì)胞計(jì)數(shù)法、核酸熒光染色法等檢測(cè)手段，對(duì)漿膜腔積液中的有形成分進(jìn)行計(jì)數(shù)并分類，標(biāo)本用量?jī)H需88 μL，反應(yīng)迅速，從將標(biāo)本混勻后放入儀器至檢測(cè)完成的時(shí)間不超過2 min；同時(shí)無需對(duì)標(biāo)本進(jìn)行特殊處理(但對(duì)于膿性，有凝塊的標(biāo)本，不能用于該儀器的檢測(cè)，以防堵塞儀器)[14]。此外該儀器還提供直觀的散點(diǎn)圖及高熒光強(qiáng)度有核細(xì)胞(HF)計(jì)數(shù)等參數(shù)，據(jù)報(bào)道此參數(shù)可用于惡性腫瘤脫落細(xì)胞的篩查[15-17]。

本研究中兩種方法檢測(cè)結(jié)果經(jīng)正態(tài)分布檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)均不符合正態(tài)分布。經(jīng)非參數(shù)相關(guān)分析，A組與B組的Spearman相關(guān)系數(shù)分別為0.913，0.998，均呈顯著正相關(guān)(P<0.001)。兩組中儀器法相對(duì)于手工法線性回歸方程依次為y=0.945x+8.932，y=1.006x+26.959。儀器法檢測(cè)漿膜腔積液的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)中，高低濃度樣本均顯示具有較好的精密度，在白細(xì)胞計(jì)數(shù)較小時(shí)，變異系數(shù)較大，較大時(shí)，變異系數(shù)更小，且都在允許范圍之內(nèi)，這與已報(bào)道的相關(guān)結(jié)果相符[18]，能夠滿足臨床診療的需要。由表2可知，A組與B組中兩種方法計(jì)數(shù)結(jié)果存在顯著性差異(P<0.05)，各組內(nèi)中位數(shù)，25%位數(shù)，75%位數(shù)均顯示儀器法較手工法偏高。經(jīng)分析造成這種差異有以下幾個(gè)方面的原因：1)儀器計(jì)數(shù)的細(xì)胞總量大，標(biāo)本是按1∶50稀釋儀器進(jìn)行檢測(cè)計(jì)數(shù)，當(dāng)細(xì)胞數(shù)偏低時(shí)，還會(huì)自動(dòng)擴(kuò)大細(xì)胞計(jì)數(shù)量，從統(tǒng)計(jì)學(xué)角度，會(huì)提高結(jié)果的精密度與準(zhǔn)確性。而手工法計(jì)數(shù)實(shí)際只有1 μL標(biāo)本的內(nèi)數(shù)量，若遇細(xì)胞數(shù)多時(shí)，還會(huì)用冰醋酸進(jìn)行稀釋后再進(jìn)行計(jì)數(shù)，會(huì)增大誤差。2)手工法在稀釋、處理，吸樣、充池等過程中，會(huì)對(duì)有核細(xì)胞產(chǎn)生破壞，引起計(jì)數(shù)結(jié)果偏低，尤其是充池后時(shí)間越長(zhǎng)影響越大。但如果充池后立即計(jì)數(shù)由于細(xì)胞分布不均等原因，會(huì)引起細(xì)胞的計(jì)數(shù)結(jié)果產(chǎn)生偏差。3)樣本的黏稠度也會(huì)影響計(jì)數(shù)結(jié)果，手工法中因樣本黏稠度會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞粘連導(dǎo)致細(xì)胞不易充入計(jì)數(shù)池，還會(huì)影響細(xì)胞分布不均，而儀器法將樣本按50倍稀釋后計(jì)數(shù)，可以克服樣本黏稠度的影響。4)樣本中脫落的間皮細(xì)胞，未成熟細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞和膿細(xì)胞等，有成堆成團(tuán)聚集的現(xiàn)象，分布不均，會(huì)影響計(jì)數(shù)結(jié)果。而儀器法采用核酸熒光染色法，可對(duì)這類細(xì)胞進(jìn)行分析計(jì)數(shù)，顯示在散點(diǎn)圖的右上角高熒光細(xì)胞區(qū)。結(jié)合計(jì)數(shù)結(jié)果與散點(diǎn)圖，可對(duì)此類細(xì)胞進(jìn)行初步篩查[15-17]。5)手工法中，操作人員對(duì)細(xì)胞的認(rèn)識(shí)不同和對(duì)計(jì)數(shù)板使用的熟練程度，也會(huì)影響計(jì)數(shù)結(jié)果準(zhǔn)確性[6,19]。

綜上所述，XN-2000血細(xì)胞分析儀體液檢測(cè)模式具有操作簡(jiǎn)單迅速、結(jié)果準(zhǔn)確可靠、減少人為操作誤差等優(yōu)點(diǎn)，可應(yīng)用于漿膜腔積液有核細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)。但由于漿膜腔積液本身成分復(fù)雜和儀器非直接檢測(cè)形態(tài)的特點(diǎn)，故XN-2000血細(xì)胞分析儀目前不能完全代替人工鏡檢。如當(dāng)儀器出現(xiàn)散點(diǎn)圖異常和高熒光細(xì)胞增高時(shí)，還應(yīng)手工鏡檢確認(rèn)；同時(shí)，膿性標(biāo)本和有凝塊的樣本由于儀器特點(diǎn)，也限制了其應(yīng)用。