丁季飛，陶 輝，石開虎，徐盛松

(安徽醫(yī)科大學(xué) 第二附屬醫(yī)院心胸外科、心血管病研究中心，安徽 合肥 230601)

心肌纖維化是各種心血管疾病不可改變的病理變化過程，有助于心肌重塑[1-2]。研究表明心肌纖維化與心房顫動的發(fā)生、發(fā)展密不可分，是心房顫動發(fā)生結(jié)構(gòu)重構(gòu)的重要病理基礎(chǔ)[3]。心肌纖維化主要表現(xiàn)為膠原沉積和心臟成纖維細(xì)胞(CFs)的積累，是心室重塑的病理學(xué)標(biāo)志[4]。目前，心肌纖維化形成的具體機(jī)制尚不明確，但已發(fā)現(xiàn)心肌成纖維細(xì)胞(cardiac fibroblasts，CFs)的增殖是心肌纖維化形成的關(guān)鍵因素[5-6]。文獻(xiàn)報道DNA甲基化參與心肌成纖維細(xì)胞的增殖。DNA甲基化由一組保守的酶催化，稱為DNMT[7]。DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶目前已知有3種，包括DNMT1，DNMT3a和DNMT3b[8]。DNMT1在肝纖維化中已報道較多，但在心肌纖維化中報道甚少[9]。本研究以DNMT1為突破點，通過觀察DNMT1對CFs增殖的影響，探討其與心肌纖維化的關(guān)系及可能作用機(jī)制，為預(yù)防及治療心肌纖維化提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 40只清潔級Sprague-Dawley(SD)乳鼠，體質(zhì)量(10±2)g，鼠齡1～3 d左右。所有乳鼠均購于安徽醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，動物許可證號：scxk (皖) 2017-001。

1.1.2試劑 DMEM培養(yǎng)基(美國HyClone公司，AE29005267)；DMSO、CCK-8相關(guān)試劑(美國Sigma公司,5439001000；68121000)；胎牛血清(Gibco公司,1581729)；小干擾DNMT1(siDNMT1)轉(zhuǎn)染試劑盒(上海吉瑪基因公司,96486)；細(xì)胞周期試劑盒(美國BD公司,9183478)；Ez Omics One-Step qPCR試劑盒；SYBR PremixExTaqⅡ(2×) (TaKaRa公司，RR820A)；TRIzol試劑(美國Life Technology公司,190906)、LipofectamineTM2000(美國Invitrogen公司,1718554)；DNMT1和I型膠原前膠原A1(Col1A1)的一抗(Proteintech Group,Inc.中國武漢公司,00053896;00066288)；α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA) (武漢博士德生物工程有限公司,1A4)、β-actin的一抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，19AW0401)。

1.1.3儀器 1300 SERIES A2型生物安全柜(美國Thermo Fisher Scientific公司)；二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher Scientific公司)；CFX ConnectTM擴(kuò)增儀(美國伯樂公司)；酶標(biāo)儀 (美國Thermo Fisher Scientific公司)；分光光度儀(德國IMPLEN Gmb H公司)流式細(xì)胞儀CytoFLEX(BECKMAN COULTER 中國有限公司)；倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2 方法

1.2.1SD乳鼠CFs的提取與培養(yǎng) 取1～3 d的雄性SD乳鼠用75%酒精浸泡消毒后于生物安全柜中取出心臟，PBS清洗后用剪刀將心臟剪碎成泥狀，加入2 mL的胰酶稀釋液(胰蛋白酶 ∶PBS緩沖液=1 ∶1)并在水浴鍋中水浴消化6 min，靜置1 min后緩慢吸取上清液，加入等量培養(yǎng)基終止胰酶消化，重復(fù)操作4次使組織消化完全后1 000 r·min-1離心7 min。離心完棄上清向管中加入1 mL培養(yǎng)基，輕柔吹打，移到培養(yǎng)瓶中，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1.5 h后，換液后貼壁的細(xì)胞即為CFs。顯微鏡下通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)鑒定CFs，于細(xì)胞原代培養(yǎng)箱中培養(yǎng)傳代，至2～3代可用于實驗。顯微鏡下觀察，免疫組化纖維黏連蛋白染色為陽性者即為CFs。

1.2.2實驗分組 實驗組：心肌成纖維細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染sDNMT1組；空白對照組(Vehicle)：不做任何處理組；陰性對照組(Negative Control)：心肌成纖維細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染對基因無影響的空載RNA。

1.2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 培養(yǎng)CFs在指數(shù)生長期進(jìn)行轉(zhuǎn)染，消化細(xì)胞后計數(shù)，等量接種于6孔板，待細(xì)胞生長到肉眼觀60%至70%密度左右進(jìn)行轉(zhuǎn)染。實驗組siDNMT 1的引物序列：5′-GCUGAGAUGGCGU CAUATTUAUGACGCCAUCUCUCAGCTT-3′；NC組的引物序列：sense：5′-UUCUUCGAACGUGUCACGUT T-3′；antisense：5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。依據(jù)LipofectamineTM2000 Reagent 和siDNMT1的說明書對各組CFs進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗，培養(yǎng)4～6 h后給細(xì)胞更換含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，于24～48 h進(jìn)行細(xì)胞總RNA的提取。

1.2.4提取總RNA及逆轉(zhuǎn)錄 TRIzol法提取各個分組細(xì)胞的總RNA。使用分光光度儀檢測RNA的純度和濃度后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 min，4 ℃ 15 min，所得cDNA放置-20 ℃保存。

1.2.5qPCR檢測各轉(zhuǎn)染組DNMT1、Col1A1、α-SMA的表達(dá) 取cDNA用 Bio-Rad CFX Maestro1.0 Real-Time系統(tǒng)進(jìn)行反應(yīng)擴(kuò)增。設(shè)置反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s；60 ℃ 30 s，共進(jìn)行40個循環(huán)；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s作為熔解曲線階段。β-actin作為內(nèi)參。mRNA 的相對表達(dá)量應(yīng)用2-ΔΔCT法計算。相關(guān)引物序列見Tab 1。

Tab 1 Primer sequences for qPCR

1.2.6Western blot法檢測CFs中DNMT1、Col1A1、α-SMA蛋白的表達(dá) 轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h，提取各分組的總蛋白，測定每組蛋白的蛋白濃度，根據(jù)上清樣量加入上樣緩沖液100 ℃煮10 min后-20 ℃冰箱保存。SDS-PAGE蛋白電泳，根據(jù)分子量大小轉(zhuǎn)膜對應(yīng)時間，5%脫脂牛奶封閉1.5 h，洗膜3次后孵育DNMT1、α-SMA、β-actin、Col1A1的一抗，4 ℃孵育過夜。一抗孵育完畢后洗膜3次后，二抗常溫孵育1 h，洗膜3次后顯影。結(jié)果使用ImageJ軟件分析并分別計算DNMT1、Col1A1、α-SMA的蛋白表達(dá)水平。

1.2.7CCK-8法檢測CFs瞬時轉(zhuǎn)染后的增殖情況 分組：空白組、陰性對照組、siDNMT1組，每組設(shè)5個復(fù)孔。用胰酶消化處于對數(shù)生長期的各組細(xì)胞，加入培養(yǎng)基終止消化后進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。計數(shù)后鋪板于96孔板中，每孔體積200 μL，細(xì)胞密度為1.5×107·L-1，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。連續(xù)培養(yǎng)48 h后每孔滴加10 μL CCK-8試劑后放回培養(yǎng)箱孵育，3 h后檢測吸光度。實驗重復(fù)3次。

1.2.8細(xì)胞周期實驗檢測轉(zhuǎn)染后CFs的細(xì)胞周期分布情況 分組：空白組、陰性對照組、siDNMT1組。轉(zhuǎn)染24 h后，用胰蛋白酶消化下細(xì)胞后用冷PBS洗滌2次，后在4 ℃下用75%乙醇中固定過夜。隨后，再用冷PBS洗滌細(xì)胞2次，用碘化丙錠(PI)和RNA酶混合染色液在4 ℃下避光孵育30 min后上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。所有實驗結(jié)果通過Flowjo進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。實驗重復(fù)至少3次。

2 結(jié)果

2.1 瞬時轉(zhuǎn)染siDNMT1對DNMT1表達(dá)的影響如Fig 1所示，CFs瞬時轉(zhuǎn)染siDNMT1、陰性對照組及空白組后培養(yǎng)48 h，瞬時轉(zhuǎn)染siDNMT1的CFs中DNMT1表達(dá)較空白對照組和陰性組降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

Fig 1 qPCR analysis of DNMT1 expression after transient transfection of siDNMT1 in CFs for 48 **P<0.01 vs NC.

2.2 瞬時轉(zhuǎn)染siDNMT1對CFs細(xì)胞增殖的影響Fig 2結(jié)果顯示，CFs瞬時轉(zhuǎn)染siDNMT1的CFs培養(yǎng)48 h后，細(xì)胞活力相比于空白對照組和陰性組明顯下降(P<0.05)。

Fig 2 Percentages of CFs viability after 48 h of transient transfection of siDNMT1 compared with *P<0.05 vs NC.

2.3 瞬時轉(zhuǎn)染siDNMT1對Col1A1、α-SMA mRNA表達(dá)的影響如Fig 3所示，CFs 瞬時轉(zhuǎn)染siDNMT1培養(yǎng)24～48 h后，α-SMA、Col1A1 mRNA的表達(dá)相比于空白對照組和陰性對照組明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05) 。

Fig 3 Changes of α-SMA and Col1A1 mRNA after transient transfection of siDNMT1 in CFs by *P<0.05 vs NC.

2.4 瞬時轉(zhuǎn)染siDNMT1對CFs中DNMT1、α-SMA、Col1A1蛋白表達(dá)的影響如Fig 4所示，CFs瞬時轉(zhuǎn)染siDNMT1 48 h后，DNMT1、Col1A1和α-SMA蛋白的表達(dá)量明顯低于空白對照組和陰性對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

Fig 4 Western blot analysis and relative protein expression of DNMT1,Col1A1 and α-SMA expression in CFs after transient transfection of siDNMT1 β-actin expression was measured as a A:Vehicle;B:NC;C:siDNMT1；*P<0.05 vs NC.

2.5 瞬時轉(zhuǎn)染siDNMT1對CFs中細(xì)胞周期變化的影響如Fig 5所示，CFs瞬時轉(zhuǎn)染siDNMT1 48 h后，G0/G1期的細(xì)胞比例較空白對照組和陰性對照組相比明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

Fig 5 Effect of siDNMT1 on cell cycle experiment of CFs determined by flow cytometry Representative images of three independent experiments are A:Vehicle;B:NC;C:siDNMT1;*P<0.05 vs NC.

3 討論

心肌組織中有大量的心肌成纖維細(xì)胞，CFs的合成、分泌與心肌細(xì)胞外基質(zhì)密切相關(guān)。在心肌纖維化的發(fā)生、發(fā)展中伴有CFs部分表型的異常改變和增殖，當(dāng)心肌纖維化發(fā)生時，CFs出現(xiàn)異常增殖，轉(zhuǎn)化成肌成纖維母細(xì)胞后分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)并沉積，例如Col1A1、α-SMA等[9]。因此，CFs增殖后產(chǎn)生的大量膠原和ECM沉積是心肌纖維化發(fā)生與發(fā)展的關(guān)鍵因素[10]。研究表明，DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶與CFs增殖的調(diào)控密切相關(guān)，參與心肌纖維化的發(fā)生與發(fā)展[11-12]。在哺乳動物的DNA中，甲基化的的過程實質(zhì)上是酶的反應(yīng)過程。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶將甲基與CpG位點的胞嘧啶核苷酸結(jié)合(胞嘧啶直接跟隨5'至3'的鳥嘌呤形成5-甲基胞嘧啶)[13]。其中DNMT1在CFs中的報道較少，在心肌纖維化中有其作用機(jī)制尚不明確但在肝纖維化中報道較多[14]。本課題通過在CFs中瞬時轉(zhuǎn)染DNMT1 siRNA后與正常對照組和陰性對照組比較，在瞬時轉(zhuǎn)siDNMT1的CFs中，DNMT1的表達(dá)明顯下降，同時α-SMA和Col1A1的表達(dá)水平明顯下降。在CFs中瞬時轉(zhuǎn)染siDNMT1 48 h后，同空白組以及陰性對照組比較，CFs的活力明顯下降。在CFs中瞬時轉(zhuǎn)染siDNMT1 24～48 h后，同空白組以及陰性對照組比較，細(xì)胞G0和G1期的被阻滯明顯。

綜上所述，在CFs中轉(zhuǎn)染siDNMT1后DNMT1表達(dá)明顯下降，而CFs的增殖又可被DNMT1的低表達(dá)所抑制，表明DNMT1是影響CFs 增殖的關(guān)鍵因素。上述研究表明，DNMT1可能通過靶向調(diào)控下游基因的表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)心肌纖維化，為探究DNMT1的具體作用機(jī)制提供了基礎(chǔ)，也為心肌纖維機(jī)制的研究提供新的思路，但本研究尚處于初級探究階段，仍需后期進(jìn)行更深入研究。