基于在體腸袢模型研究葒草活性成分在正常及心肌缺血模型大鼠的腸吸收特性

陸 苑,黎 娜,2,劉春花,潘 潔,李勇軍,王永林,孫 佳

(貴州醫(yī)科大學(xué) 1.貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/省部共建藥用植物功效與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，2.藥學(xué)院，3.民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心，貴州 貴陽 550004)

葒草，蓼科植物葒蓼(PolygonumorientaleL.)的干燥全草，具有清熱解毒、祛風(fēng)除濕、活血消腫的功效，常用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、冠心病、瘡腫等[1-3]。在貴州省分布廣泛，民間常用于治療氣短、胸痛及胸悶等疾病。研究發(fā)現(xiàn)甾類皂苷類、黃酮類、木質(zhì)素類等為葒草藥材中的主要化學(xué)成分，且現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明葒草能增加心肌營養(yǎng)血流量及冠脈流量，從而改善急性心肌缺血缺氧的狀態(tài)[3，4]。

基于葒草對心肌缺血具有較好的療效，課題組在前期對葒草的藥用部位、化學(xué)成分、提取工藝等進(jìn)行了研究，并結(jié)合血清藥理、血清譜效關(guān)系等明確了以異葒草、葒草素、牡荊素、槲皮苷、原兒茶酸等為代表的黃酮類成分及酚酸類成分為其主要活性成分[4-6]。且研究報(bào)導(dǎo)異葒草素及葒草素具有清除1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH)自由基和抗炎的作用[7-8]，槲皮苷通過阻斷黃嘌呤氧化酶，螯合鐵，具有直接清除羥基和超氧陰離子自由基，抑制脂質(zhì)過氧化而產(chǎn)生抗氧化作用[9]。但是，目前關(guān)于葒草提取物活性成分在心肌缺血模型大鼠體內(nèi)的吸收過程尚不清楚，因此，本實(shí)驗(yàn)擬通過建立大鼠在體腸袢吸收模型，從藥物經(jīng)腸道吸收入血的含量變化來研究葒草提取物(polygonumorientaleL.extracts,POE)中主要活性成分在正常及心肌缺血(myocardial ischemia,MI)模型大鼠體內(nèi)的吸收特性及差異，從而為葒草的進(jìn)一步研究提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器UPLC-TQS(美國沃特世公司Acquity?三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀)；BT100-2J恒流泵(河北保定蘭格恒流泵有限公司)；ZH-2渦旋混合器(天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠)；MTN-2800D氮吹濃縮裝置(天津奧特塞恩斯儀器有限公司)；XYN-15LP氮吹儀氮?dú)獍l(fā)生器(上海析友分析儀器有限公司)；AE240十萬分之一電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；EL204萬分之一電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；DK-98-Ⅱ恒溫水浴鍋(天津泰斯特儀器有限公司)；Allegra 64R低溫高速離心機(jī)(美國Beckman Coulter公司)。

1.2 藥物與試劑葛根素(上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)S02M9B54875)；山奈素-3-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮苷、原兒茶酸、葒草素、異葒草素、牡荊素對照品(四川省維克奇生物科技有限公司，批號(hào)分別為wkq16022301、wkq16080402、wkq16012105、wkq16041301、wkq16080404、wkq16031003，純度≥98%)；鹽酸異丙腎上腺素(阿拉丁化學(xué)試劑公司)；肝素鈉(北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：421F025)；葒草(產(chǎn)自中國貴州)；甲酸、乙腈、甲醇等試劑均為色譜純。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及模型制備Sprague-Dawley(SD)大鼠，♂，體質(zhì)量為(250±20)g，由長沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供，為SPF級(jí)動(dòng)物，合格證號(hào)：SCXK(湘)2014-0011。在室溫(20～25) ℃，相對濕度(60±10)%的條件下飼養(yǎng)，自由進(jìn)食、進(jìn)水。本研究經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)與同意(批準(zhǔn)號(hào)1702077)。

取健康SD大鼠70只，實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，自由飲水，隨機(jī)分為正常組及MI模型組，每組35只。模型組大鼠按50 mg·kg-1的劑量皮下注射鹽酸異丙腎上腺素(isoproterenol，ISO)生理鹽水，每天注射一次，連續(xù)注射2 d，正常組大鼠注射等劑量的生理鹽水。末次注射后24 h后即得到大鼠心肌缺血模型[10-11]。

2 方法

2.1 溶液的配制

2.1.1標(biāo)準(zhǔn)溶液及內(nèi)標(biāo)溶液的配制 精密稱取葛根素對照品10.40 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解后定容至刻度，搖勻，即得濃度為1.04 g·L-1的葛根素儲(chǔ)備液。精密稱取異葒草素、葒草素、牡荊素、槲皮苷對照品10.26、10.90、10.48、10.34 mg，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解后定容至刻度，搖勻，即得濃度分別為1.026、1.090、1.048、1.034 g·L-1的對照品儲(chǔ)備液。分別精密吸取各對照品儲(chǔ)備液適量，置于10 mL量瓶中。上述溶液均置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.2Tyrode緩沖液的配制 稱取NaCl 8.00 g、KCl 0.20 g、NaHCO31.00 g、NaH2PO40.05 g、MgCl20.10 g、CaCl20.20 g、葡萄糖 1.00 g，用少量蒸餾水溶解，其中CaCl2單獨(dú)溶解后逐滴加入，最后加入葡萄糖溶解，溶解后用蒸餾水定容至1 L，即得Tyrode緩沖液。

2.1.3POE灌流液的配制 取葒草干燥藥材10 kg，分別加10倍水煮3次，每次1 h，過濾，合并濾液，濾液濃縮至1 g生藥/mL；攪拌下緩慢加入乙醇使溶液含醇量大65%，繼續(xù)攪拌30 min，靜置12 h，抽濾，濾液濃縮至1 g生藥/mL；以1/2倍的水飽和正丁醇萃取4次，合并正丁醇相，減壓回收正丁醇；正丁醇提取物加80%乙醇溶解后，上聚酰胺柱，用8倍體積的80%乙醇洗脫，收集流穿液和洗脫液，減壓回收乙醇，殘留物微波真空干燥，得POE，收膏率為5.02%[12]。稱取葒草提取物適量，用Tyrode緩沖液超聲溶解，過濾，得到終濃度分別為5.0、10.0、20.0 g·L-1的POE灌流液。

2.2 分組給藥與樣品采集取正常和心肌缺血模型大鼠(禁食12 h，可自由飲水)，腹腔注射10%水合氯醛(0.04 mL·kg-1)麻醉，固定于37 ℃的恒溫加熱板上，經(jīng)靜脈插管手術(shù)插管，供實(shí)驗(yàn)過程中從頸靜脈補(bǔ)充注射含肝素鈉(10 g·L-1)的新鮮血液，使體內(nèi)血液總量一致。腹部剃毛，沿腹中線，做正中切口，充分暴露手術(shù)視野分離出7～10 cm小腸，在實(shí)驗(yàn)?zāi)c段兩端避開血管各切一小口，在小口處插入直徑為0.3 cm的硅膠軟管，并用線扎緊。連接恒流泵，使其與恒流泵形成一個(gè)回路，將37 ℃的生理鹽水緩緩泵入腸管，洗去腸管內(nèi)容物至凈,然后排空腸道內(nèi)的水分。鈍性分離腸系膜靜脈，結(jié)扎腸系膜靜脈，插管用以收集給藥段的腸系膜靜脈的血液。將傷口用浸有生理鹽水的脫脂棉覆蓋保濕。取37 ℃葒草活性成分循環(huán)液50 mL于量筒中，以2.0 mL·min-1的流速與目標(biāo)腸段內(nèi)循環(huán)平衡10 min后，將恒流泵的流速調(diào)節(jié)為1.0 mL·min-1，并立刻收集給藥段的腸系膜靜脈的血液300 μL至含肝素鈉的離心管中，同時(shí)緩慢從頸靜脈補(bǔ)充新鮮血液300 μL。之后在不同時(shí)間點(diǎn)(10、30、60、90、120 min)按同樣的方法來取樣，恒流泵循環(huán)2 h后結(jié)束實(shí)驗(yàn)，處死大鼠。收集到的血液，6 000 r·min-1離心 6 min，取血漿凍存于-20 ℃冰箱，待測定[13-14]。

2.2.1不同濃度的葒草活性成分對吸收的影響 取正常和MI模型SD大鼠，按每組5只隨機(jī)分組。選取大鼠十二指腸段(自幽門1.0 cm處開始往下 10 cm處)，按“2.2”項(xiàng)下操作，制備大鼠在體腸袢模型，取用濃度為5.0、10.0、20.0 g·L-1的葒草活性成分溶液分別作為腸循環(huán)灌流液，按時(shí)間點(diǎn)經(jīng)腸系膜靜脈取血約300 μL置有肝素的塑料離心管中，6 000 r·min-1離心6 min，分離血漿于-20 ℃冰箱中保存待用。

2.2.2葒草活性成分在不同腸段的吸收特點(diǎn) 取正常和MI模型SD大鼠，按每組5只隨機(jī)分組。選取大鼠各腸段：十二指腸段(自幽門1.0 cm處開始往下 10 cm處)；空腸段(自幽門15 cm起往下 10 cm處)；回腸段(離盲腸上行 20 cm處開始往下10 cm處)；結(jié)腸段(從盲腸后端開始往下取 10 cm處)，按“2.2”項(xiàng)下操作，制備大鼠在體腸袢模型，選擇濃度為10.0 g·L-1的葒草活性成分溶液作為腸循環(huán)灌流液，按時(shí)間點(diǎn)經(jīng)腸系膜靜脈取血約300 μL置有肝素的塑料離心管中，6 000 r·min-1離心6 min，分離血漿于-20 ℃冰箱中保存待用。

2.3血漿處理方法 取大鼠血漿100 μL，置于1.5 mL塑料離心管中，加內(nèi)標(biāo)溶液13 μL(葛根素10 mg·L-1)，渦混1 min，加入1%甲酸水100 μL，渦混1 min，加入甲醇400 μL，渦混1 min，超聲10 min，4 ℃，13 000 r·min-1離心10 min，取上清液置離心管中，37 ℃下用N2吹干，殘留物加150 μL甲醇水(50 ∶50,v/v)溶解，渦混3 min，超聲10 min，4 ℃下13 000 r·min-1離心10 min，取上清液進(jìn)樣UPLC-TQS分析。

2.4 UPLC-MS/MS液質(zhì)條件

2.4.1液相條件 超高效液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Waters公司)；色譜柱Acquity UPLC BEH C18(2.1×50 mm，1.8 μm)；柱溫40 ℃；流動(dòng)相A為0.1%甲酸乙腈；流動(dòng)相B為0.1%甲酸水；流速0.3 mL·min-1；梯度洗脫程序：0.0～0.5 min,10% A；0.5～1.0 min,10%～19% A；1.0～3.0 min,19% A；3.0～3.1 min,19%～90% A；3.1～3.5 min,90% A；3.5～4.0 min,90%～10% A；進(jìn)樣量：1 μL

2.4.2質(zhì)譜條件 電噴霧電離源(ESI)；去溶劑氣(氮?dú)? 000 L·h-1)；去溶劑氣溫度(550 ℃)；掃描方式為多反應(yīng)離子監(jiān)測模式(MRM)。異葒草素等6種指標(biāo)性成分及內(nèi)標(biāo)化合物的監(jiān)測離子見Tab 1。

Tab 1 Mass spectrometry parameters of each compound

3 結(jié)果

3.1 不同濃度的POE中六個(gè)主要成分濃度對吸收的影響照“2.2.1”項(xiàng)下方法操作，分別制備正常及MI模型大鼠的十二指腸的在體循環(huán)腸灌流模型，分別以5.0、10.0、20.0的POE為循環(huán)灌流液，于循環(huán)穩(wěn)定后不同時(shí)間點(diǎn)經(jīng)腸系膜血管收集血液，分析計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)的血藥濃度，計(jì)算AUC，結(jié)果如Fig 1所示。結(jié)果顯示，正常狀態(tài)下，葒草素等6個(gè)成分在2 h內(nèi)的時(shí)間曲線下面積隨濃度的升高而升高，呈現(xiàn)濃度依賴性。在心肌缺血模型狀態(tài)下，原兒茶酸、山柰素-3-O-β-D-葡萄糖苷和槲皮苷的AUC隨濃度的升高而升高，均不存在高濃度飽和現(xiàn)象；而葒草素、異葒草素和牡荊素在中濃度(10.0 g·L-1)時(shí)的AUC最小，在高濃度(20.0 g·L-1)時(shí)最大。且在3個(gè)濃度下，模型組對異葒草素、葒草素及原兒茶酸的吸收均較正常組降低(P<0.05)，在低濃度及高濃度時(shí)對牡荊素及槲皮苷的吸收較正常組降低(P<0.05)，山奈素-3-O-β-D-葡萄糖苷的吸收則在高濃度時(shí)較正常組降低(P<0.05)。見Fig 1。

Fig 1 AUC of the isoorientin(A),orientin(B),vitexin(C),quercitrin(D),kaemferol-3-O-β-D-glucoside(E) and protocatechuic acid(F) of three concentrations POE in normal and MI model n=5)*P<0.05 vs normal group

3.2 POE中六個(gè)主要成分在不同腸段的吸收特性照“2.2.2”項(xiàng)下方法操作，分別制備正常及MI模型大鼠的十二指腸、空腸、回腸及結(jié)腸的在體循環(huán)腸灌流模型，以10.0 g·L-1的POE為循環(huán)灌流液，于循環(huán)穩(wěn)定后不同時(shí)間點(diǎn)經(jīng)腸系膜血管收集血液，分析計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)的血藥濃度，計(jì)算AUC，結(jié)果見Fig 2所示。結(jié)果顯示，與正常組相比，POE中6個(gè)成分在MI模型大鼠各個(gè)腸段中的AUC值均較低，提示模型狀態(tài)下，6個(gè)成分經(jīng)4個(gè)腸段吸收入血的量較低。在正常狀態(tài)下，6個(gè)活性成分在回腸和十二指腸中的AUC值較高，而模型狀態(tài)下則為回腸和結(jié)腸的AUC值較高。比較同一腸段在正常及模型狀態(tài)下對同一成分的吸收可以發(fā)現(xiàn)模型狀態(tài)下對各成分的吸收均小于正常狀態(tài)下的吸收。其中十二指腸及空腸對6個(gè)成分的吸收差異具有顯著性(P<0.05)；回腸對異葒草素、牡荊素、槲皮苷及山奈素-3-O-β-D-葡萄糖苷的吸收差異具有顯著性(P<0.05)；結(jié)腸對原兒茶酸及槲皮苷的吸收差異具有顯著性(P<0.05)。見Fig 2。

Fig 2 AUC of isoorientin(A),orientin(B),vitexin(C),quercitrin(D),kaemferol-3-O-β-D-glucoside(E) and protocatechuic acid(F) of POE in normal and MI model rats at various intestinal segments n=5)*P<0.05 vs normal group

4 討論

本研究建立了一種簡便、快速、靈敏的分析LC-MS/MS方法，適用于同時(shí)測定大鼠血漿樣品中6種成分的含量。方法學(xué)考察結(jié)果顯示6種成分及內(nèi)標(biāo)峰之間分離度良好，無內(nèi)源性物質(zhì)干擾測定；6個(gè)成分在分析濃度范圍內(nèi)均呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系，且R2均大于0.999；日內(nèi)及日間精密度的RSD值均小于10%，準(zhǔn)確度范圍為85.0%～105.3%；提取回收率范圍為109.6%～85.8%，基質(zhì)效應(yīng)范圍為107.6%～86.3%；血漿樣品在進(jìn)樣器中放置6 h及經(jīng)過3次循環(huán)凍融后的RSD值均小于10.3%。提示該方法線性較好，精密度高，回收率較高且穩(wěn)定性好，符合生物樣品的測定要求。

在體腸袢模型是在不影響血流供應(yīng)和神經(jīng)支配的前提下，通過腸段給藥，并進(jìn)行腸系膜靜脈插管，定時(shí)收集血樣，測定血中藥物濃度的一種實(shí)驗(yàn)方法。由于在體法不切斷血管及神經(jīng)，可保持腸道神經(jīng)完好及腸道中酶的活性，也保證了血液及淋巴液供應(yīng)不變，使得生物活性有所提高，測得的吸收速率速率指標(biāo)與在體法相近[13-14]。

POE中6個(gè)成分在正常及MI模型大鼠體內(nèi)經(jīng)腸袢模型吸收入血的量呈現(xiàn)出較大差異。通過分析6個(gè)成分經(jīng)十二指腸、空腸、回腸及結(jié)腸吸收入血的AUC值，發(fā)現(xiàn)十二指腸及回腸為正常組的主要吸收腸段，而MI模型組大鼠中結(jié)腸對各成分的吸收增加，且回腸及結(jié)腸為主要吸收部位。研究顯示，中藥的藥代動(dòng)力學(xué)特征受機(jī)體狀態(tài)的影響，當(dāng)機(jī)體發(fā)生生理及病理變化時(shí)，相關(guān)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、藥物代謝酶及細(xì)胞通透性等發(fā)生變化[15-16]，這可能是引起POE中六個(gè)成分在MI模型組的吸收部位后移的原因。其次，通過比較同一腸段在正常及MI模型狀態(tài)下對同一成分的吸收，發(fā)現(xiàn)各成分在模型狀態(tài)下的吸收均小于正常組。產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因可能與大劑量注射鹽酸異丙腎上腺素誘導(dǎo)心肌產(chǎn)生不可逆的缺血性損傷有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，藥物的吸收受機(jī)體的血流速率、血液灌注量等因素影響。而鹽酸異丙腎上腺素為β受體激動(dòng)劑，使心臟興奮性增加、心率加快及耗氧量增加，從而造成機(jī)體血流量降低、血液灌注減少及供氧下降[17]。

在本次研究中，在正常及MI模型狀態(tài)下同一腸段對6個(gè)成分的吸收具有較大差異，在正常組中，6個(gè)成分在十二指腸的吸收均隨著濃度的升高而增大，呈現(xiàn)濃度依賴性，提示葒草素等6個(gè)活性成分在正常大鼠體內(nèi)的吸收機(jī)制可能是被動(dòng)擴(kuò)散。研究發(fā)現(xiàn)，黃酮類化合物的吸收非常復(fù)雜，其吸收程度不僅取決于分子的脂溶性或是否糖基化，還依賴于其和膜表面大量轉(zhuǎn)運(yùn)體以及酶的眾多作用。黃酮類化合物中，少數(shù)糖苷類以原型的形式通過主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)被小腸吸收，大多數(shù)通常水解為苷元，由于黃酮苷元具有較大的疏水性，可以通過被動(dòng)擴(kuò)散透過生物膜而被吸收[18]。而在模型狀態(tài)下，六個(gè)成分在十二指腸的吸收較正常組復(fù)雜，提示模型6狀態(tài)下，6個(gè)成分的吸收機(jī)制不是單純的被動(dòng)擴(kuò)散，可能還存在其他的跨膜裝運(yùn)形式，其吸收機(jī)制還需進(jìn)一步研究。