葉景靜，盧覃培，賈舒涵，鄭紅蕓，孫承航，黃大林

(1.桂林醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室，廣西 桂林 541004；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院&北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所微生物化學(xué)研究室，北京 100050)

由于耐藥菌的日益泛濫，以腸球菌(Enterococcus)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、克雷伯菌屬(Klebsiellaspp.)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacterspp.)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)和產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的腸桿菌科細(xì)菌(ESBL-producingEnterobacteriaceae)為主要的 ESKAPE[1]耐藥問題現(xiàn)今給臨床上的治療已經(jīng)帶來了極大困難，所以新型抗生素的研發(fā)已經(jīng)是一個(gè)急需解決的問題。

放線菌是我們從自然界里發(fā)現(xiàn)抗生素的重要來源之一[2]。人們從微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了一大批具有不同化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物活性的抗生素，如氯霉素、紅霉素、利福霉素、慶大霉素和雷帕霉素等。據(jù)報(bào)道，現(xiàn)有抗生素約三分之二是由放線菌產(chǎn)生的[3]。然而，從普通環(huán)境中獲得新的微生物天然活性產(chǎn)物越來越困難[4]。因此，人們開始將研究的目光投向特殊環(huán)境微生物，如海洋、洞穴、熱泉和沙漠等，以期得到新的微生物種類，進(jìn)而獲得新的抗生素或其他生物活性物質(zhì)[5]。

紅樹林因?yàn)槭艿匠彼芷谛缘慕]，具有水分高、耐缺氧、鹽分高等特點(diǎn)，是生長(zhǎng)在熱帶、亞熱帶海岸潮間帶的特殊生態(tài)系統(tǒng)，是一種獨(dú)特的植物群落，該地區(qū)有著十分豐富新穎的放線菌微生物資源[6]。本次實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)選擇了污染少、物種豐富和研究相對(duì)較少的廣西茅尾海紅樹林[7]，發(fā)現(xiàn)2株活性較強(qiáng)的鏈霉菌，從生物學(xué)特征，抗菌活性和系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行研究，這為發(fā)現(xiàn)新抗生素提供了微生物資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1樣品 2株從廣西茅尾海紅樹林根際土壤獲得的鏈霉菌。

1.1.2培養(yǎng)基 ①分離用培養(yǎng)基：M1(高氏一號(hào)培養(yǎng)基)：海晶鹽3 g，可溶性淀粉20 g，MgSO40.5 g，K2HPO40.5 g，KNO31 g，瓊脂18 g，蒸餾水1 L，pH 7.2；M2(高氏二號(hào)培養(yǎng)基)：胰蛋白胨3 g，葡萄糖10 g，氯化鈉5 g，蛋白胨5 g，復(fù)合維生素1 mL，瓊脂18～20 g，蒸餾水1 L，pH 7.2；M3(海藻糖-脯氨酸培養(yǎng)基)：脯氨酸1 g，海藻糖5 g，(NH4)2SO41 g，NaCl 1 g,K2HPO41 g,MgSO4·7H2O 1 g,CaCl22 g,復(fù)合維生素1 mL，瓊脂18～20 g，pH 7.2；M4(棉子糖-組氨酸培養(yǎng)基)：L-組氨酸1 g，棉子糖5 g，KNO31 g，K2HPO41 g，NaCl 1 g，CaCl22 g，MgSO4·7H2O 1 g，瓊脂20 g，pH 7.3～7.4。② 純化選用培養(yǎng)基:改良ISP2 固體培養(yǎng)基。③發(fā)酵選用培養(yǎng)基:改良 ISP2 液體培養(yǎng)基。④檢定菌株選用培養(yǎng)基:Mueller-Hinton( M-H) 培養(yǎng)基(英國(guó)OXOID)。

1.1.3抑制劑 重鉻酸鉀 25.0 mg·L-1，放線菌酮 50.0 mg·L-1，萘啶酮酸 25.0 mg·L-1。

1.1.4檢定菌株 鮑曼不動(dòng)桿菌敏感株ATCC19606和耐藥株2799、金黃色葡萄球菌敏感株ATCC29213和耐藥株ATCC43300、大腸埃希菌敏感株ATCC25922和耐藥株2800、銅綠假單胞菌敏感株ATCC27853和耐藥株2774、糞腸球菌敏感株ATCC33186和耐藥株VRE310681、肺炎克雷伯菌敏感株ATCC10031和耐藥株ATCC700603，都由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所提供。

1.1.5試劑與儀器 硅膠板silica gel 60 F254 20180204，德國(guó)Merck公司；Chelex100 樹脂 20180911，美國(guó) BioRad公司；重鉻酸鉀 20180328，Sigma 公司；引物( 27F，1492R) 20180312、萘啶酮酸20171123、GelGreen染料20170927、DNA Marker 20180907，上海生工生物工程股份有限公司；放線菌酮20171207、2×Easy Taq SuperMix 20180907，北京全式金公司；乙酸乙酯(分析純) 20180726，二氯甲烷(分析純) 20190408，甲醇(分析純) 20180906，丙酮(分析純) 20180918，北京化工廠。

微量移液器 Eppendorf，Germany,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀OSB-2100，日本EYELA公司；電泳儀，北京市六一儀器廠；離心濃縮機(jī) Christ，德國(guó)；凝膠成像儀，美國(guó) Bio-Rad 公司；快速多任務(wù) PCR 儀，Gene Company；WZT-1M 細(xì)菌比濁儀，上海勁佳;旋轉(zhuǎn)式搖床，全恒溫培養(yǎng)箱、上海智城分析儀器制造公司；雙人單面潔凈工作臺(tái)，新加坡ESCO；半自動(dòng)TLC點(diǎn)板儀、全自動(dòng)展開缸 瑞士CAMAG 公司；臺(tái)式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠。

1.2 方法

1.2.1處理樣品 參考吳越等[8]的樣品處理方法，將采集的新鮮潮濕樣品置于無菌平皿中，在通風(fēng)的空間室，溫條件下自然風(fēng)干，并罩上紗布以防蚊蟲掉落，等樣品完全干燥后，再用無菌研缽將土壤研磨成細(xì)沙狀。分別稱取5 g不同土壤，倒于45 mL裝有無菌玻璃珠和無菌水的小錐形瓶中溶解，放在180 r·min-1、28 ℃ 的搖床里振蕩3 h；再吸取1 mL 土壤懸濁液于9 mL無菌水中，依次稀釋濃度為 10、1、0.1 g·L-1，接著分別吸取0.2 mL稀釋液涂布于4種不同分離培養(yǎng)基上，將分離平板用寬度適中的封口膜封口，避免培養(yǎng)過程中水分的蒸發(fā)和雜菌的污染。放入 28 ℃培養(yǎng)箱中，恒溫培養(yǎng) 4 周以上，隨時(shí)進(jìn)行形態(tài)觀察。

1.2.2菌種的分離、純化與保藏 培養(yǎng)2 ～8周，定期觀察平皿生長(zhǎng)情況，若有霉菌生長(zhǎng)，及時(shí)將燃燒酒精棉花覆蓋在上，如有菌落生長(zhǎng)，首先進(jìn)行初步排重，再挑取單菌落在培養(yǎng)基上，進(jìn)行四區(qū)劃線純化，以獲取純培養(yǎng)物。將新鮮菌體，盡量多的，存入20%無菌脫脂牛奶中，真空冷凍干燥后，保藏于4 ℃冰箱。同時(shí)，存入20%甘油管，保存于-80 ℃冰箱。

1.2.316S rRNA基因序列的擴(kuò)增及測(cè)序和構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹分析 ① 參考Chelex-100 法提取放線菌基因組DNA[9]。選用擴(kuò)增引物為通用引物27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′) 和1492R ( 5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)。PCR反應(yīng)體系為50 μL如下:2 × Easy Taq Supermix 25 μL，27F(10 μmol·L-1) 1.5 μL，模板 2 μL，1492R( 10 μmol·L-1) 1.5 μL，無菌水20 μL。PCR反應(yīng)條件如下:預(yù)變性95 ℃ 5 min;變性 94 ℃ 1 min，退火55 ℃ 1 min，延 伸72 ℃ 2 min，35 個(gè)循環(huán)；后延伸 72 ℃ 10 min。② PCR產(chǎn)物采用 1% 瓊脂糖凝膠 電壓110 V、時(shí)間30 min 電泳檢測(cè)，凝膠成像儀觀察電泳結(jié)果；獲得的陽性結(jié)果交由生工生物工程(上海) 股份有限公司測(cè)序。③ 將獲得的序列利用EzT-axon-e 工具[10]和 BLAST 程序進(jìn)行相似性比對(duì)。從中選擇相似性較高且是有效描述的典型菌株的 16S rRNA 基因序列作為參比對(duì)象，采用Clustal W進(jìn)行多序列比對(duì)[11]，采用MEGA 7.0 軟件[12]通過鄰接法( Neighbor-Joining) 進(jìn)行聚類分析，和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[13]，根據(jù) Kimura two parameter[14]模型估計(jì)系統(tǒng)進(jìn)化矩陣，重復(fù)取樣 1 000次進(jìn)行自展值( Bootstrap value) 分析，來評(píng)估系統(tǒng)進(jìn)化樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。

1.2.4抗菌活性篩選

1.2.4.1樣品的制備 將純化的菌株，裝于有 100 mL 液體發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中，分別接種3瓶，搖床轉(zhuǎn)速為180 r·min-1，溫度 28 ℃ 培養(yǎng)1周左右。將培養(yǎng)好的發(fā)酵液4000 r·min-1離心 30 min，將獲得上清液用等體積的乙酸乙酯分多次萃取，濃縮干燥后，用 3 mL的甲醇溶解酯相。萃取后的水相60 mL，揮發(fā)干燥，丙酮浸泡菌體靜置24 h，兩者都用 3 mL 1 ∶1甲醇水溶液溶解。

1.2.4.2檢定菌株的制備 將檢定菌株分別接種于裝有10 mL MH液體培養(yǎng)基的 50 mL 試管中，搖床設(shè)置 37 ℃、180 r·min-1培養(yǎng) 12～24 h，再將菌懸液調(diào)為0.5 麥?zhǔn)蠞舛葐挝话?8%～1% 濃度加入到溫度降至55 ℃左右的培養(yǎng)基中，倒之前先搖晃混勻，每皿倒入培養(yǎng)基15～20 mL ，置 4 ℃冰箱備用。

1.2.4.3抗菌活性篩選 篩選方法采取紙片擴(kuò)散法(K-B法)，在無菌圓形濾紙片(d=6 mm)上，分3次加入共60 μL 已制備完成的3類樣品(水相、酯相、菌體)，揮發(fā)干燥后，貼在含有檢定菌的培養(yǎng)皿上，將平皿放在37 ℃培養(yǎng)箱，12～24 h 后，測(cè)量抑菌圈的大小。

1.2.5活性物質(zhì)的TLC分析

1.2.5.1TLC展開條件的選擇 ①點(diǎn)樣：將 TLC 鋁箔板切成 1 cm×10 cm 長(zhǎng)條狀，距下邊緣 1 cm 處點(diǎn)樣，至鋁箔板吸附達(dá)到飽和為止②分析：選擇二氯甲烷：甲醇體積比分別為 49 ∶1，19 ∶1，9 ∶1 的展開劑，在展開缸中預(yù)飽和 15 min，然后垂直放入已經(jīng)點(diǎn)樣的 TLC 鋁箔條。③ 測(cè)活：待TLC鋁箔板上的溶劑揮發(fā)干后，在紫外燈 (254 nm) 下標(biāo)記各點(diǎn)位置，將它們分別貼于 MRSA 檢定板上，37 ℃下培養(yǎng) 16 h 后，觀察抑菌圈的位置，并計(jì)算出 Rf值，確定活性點(diǎn)的位置。

1.2.5.2 TLC板制備活性物質(zhì) 粗提物用少量甲醇溶解后，用 CAMAG LINOMAT5 半自動(dòng)點(diǎn)樣儀點(diǎn)樣于硅膠 20 cm×10 cm 硅膠板 (silica gel 60 F254,Merck) 上，以二氯甲烷 ∶甲醇=9 ∶1 (V/V) 為展開劑，上行展開分離，待溶劑揮干后，在紫外燈 (254 nm) 下標(biāo)出條帶，并按展開方向?yàn)闂l帶編號(hào)。將條帶分別刮下，根據(jù)條帶的 Rf值選擇適當(dāng)極性的洗脫劑將活性成份充分洗下，收集洗脫液并濃縮備用。

2 結(jié)果

2.1 抗菌活性采用標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行抗菌活性試驗(yàn)，結(jié)果顯示菌株B353和B486對(duì)革蘭陽性菌和革蘭陰性菌均具有較好的活性( Tab 1)，菌株B486對(duì)金黃色葡萄球菌有較好的抗菌活性，其中敏感株抑菌活性弱于耐藥株，菌株B353對(duì)糞腸球菌和金黃色葡萄球菌均表現(xiàn)出較強(qiáng)抑菌活性，其中對(duì)金黃色葡萄球菌的抗菌活性較強(qiáng)(Fig 1)。

Tab 1 Results of antimicrobial activity screening of culturable strains B353 and B486(mm)

Fig 1 Partial antimicrobial activity of culturable strains B353 and B486A:Antibacterial activities of Enterococcus faecalis sensitive strain;B:Antibacterial activities of Staphylococcus aureus resistant strain;a:B353;b:B486.

2.2 菌落特征在改良的 ISP2 培養(yǎng)基上，菌株B353和 B486 生長(zhǎng)狀態(tài)良好，菌落緊貼于培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)，多皺褶，干燥，典型的放線菌形態(tài)。菌株B353菌落起先白色，逐漸生長(zhǎng)轉(zhuǎn)為灰白色，質(zhì)地疏松，布滿孢子絲，易被挑取。B486表面干燥，有褶皺，質(zhì)地較密，菌落為白色，當(dāng)孢子絲產(chǎn)生大量孢子并布滿菌落表面形成顆粒狀，生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)，不易挑起(Fig 2)。

Fig 2 Colony morphology of two strains of Streptomyces under macroscopic stereomicroscope and on culture medium

2.3 基于16S rRNA構(gòu)建2株放線菌的系統(tǒng)發(fā)育樹菌株B353和菌株B486分別測(cè)通獲得菌株的16S rRNA 基因序列(1 364 bp和1 375 bp)，將序列提交 GenBank，登錄號(hào)分別為MN199494和MN199470。登錄 EzTaxon，比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株B353和菌株B486與StreptomycesseoulensisNRRL B-24310T的相似率都為99.93%，且菌株B353和菌株B486在 N-J 樹上形成一簇再與之為一簇，菌株B353和菌株B486 初步鑒定是鏈霉菌屬StreptomycesseoulensisNRRL B-24310T的兩個(gè)變種( Fig 3) 。

Fig 3 Neighbour-joining phylogenetic tree based on 16S rRNA sequence of B353 and B486

2.4 活性物質(zhì)TLC 分析結(jié)果菌株B353發(fā)酵液粗提物在二氯甲烷 ∶甲醇=9 ∶1 的條件下有較好的展開效果，在Rf值0.8的位置顯示出了抑菌活性，確定二氯甲烷 ∶甲醇=9 ∶1 為最佳展開條件，TLC 板上 9～10、10 和 10～11 號(hào)條帶有抗金葡菌活性，且 10號(hào)帶活性最強(qiáng)，而其他條帶無活性。菌株 B486發(fā)酵液粗提物在二氯甲烷 ∶甲醇=9 ∶1 的條件下有較好的展開效果，在Rf值0.7的位置顯示出了抑菌活性，確定二氯甲烷 ∶甲醇=9 ∶1 為最佳展開條件，TLC 板上 11、12 和 12～13號(hào)條帶有抗金葡菌活性，且 12號(hào)帶活性最強(qiáng)，而其他條帶無活性( Fig 4)。菌株B353和菌株B486洗脫過濾后得到活性物質(zhì)。

Fig 4 TLC profile of EA extract of strain B353 and strain B486 and anti-MRSA results of each bandA:TLC profile of EA extract sample of strain B353 cultural broth at UV 254 nm,band 9～10,10 and 10～11 (red);B:The anti-MRSA results of the bands from TLC,band 9～10,10 and 10～11 showed inhibition zone;C:TLC profile of EA extract sample of strain B486 cultural broth at UV 254 nm,band 11,12 and 12～13 (red);D:The anti-MRSA results of the bands from TLC,band 11,12 and 12～13 showed inhibition zone.

3 討論

生長(zhǎng)在紅樹林這種極端環(huán)境的放線菌有著不同于陸地微生物的代謝途徑，因此其次級(jí)代謝產(chǎn)物在類型、生物活性和結(jié)構(gòu)等方面都表現(xiàn)出與普通環(huán)境放線菌有著不同的特點(diǎn)[15]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，紅樹林土壤中分離出的放線菌遠(yuǎn)多于植物內(nèi)生分離出的放線菌[16]，其中鏈霉菌屬是紅樹林土壤放線菌中的優(yōu)勢(shì)菌屬。Zhang 等[17]在 1 株鏈霉菌中分離得到了 2 個(gè)對(duì)大腸桿菌有著較好的抗菌活性的新化合物。許琳雅等[18]從StreptomycesNo.H74-18 菌株中發(fā)現(xiàn)新化合物 antimycin A18 及 A19和分離得到抗霉素類化合物。這些研究表明，紅樹林中的鏈霉菌有著巨大的開發(fā)潛能和研究?jī)r(jià)值。

廣西茅尾海紅樹林是我國(guó)特有的巖灘紅樹林，有著豐富和新穎的土壤微生物。本實(shí)驗(yàn)研究廣西茅尾海來源的兩株鏈霉菌的生物特征和抗菌活性。兩株菌B353和B486在測(cè)序比對(duì)后，通過構(gòu)建進(jìn)化樹和表征的顯微鏡觀察，初步鑒定為鏈霉菌屬的兩個(gè)變種。菌株B353和菌株B486對(duì)革蘭陽性菌和革蘭陰性菌均具有較好的活性，說明兩株菌的抗菌能力較為廣譜。其中菌株B353的抗菌活性明顯強(qiáng)于菌株B486，兩份活性物質(zhì)對(duì)金黃色葡萄球菌的抗菌能力也是各有區(qū)別。這為我們篩選新型抗生素打下了一定的物質(zhì)基礎(chǔ)。

大量的研究結(jié)果表明，紅樹林有著豐富的鏈霉菌其生物活性代謝物質(zhì)依然有著研究潛力。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明廣西紅樹林中放線菌資源豐富，其中鏈霉菌屬對(duì)金黃色葡萄球菌良好的抗菌活性，這為活性次級(jí)代謝產(chǎn)物的篩選和新型抗生素的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。