周湘華，周壽紅，趙其輝

(1.湖南環(huán)境生物職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥理教研室，湖南 衡陽 421001；2.廣西腦與認(rèn)知神經(jīng)科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，3.桂林醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，廣西 桂林 541104)

關(guān)健詞：二氫楊梅素；成骨細(xì)胞；地塞米松；凋亡；轉(zhuǎn)錄因子EB；自噬

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis,OP)是人體衰老的主要表現(xiàn)形式。OP的主要臨床表現(xiàn)為骨骼的密度降低，骨質(zhì)被破壞和容易引發(fā)骨折。繼發(fā)性O(shè)P的常見原因之一是大量的糖皮質(zhì)激素的使用，被稱為糖皮質(zhì)激素引起的骨質(zhì)疏松癥(glucocorticoid-induced osteoporosis,GIOP)[1]。自噬是通過溶酶體途徑，降解和重新利用細(xì)胞中的大分子物質(zhì)、衰老蛋白和受損的細(xì)胞器的一種生物過程。研究發(fā)現(xiàn)[2]，OP的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程與異常的自噬關(guān)系密切。轉(zhuǎn)錄因子EB(transcriptionfactor EB,TFEB)是調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬的重要途徑[3]。二氫楊梅素(dihydromyricetin,DMY)是一種天然的二氫黃酮類物質(zhì)，最初被發(fā)現(xiàn)存在于蛇葡萄類植物藤茶的莖葉中[4]。DMY藥理學(xué)功效較為廣泛，包括抗炎、抑制腫瘤、抗氧化、胃粘膜保護(hù)和神經(jīng)保護(hù)作用等[5]。有研究發(fā)現(xiàn)[6]，DMY參與了骨代謝的調(diào)控，DMY對(duì)骨代謝具有雙層調(diào)控作用，既促進(jìn)成骨也抑制破骨效應(yīng)，DMY還可以減輕去卵巢引起的雌性大鼠的骨質(zhì)丟失[7]，但其機(jī)制還不清楚。研究發(fā)現(xiàn)[8]，染料木黃酮等天然黃酮類物質(zhì)可調(diào)節(jié)TFEB的活性，提示黃酮類化合物能調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬。因此，本研究旨在觀察DMY對(duì)地塞米松(dexamethasone,DEX)誘導(dǎo)的小鼠成骨細(xì)胞MC3T3-E1細(xì)胞凋亡的影響，并從TFEB-自噬途徑的角度探討DMY抑制OP的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑小鼠成骨細(xì)胞株MC3T3-E1細(xì)胞為美國模式培養(yǎng)物研究所的產(chǎn)品。DMY為中國大連美侖生物科技有限責(zé)任公司的產(chǎn)品(批號(hào)：935653-81-6)，α-MEM培養(yǎng)基(α-minimum Eagle’s medium)為美國英杰生命(Invitrogen)技術(shù)有限公司的產(chǎn)品(批號(hào)：758267)，胎牛血清為杭州四季青生物科技公司的產(chǎn)品(批號(hào)：195271)，地塞米松(批號(hào)：MFCD00064136)、胰蛋白酶(批號(hào)：87254-019)、噻唑藍(lán)[3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT](批號(hào)：BS1912)、二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)(批號(hào)：34869)、抗壞血酸(批號(hào)：A92902)、乙二胺四乙酸(Elhylene diamine tetraacetic acid,EDTA)(批號(hào)：200-449-4)為美國Sigma公司的產(chǎn)品。二喹啉甲酸法法蛋白定量測(cè)試盒(批號(hào)：77191)為美國皮爾斯(Pierce)公司的產(chǎn)品。兔抗鼠TFEB(批號(hào)：sc-58742-R)、Beclin 1(批號(hào)：sc-47821)和微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3(microtubule-associated protein light chain-3,LC3) (批號(hào)：sc-47821)、p62/SQSTM1(批號(hào)：sc-47821)和β-actin(批號(hào)：sc-68972-R)一抗以及相應(yīng)二抗(批號(hào)：sc-68972-R)為美國Santa Cruz公司的產(chǎn)品。

1.2 儀器TECNAI 20 U-TWIN型透射電鏡(荷蘭飛利浦電子光學(xué)公司)；F.A.M.E.16/20型全自動(dòng)酶標(biāo)儀(瑞士哈美頓公司)；UV-3600型紫外分光光度計(jì)(日本島津)；SZ51/SZ61型光學(xué)顯微鏡(日本奧林巴斯)；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(日本島津)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)分組用α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)MC3T3-E1細(xì)胞，培養(yǎng)液含有50 mg·L-1抗壞血酸和0.1胎牛血清，細(xì)胞培養(yǎng)在37 ℃和5%的CO2的培養(yǎng)箱中。每2 d更換一次細(xì)胞培養(yǎng)液，細(xì)胞傳代時(shí)，先用胰蛋白酶適度消化，制備成細(xì)胞懸液，再進(jìn)行傳代。處于對(duì)數(shù)生長期的MC3T3-E1細(xì)胞被用于后續(xù)的研究。細(xì)胞隨機(jī)地分為以下各組：對(duì)照組：用α-MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞12 h；DEX組：用含10 μmol·L-1DEX的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞12 h；DMY組：用含10、20和40 μmol·L-1DMY的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞12 h；DEX+DMY組：先用10、20和40 μmol·L-1DMY處理細(xì)胞0.5 h，再加入10 μmol·L-1的DEX繼續(xù)共同處理12 h。雷帕霉素組：用含雷帕霉素(5 μmol·L-1)的α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)MC3T3-E1細(xì)胞12 h。DEX+DMY+ 雷帕霉素組：先用5 μmol·L-1雷帕霉素處理細(xì)胞0.5 h，用20 μmol·L-1DMY處理細(xì)胞0.5 h，然后再加入10 μmol·L-1的DEX共同繼續(xù)培養(yǎng)12 h。

1.4 MTT分析各處理因素結(jié)束后，將MTT工作液20 μL加入到每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)孔中，繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)4 h。再將DMSO溶液150 mL加入到每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)孔中，培養(yǎng)板置于搖床上，搖晃振動(dòng)10 min。用酶標(biāo)儀測(cè)量各細(xì)胞培養(yǎng)孔的吸光度，檢測(cè)波長預(yù)先設(shè)為570 nm。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)處理結(jié)束后，用磷酸鹽緩沖液洗MC3T3-E1細(xì)胞3次，通過離心收集MC3T3-E1細(xì)胞。加入500 μL的Binding buffer重懸細(xì)胞，再加入5 μL磷脂結(jié)合蛋白V(Annexin V)工作液，混勻，再加入5 μL碘化丙啶(Propidium iodide,PI)工作液，混勻；避光室溫下孵育15 min，上機(jī)檢測(cè)。計(jì)數(shù)MC3T3-E1細(xì)胞被Annexin V-PI雙染呈現(xiàn)陽性的細(xì)胞數(shù)，然后算出細(xì)胞的凋亡百分率。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.6 Western blot檢測(cè)提取各組細(xì)胞的總蛋白，通過試劑盒提取核蛋白。采用二喹啉甲酸法測(cè)定樣本的蛋白濃度。將總蛋白樣品添加到加樣緩沖液中，用電爐燒開煮沸，以使蛋白質(zhì)完全充分變性。通過聚丙烯酰胺凝膠電泳的方法將已經(jīng)完全變性的蛋白質(zhì)分離，再通過電轉(zhuǎn)移的方法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(polyvinyl fluoride,PVDF)膜上。為了阻斷非特異性抗原，將PVDF膜與脫脂牛奶(0.05)在室溫下進(jìn)行孵育2 h。加入兔抗小鼠TFEB(1 ∶500)、Beclin-1(1 ∶400)、LC-3(1 ∶300)、p62(1 ∶400)和β-actin(1 ∶400)的一抗，4 ℃過夜。采用Tris-Tween緩沖鹽溶液(Tris Tween buffer salt solution,TBST)液清洗PVDF膜3次，然后加入二抗，繼續(xù)在4 ℃條件下孵育4 h，再通過TBST液清洗PVDF膜3次。經(jīng)曝光、顯影、定影后，通過圖像分析軟件對(duì)膠片進(jìn)行掃描，核蛋白的檢測(cè)以組蛋白為內(nèi)參照，其他以β-actin作為內(nèi)參照，對(duì)目的蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行半定量分析。

1.7 透射電鏡觀察MC3T3-E1細(xì)胞以每孔1×106個(gè)細(xì)胞的數(shù)量接種在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。當(dāng)細(xì)胞生長融合度達(dá)到0.85時(shí)加入各處理因素，在處理結(jié)束后，用胰酶對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化，通過離心收集細(xì)胞于離心管。將細(xì)胞塊狀顆粒放到戊二醛溶液(0.02)中進(jìn)行固定，在4 ℃下固定時(shí)間為2 h。細(xì)胞團(tuán)塊經(jīng)常規(guī)的包埋、切片、重金屬染色后，通過透射電鏡觀察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，然后拍照記錄結(jié)果。用圖像分析軟件測(cè)量細(xì)胞中單個(gè)自噬體的面積，計(jì)算自噬體的總面積，然后計(jì)算自噬體總面積占細(xì)胞質(zhì)面積的百分率。

2 結(jié)果

2.1 DMY對(duì)DEX誘發(fā)的MC3T3-E1細(xì)胞凋亡的影響結(jié)果如Tab 1所示：MC3T3-E1細(xì)胞的凋亡率DEX組與對(duì)照組比較明顯增加(P<0.05)，而DMY組(10、20和40 μmol·L-1)與對(duì)照組相比較MC3T3-E1細(xì)胞凋亡率的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與DEX組比較，DEX+DMY(20、40 μmol·L-1)組細(xì)胞凋亡率明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。與對(duì)照組比較，不同濃度DMY和DEX對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞的細(xì)胞活力的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Tab 2)。由于DEX+DMY(40 μmol·L-1)組與DEX+DMY(20 μmol·L-1)組相比較其細(xì)胞的凋亡率雖然有降低趨勢(shì)，但是其差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而40 μmol·L-1DMY有導(dǎo)致細(xì)胞活力降低的趨勢(shì)(Tab 2)。因此選擇DMY(20 μmol·L-1)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

Tab 1 Effects of DMY on apoptosis induced by dexamethasone in MC3T3-E1 cells n=5)

Tab 2 Effects of DEX and DMY on viability of MC3T3-E1 cells n=3)

2.2 DEX和DMY對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響結(jié)果如Fig 1所示，對(duì)照組MC3T3-E1細(xì)胞的細(xì)胞核染色質(zhì)分布較均勻，胞質(zhì)中可見少量的自噬體，細(xì)胞的形狀多數(shù)呈現(xiàn)為橢圓形。DEX組MC3T3-E1細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)可見具有雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體(箭頭所示)，細(xì)胞核大多呈現(xiàn)不規(guī)則形。DEX組細(xì)胞中自噬體的數(shù)量明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，自噬體在細(xì)胞質(zhì)中所占比例明顯高于對(duì)照組(0.018±0.002和0.165±0.009)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。DEX+DMY(20 μmol·L-1)組的自噬體數(shù)量明顯低于DEX組，且自噬體在細(xì)胞質(zhì)中所占比例明顯降低(0.165±0.009，0.049±0.005)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 DEX和DMY對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響結(jié)果如Fig 2所示，與對(duì)照組比較，DEX組細(xì)胞中Beclin-1和LC3-Ⅱ的蛋白表達(dá)及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值均明顯增加，p62的蛋白表達(dá)明顯降低(均P<0.05)。與DEX組比較，DEX+DMY(20 μmol·L-1)組Beclin-1、LC3-Ⅱ的表達(dá)和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值均明顯降低，而p62的表達(dá)明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

Fig 1 Effect of DEX and DMY on ultrastructure of MC3T3-E1 cellsA:Cell control;B:DEX (1 μmol·L-1)；C：DMY(20 μmol·L-1)；D：DEX+DMY.Arrows show autophagic vacuole.

Fig 2 Effect of DEX and DMY on expressions of autophagy related proteins in MC3T3-E1 n=5)*P<0.05 vs control group;#P<0.05 vs DEX group.

2.4 雷帕霉素對(duì)DMY抑制DEX誘導(dǎo)的MC3T3-E1細(xì)胞凋亡的影響結(jié)果如Tab 3所示，DEX+DMY(20 μmol·L-1)+ 雷帕霉素組MC3T3-E1細(xì)胞凋亡率與DEX+DMY(20 μmol·L-1)組相比較明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這提示細(xì)胞自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素部分逆轉(zhuǎn)了DMY抑制DEX誘導(dǎo)的MC3T3-E1細(xì)胞凋亡的作用。

Tab 3 Effect of rapamycin on DMY inhibiting apoptosis in MC3T3-E1 cells n=5)

2.5 DMY對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞中TFEB蛋白表達(dá)和核轉(zhuǎn)位的影響結(jié)果如Fig 3所示，與對(duì)照組比較，DEX組細(xì)胞中TFEB總蛋白和TFEB在細(xì)胞核中的表達(dá)及TFEB在核中表達(dá)與TFEB總蛋白的比值均明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。與DEX組比較，DEX+DMY(20 μmol·L-1)組細(xì)胞中TFEB總蛋白和TFEB在細(xì)胞核中的表達(dá)及TFEB在核中表達(dá)與TFEB總蛋白的比值均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

Fig 3 Effect of DMY on TFEB protein expression and nuclear translocation in MC3T3-E1 n=5)*P<0.05 vs control group;#P<0.05 vs DEX group.

3 討論

本研究的結(jié)果顯示，10 μmol·L-1的DEX處理MC3T3-E1細(xì)胞12 h后，細(xì)胞凋亡率明顯升高，而DMY+ DEX組與DEX組比較，細(xì)胞凋亡率明顯降低。DEX處理MC3T3-E1細(xì)胞后，成骨細(xì)胞的自噬活性明顯增加，而DMY可抑制DEX誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞的自噬活性增加，進(jìn)一步的結(jié)果顯示，細(xì)胞自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素部分取消了DMY抑制DEX誘導(dǎo)的MC3T3-E1細(xì)胞凋亡的效應(yīng)。DMY明顯降低了DEX誘導(dǎo)的TFEB總蛋白和TFEB在細(xì)胞核中表達(dá)及TFEB在核中表達(dá)與TFEB總蛋白的比值增加。

糖皮質(zhì)激素的藥理作用廣泛，如：抑制免疫反應(yīng)、抗毒、抗休克和消炎等。研究發(fā)現(xiàn)，糖皮質(zhì)激素參與了骨代謝的調(diào)控過程，生理濃度的糖皮質(zhì)激素既可促進(jìn)成骨細(xì)胞的成骨效應(yīng)，也可增強(qiáng)破骨細(xì)胞的溶骨效應(yīng)，維持骨的生成與破壞之間的平衡，維持正常的骨代謝。然而，過量的糖皮質(zhì)激素會(huì)破壞成骨與骨溶解間的平衡，最終引發(fā)GIOP。研究發(fā)現(xiàn)，高濃度的DEX能導(dǎo)致成骨細(xì)胞的凋亡[9]。本研究采用10 μmol/L的DEX處理成骨細(xì)胞系MC3T3-E1細(xì)胞，結(jié)果顯示，DEX明顯提高了MC3T3-E1細(xì)胞的凋亡率，這與以往的研究結(jié)果是一致的。因此抑制成骨細(xì)胞凋亡可能是防止GIOP的重要策略和途徑。

藤茶是一種常用于感冒發(fā)熱和咽喉腫痛等疾病的中藥，DMY是藤茶的主要活性成分，是一種天然的雙氫黃酮類化合物。DMY的藥理學(xué)功效較廣，如：抑制氧化應(yīng)激、抑制炎癥反應(yīng)、抑制腫瘤細(xì)胞的生長、抗動(dòng)脈粥樣硬化和神經(jīng)保護(hù)作用等，因此DMY具有較好的臨床應(yīng)用前景[10]。研究表明[11]，DMY具有抑制OP的功效，DMY能抑制由磨損顆粒誘導(dǎo)的小鼠顱骨組織的骨溶解，抑制破骨細(xì)胞的破骨作用，提高骨骼的密度，但是其具體的機(jī)制尚不完全清楚。本研究的結(jié)果表明，DMY抑制了DEX誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡，因而抑制成骨細(xì)胞凋亡可能是DMY發(fā)揮抗OP功效的機(jī)制之一。

DEX導(dǎo)致成骨細(xì)胞凋亡的機(jī)制十分復(fù)雜，研究表明自噬參與了DEX引發(fā)的成骨細(xì)胞凋亡的過程[12]。自噬是一種通過溶酶體的作用來降解細(xì)胞內(nèi)的錯(cuò)誤折疊的蛋白、長壽蛋白質(zhì)、損傷的細(xì)胞器和病原微生物的生物過程，是維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的重要代謝途徑[13]。研究發(fā)現(xiàn)，DEX處理可增加大鼠成骨細(xì)胞自噬水平，抑制成骨作用，誘導(dǎo)GIOP，而通過自噬抑制劑抑制成骨細(xì)胞的自噬可抑制GIOP[14]。有研究發(fā)現(xiàn)，DMY對(duì)細(xì)胞的自噬活性具有調(diào)控作用，從而調(diào)控細(xì)胞的自噬性死亡[15]。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DEX明顯提高了MC3T3-E1細(xì)胞的凋亡率，也明顯增加了MC3T3-E1細(xì)胞中自噬體的數(shù)量，明顯上調(diào)了Beclin-1和LC3-Ⅱ自噬標(biāo)志性蛋白的蛋白表達(dá)水平以及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值，而明顯下調(diào)自噬底物p62的蛋白表達(dá)。這些結(jié)果提示DEX提高了MC3T3-E1細(xì)胞的自噬水平，這與以前的研究結(jié)果是一致的[16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步顯示，DMY處理明顯減少M(fèi)C3T3-E1細(xì)胞中自噬體的數(shù)量，明顯下調(diào)了Beclin-1和LC3-Ⅱ的蛋白表達(dá)以及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值，明顯上調(diào)p62的蛋白表達(dá)。這些結(jié)果提示DMY可抑制DEX誘導(dǎo)的MC3T3-E1細(xì)胞凋亡，也可降低MC3T3-E1細(xì)胞的自噬水平。為了明確MC3T3-E1細(xì)胞的自噬水平的改變是否參與了DMY抑制DEX誘導(dǎo)的MC3T3-E1細(xì)胞凋亡的過程，我們進(jìn)一步觀察了自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素對(duì)DMY作用的影響，結(jié)果表明，雷帕霉素逆轉(zhuǎn)了DMY抑制DEX誘發(fā)的MC3T3-E1細(xì)胞凋亡的作用。這些結(jié)果提示DMY抑制DEX誘發(fā)的MC3T3-E1細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制可能與DMY抑制細(xì)胞自噬活性有關(guān)。但是DMY對(duì)細(xì)胞自噬的影響還存在矛盾的地方，我們以往的研究顯示，DMY可上調(diào)細(xì)胞自噬活性，而抑制MPP+誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷[17]，這些矛盾產(chǎn)生的原因可能與細(xì)胞種類不同以及不同病理生理過程中自噬的作用不一樣有關(guān)。

細(xì)胞自噬的調(diào)控過程十分復(fù)雜，涉及到PI3KⅠ/mTOR、PI3KⅢ和AMPK/Sirt1等信號(hào)通路[18]，而這些均是在蛋白翻譯后的水平對(duì)自噬進(jìn)行調(diào)控。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)也是細(xì)胞自噬調(diào)控的重要方式。mTOR的活性被抑制后可激活TFEB，而TFEB通過核轉(zhuǎn)位后可調(diào)節(jié)自噬相關(guān)基因和溶酶體生成與成熟相關(guān)的多個(gè)關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而增強(qiáng)細(xì)胞的自噬水平。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，DMY明顯降低了DEX誘導(dǎo)的TFEB總蛋白和TFEB在細(xì)胞核中的表達(dá)上調(diào)，也明顯抑制了DEX誘導(dǎo)的核轉(zhuǎn)位。這些結(jié)果提示DMY抑制DEX誘導(dǎo)的MC3T3-E1細(xì)胞自噬水平增加可能涉及到TFEB信號(hào)。引發(fā)TFEB核轉(zhuǎn)位的原因有很多，包括TFEB的脫磷酸化和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等。那么DMY是如何導(dǎo)致TFEB發(fā)現(xiàn)核轉(zhuǎn)位，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞自噬，抑制DEX誘發(fā)的成骨細(xì)胞凋亡，這些問題均有待進(jìn)一步的研究。

總之，本研究結(jié)果提示DMY抑制DEX誘發(fā)的成骨細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與DMY下調(diào)TFEB表達(dá)，抑制其核轉(zhuǎn)位，進(jìn)而抑制細(xì)胞自噬有關(guān)。本研究為二氫楊梅素用于GIOP的防治提供了新的線索和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

(致謝：本課題在南華大學(xué)神經(jīng)科學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)室完成，特別感謝實(shí)驗(yàn)室的指導(dǎo)老師及各位參與者！)