張金葉 劉小花 吳明秋 趙元莙

(重慶師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,動物生物學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶 401331)

碘泡蟲屬M(fèi)yxobolus是碘泡蟲科最大的屬,迄今已報到900多種[1—4],絕大部分碘泡蟲屬種類均基于形態(tài)學(xué)為主體的經(jīng)典分類學(xué)定種,其中許多黏孢子蟲種之間擁有極其相似的形態(tài)特征[5—8]。然而,隨著不斷深入的研究顯示,盡管一些物種的形態(tài)特征已出現(xiàn)一定的差異,但是它們的分子數(shù)據(jù)實(shí)際上依然顯示為同種[5,9]。這些結(jié)果給黏孢子蟲物種的識別和鑒定提出了挑戰(zhàn)。因此,迄今分子生物學(xué)結(jié)合形態(tài)學(xué)、宿主特異性、組織向性和地理分布的現(xiàn)代分類學(xué)方法用于黏孢子蟲種鑒定已經(jīng)被廣泛推薦和接受[10—17]。

種群分化在微生物、植物、動物等生物類群相關(guān)領(lǐng)域已有廣泛的研究[18—20]。關(guān)于黏孢子蟲的種群研究也有相關(guān)報道,例如,2006年Whipps和Kent[9]報道分別在日本、澳大利亞、東太平洋和東大西洋四個主要區(qū)域發(fā)現(xiàn)的蛇鯖庫道蟲Kudao thyrsites在形態(tài)學(xué)和遺傳學(xué)上已經(jīng)出現(xiàn)差異。來自美國加利福尼亞州和英國哥倫比亞的小雙角小囊蟲Parvicapsula minibicornis核糖體小亞基有大于98.9%的相似性,且可以分為15個表型[21]。Gen-Bank中北美和歐洲的腦碘泡蟲Myxobolus cerebralis的ITS (Internal Transcribed Spacer) 也有7個堿基的變異[22]。2012年Karlsbakk和Koie[23]報道了來自丹麥和挪威的球形反曲孢蟲Sigmomyxas phaerica兩個地理種群 (感染相同宿主頜針魚Belone belone)與來源于丹麥的種群 (感染游沙蠶Nereis pelagic)有著較高的親緣關(guān)系。王茂等[24]對中國重慶、湖北和意大利的透鏡碘泡蟲Myxobolus lentisuturalis不同種群進(jìn)行了遺傳變異、地理位點(diǎn)、宿主和寄生部位分析,結(jié)果表明宿主因素對透鏡碘泡蟲種群分化的影響大于地理隔離。

田中碘泡蟲Myxobolus tanakaiKato,et al.,2017由日本學(xué)者Kato等[25]首次從黑川地區(qū)鯉Cyprinus carpioLinnaeus,1758 的鰓檢獲并描述,且提供了18S rDNA分子數(shù)據(jù)和系統(tǒng)發(fā)生學(xué)的研究結(jié)果。近期我們從中國重慶江津地區(qū)金魚Carassiusauratus auratusLinnaeus,1758 的鰓部檢獲了田中碘泡蟲。由于田中碘泡蟲的兩個種群地理分布不同,宿主類型也不相同,故這是又一例研究地理隔離和宿主種類差異對黏孢子蟲種群分化影響的素材?；诖?本文對其進(jìn)行了形態(tài)學(xué)、分子系統(tǒng)學(xué)和種群分化的研究,旨在豐富該種的形態(tài)和分子數(shù)據(jù),以及黏孢子蟲種內(nèi)分化和系統(tǒng)進(jìn)化研究的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本收集和鑒定

15條金魚樣本于2017年6月從中國重慶江津地區(qū)長沖熱帶魚良種場 (106°16′E,N29°29′N) 購買,活魚樣本帶回實(shí)驗(yàn)室后缺氧致死、解剖;而后將從魚鰓部檢獲的孢囊轉(zhuǎn)移到載玻片并戳破獲得游離孢子。新鮮孢子用蒸餾水沖洗三遍,離心(2000×g)沉淀。蟲種鑒定、樣本處理和測量均遵循Lom等[26]和趙元莙等[4,27]的方法。

1.2 基因組DNA提取、目的基因擴(kuò)增、克隆和測序

首先用蒸餾水洗滌從金魚鰓部獲得并保存于95%乙醇中的黏孢子蟲樣本兩次,每次10000×g離心10min除去多余酒精成分;利用DNeasy血液和組織試劑盒 (QIAGEN,Düsseldorf,Germany) 提取洗滌好的樣本基因組,提取過程嚴(yán)格按照說明書執(zhí)行。18S rDNA 引物包括正向引物18E: 5′-CTGGTTGATCCTGCCAGT-3′;反向引物18R: 5′-CTACGGAAACCTTGTTACG-3′。PCR體系25 μL,包括2.7 μL 10× Buffer,2 mmol/L MgCl22.7 μL,0.25 mmol/L dNTP 2.8 μL,每對15 pmol 18S rDNA引物各0.5 μL,15 ng基因組DNA,Taq酶0.2 μL (TaKaRa,Otsu,Japan) 和雙蒸水。PCR程序如下: 94℃預(yù)變性5min,然后執(zhí)行35個循環(huán)94℃變性45s,60℃退火50s,72℃延伸2min,最后72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物通過1.0%瓊脂糖電泳和DNA瓊脂糖膠試劑盒 (Omega Bio-Tek,Norcross City,GA) 電泳分離和純化,隨后插入到pMD18-T載體 (TaKaRa,Otsu,Japan)?？寺⊥ㄟ^ABI Prism 377 DNA Sequencer (Applied Biosystems Inc.,Foster City,California) 完成測序。

圖1 田中碘泡蟲的成熟孢子及其宿主Fig.1 Mature spores of Myxobolus tanakai and its host

1.3 18S rDNA的二級結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)學(xué)分析

通過GenBank中BLAST對本研究所獲的黏孢子蟲序列進(jìn)行序列同源性比對;18S rDNA使用BioEdit進(jìn)行手動編輯[28];Muscle3.6[29]軟件進(jìn)行比對;Paup 4.0和Modeltest 3.6用于模型計(jì)算;堿基頻率為0.2441、0.1858、0.2768、0.2934,堿基替換率為0.9607、3.9297、1.6333、0.5750、5.0662和1.0000,γ分布形狀參數(shù)為0.4178,不變位點(diǎn)比例為0.2895;使用DNA Star計(jì)算遺傳距離和變異度;利用RNA Structure 5.2基于自由能最小化進(jìn)行18S rRNA二級結(jié)構(gòu)預(yù)測,參選European Ribosomal RNA database的二級結(jié)構(gòu)模型,使用RNAViz 2.0[30]進(jìn)行手動調(diào)整;選取了與本研究相似黏孢子蟲的18S rDNA的三個高變區(qū) (V2、V4和V7區(qū))分析它們的變異度。

系統(tǒng)學(xué)分析選用了65條黏孢子蟲18S rDNA序列,包括本研究獲得的3條和選自NCBI數(shù)據(jù)庫的感染鯉科魚且與本研究遺傳和形態(tài)相似黏孢子蟲的62條有效18S rDNA序列[4,31—33],用四角庫道蟲Kudoa quadricomis(GenBank登錄號: FJ792721) 和蒜芥庫道蟲Kudoa alliaria(GenBank登錄號: DQ182561)作外群。MrBayes和PhyML 4.0用于構(gòu)建Bayes樹和ML樹;Bayes程序共執(zhí)行1000000代,每100代收集結(jié)果,ML樹運(yùn)算100代。最后用MEGA6.0[34]和Adobe illustrator CS6完成系統(tǒng)樹的繪制。最后BI和ML樹構(gòu)建所用序列的不一致性利用consel[35]進(jìn)行最大程度無偏 (AU) 檢測。

2 結(jié)果

2.1 田中碘泡蟲 (Myxobolus tanakai Kato et al.,2017) 重慶種群形態(tài)學(xué)描述 (圖 1和表 1)

孢囊為近圓形,直徑約為0.89—92 mm。成熟孢子呈長梨形,殼面觀前尖后盾,縫面觀未見,孢子殼瓣光滑。兩個梨形極囊等大,約占據(jù)整個孢子腔體長的2/3;極絲圈數(shù)為8—10圈,垂直于極囊縱軸纏繞;兩極囊之間的突起位于孢子前端呈大三角形。在孢質(zhì)中有嗜碘泡,未見黏液泡。孢子的量度

(n=25): 孢子長(14.58±0.54) μm (13.48—15.63 μm),

孢子寬(6.09±0.37) μm (5.01—6.71 μm);極囊長(7.64±0.55) μm (6.20—8.67 μm),極囊寬(2.17±0.33) μm(1.56—3.45 μm)。未見明顯病理性特征。

宿主: 金魚 (Carassius auratus auratusLinnaeus,1758)

感染部位: 鰓絲

感染率: 6.7% (15尾魚中僅1尾被感染)

采集地: 中國重慶市江津區(qū)熱帶魚良種場(106°16′E,N29°29′N)

描述標(biāo)本: No.CQJj-Caa-201707是用甘油 :70%乙醇∶福爾馬林 (G∶A∶F= 12∶108∶5) 混合液固定的孢囊,現(xiàn)存于重慶師范大學(xué)動物生物學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室標(biāo)本收藏中心。

表 1 田中碘泡蟲與其他形態(tài)相似種的孢子測量比較Tab.1 Comparison of spore measurements of M. tanakai and the morphologically similar species

2.2 田中碘泡蟲18S rDNA分子生物學(xué)特征

本研究共獲得3條分別來自同一尾金魚鰓絲的3個不同孢囊的田中碘泡蟲18S rDNA序列,長度分別是1923、1925和1934 nt (GenBank登錄號依次為:MK552413、MH196559和MK552414)。它們之間的序列一致性為 100% 和 99.9%,分歧度為 0.0 和0.1.與日本報道的田中碘泡蟲(LC228235和LC228236)一致性為 99.3%—99.6% (表2),分歧度為0.4、0.5、0.6、0.7 (表2)。與其他形態(tài)相似種及其種群/株系的一致性和分歧度表現(xiàn)為: 與野鯉碘泡蟲(FJ841887、KJ725077、KT240127和FJ710800)的一致性均在 97% 以上 (表2),分歧度為1.8和1.9。與GenBank數(shù)據(jù)庫中形態(tài)相似且18S rDNA一致性在 90% 以上的碘泡蟲種還包括擬野鯉碘泡蟲Mxyobolus parakoi(MH196558)、奧利薩碘泡蟲Myxobolus orissae(KF448527)、茄形碘泡蟲Mxyobolus toyamai(LC010116)、長孢碘泡蟲Myxobolus longisporus(AY364637)、擬茄形碘泡蟲Myxobolusparatoyamai(LC228237)、葡萄碘泡蟲Myxobolus acinosus(KX810022)、塔形碘泡蟲Myxobolus pyramidis(LC228239)、射陽碘泡蟲Myxobolus sheyangensis(KU313684)、金布納碘泡蟲Myxobolus ginbuna(LC228238)、吳李碘泡蟲Myxobolus wulii(HQ613412)、瓶囊碘泡蟲Myxbolus ampullicapsulatus(KC425225) 和洪湖碘泡蟲Myxobolus honghuensis(KJ725074),一致性和分歧度詳見表2。

田中碘泡蟲、野鯉碘泡蟲和奧利薩碘泡蟲的18S rRNA序列V2、V4和V7可變區(qū)的二級結(jié)構(gòu)比較結(jié)果顯示: 田中碘泡蟲MH196559的V2區(qū)E10-1較其他田中碘泡蟲株系增加了一個內(nèi)徑環(huán);田中碘泡蟲LC228236的V7區(qū)E43-3與重慶種群及田中碘泡蟲LC228235相比缺少了內(nèi)徑環(huán),且該株系的V7區(qū)E43-4右端內(nèi)徑環(huán)增大。此外,野鯉碘泡蟲FJ710800的V4區(qū)E23-15、V7區(qū)E43-3和E43-4與其他野鯉碘泡蟲株系相比,也出現(xiàn)了種內(nèi)二級結(jié)構(gòu)的差異 (圖2)。綜上所述,不同種或同種之間在V2區(qū)E10-1和V4區(qū)E23-15、V7區(qū)E43-3和E43-4出現(xiàn)差異。

表 2 田中碘泡蟲與其他形態(tài)相似種18S rDNA序列一致性和分化度(%)Tab.2 Identity and divergence of 18S rDNA for M. tanakai with its morphologically similar species (%)

2.3 基于18S rDNA的系統(tǒng)學(xué)分析

以四角庫道蟲和蒜芥庫道蟲為外群分別構(gòu)建的田中碘泡蟲與相關(guān)碘泡蟲種18S rDNA的ML和BI兩棵樹的整體趨勢基本相一致 (圖3),且consel分析建樹的最大無偏差分析結(jié)果為P＜0.05,表明本研究所構(gòu)建的系統(tǒng)樹可用。系統(tǒng)樹首先分為兩枝: 一枝碘泡蟲種的孢子形態(tài)呈梨形且前端稍尖,另一枝則為球形或卵圓形且前端鈍圓。本研究蟲種位于具有梨形孢子蟲種的分枝中,3條18S rDNA序列獨(dú)立聚為一枝,然后與日本報道的2條田中碘泡蟲18S rDNA聚枝,最后與野鯉碘泡蟲 (FJ710800) 和擬野鯉碘泡蟲 (MH196558) 的聚枝形成姊妹枝;而另外的野鯉碘泡蟲 (KT240127、KJ725077和FJ841887)株系獨(dú)立聚枝,并與奧利薩碘泡蟲 (KF448527) 形成姊妹枝;而后這兩個姊妹枝再聚為一類。

圖2 田中碘泡蟲及相關(guān)種18S rDNA V2、V4、V7二級結(jié)構(gòu)差異區(qū)Fig.2 The different secondary structure section of 18S rDNA V2,V4 and V7 for M. tanakai with related species

3 討論

隨著分子生物學(xué)技術(shù)在黏孢子蟲分類學(xué)的廣泛應(yīng)用,黏孢子蟲的現(xiàn)代分類學(xué)相比其經(jīng)典分類學(xué)而言更加精準(zhǔn)。近年來已有不少學(xué)者利用黏孢子蟲18S rDNA進(jìn)行種內(nèi)相似度和種間相似度的變化趨勢研究黏孢子蟲分類[6,36,37]。2006年Fiala[31]的研究結(jié)果表明黏孢子蟲18S rDNA序列的種內(nèi)分歧度為0—2%,2008年Ferguson等[38]的研究結(jié)果則進(jìn)一步表明碘泡蟲屬種內(nèi)的變異度應(yīng)低于0.2%,2013年Zhao等[6]認(rèn)為碘泡蟲屬種內(nèi)的變異位點(diǎn)應(yīng)少于10個。

就形態(tài)、宿主、寄生部位而言,本研究獲得的3個樣本的碘泡蟲完全相同,18S rDNA的序列一致性為99.9%和100%,分歧度為0和0.1%,符合Ferguson等[38]和Zhao等[6]報道的碘泡蟲屬種內(nèi)變化范圍,故確認(rèn)為是同一物種。形態(tài)學(xué)特征比較顯示,本研究所涉蟲種與田中碘泡蟲為同種,除田中碘泡蟲中國重慶種群的極囊長、寬略小于日本報道的田中碘泡蟲原始種群外,其孢子長寬比和極囊長寬比幾乎無差別;分子數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示,雖然18S rDNA的一級結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了堿基差異,一致性為99.3%—99.6%,分歧度為0.4%—0.7%,但依然符合已報道的碘泡蟲屬18S rDNA種內(nèi)變化范圍[38]。此外,本研究的田中碘泡蟲與野鯉碘泡蟲、擬野鯉碘泡蟲、奧利薩碘泡蟲、茄形碘泡蟲、長孢碘泡蟲、擬茄形碘泡蟲、葡萄碘泡蟲、塔形碘泡蟲、射陽碘泡蟲、金布納碘泡蟲、吳李碘泡蟲、瓶囊碘泡蟲以及洪湖碘泡蟲相比,形態(tài)上很相似,但均已出現(xiàn)了或多或少的差異,例如田中碘泡蟲中國重慶種群的孢子寬明顯小于野鯉碘泡蟲的日本東京種群、中國湖北種群和美國喬治亞種群 (表1);并且18S rDNA一致性均低于99%,分歧度大于1% (表2),故屬于不同物種。采自中國重慶的田中碘泡蟲寄主為金魚(起源于中國的野生鯽馴化形成的觀賞魚類品種,且有豐富的多樣性[39]),而檢獲自日本的田中碘泡蟲寄主為鯉;表明兩者為不同宿主的地理種群。就二級結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果而言,雖然本研究所涉的黏孢子蟲和來自日本的田中碘泡蟲為同一物種,但是無論是中國重慶種群還是日本種群都已經(jīng)發(fā)生了種內(nèi)分化,且此差異尚未達(dá)到新種發(fā)生的水平。因此,隨后關(guān)于田中碘泡蟲種內(nèi)變異驅(qū)動力的研究還需使用ITS等高變異度序列進(jìn)一步分析,其他有關(guān)種內(nèi)變異的驅(qū)動力,如宿主和地理分布也需要考慮在內(nèi)。綜上所述,金魚為田中碘泡蟲的新宿主紀(jì)錄;田中碘泡蟲在中國為首次報道,并已發(fā)生了可能因宿主和地理分布同時所致的明顯的種內(nèi)分化。

此外,本研究結(jié)果還顯示GenBank中的野鯉碘泡蟲FJ710800與其他野鯉碘泡蟲種群相比,18S rDNA序列一致性僅為97.1%和96.7%,分歧度超過2.8 (表2),這已經(jīng)超出碘泡蟲屬種內(nèi)變化幅度[38];且它的18S rDNA的V2、V4、V7區(qū)和其他野鯉碘泡蟲種群相比均出現(xiàn)了明顯差異 (圖2),系統(tǒng)發(fā)生分析也顯示與其他野鯉碘泡蟲種群明顯分離 (圖3),因此,GenBank中報道的野鯉碘泡蟲 (FJ710800) 與野鯉碘泡蟲(KT240127、KJ725077和FJ841887)可能為不同種,這尚待更多數(shù)據(jù)進(jìn)一步研究予以證實(shí)。

圖3 利用PhyML/MrBayes構(gòu)建的田中碘泡蟲與相關(guān)碘泡蟲最大似然樹/貝葉斯樹 (ML/BI樹)Fig.3 ML/BI tree of M. tanakai with relative species generated by the software PhyML/MrBayes