侯紅焰 向威鵬 張金榮 程鵬飛 周成旭

(寧波大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院,浙江省海洋生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,寧波大學(xué)李達(dá)三葉耀珍伉儷李本俊海洋生物醫(yī)藥研究中心,寧波 315211)

巖藻黃素(Fucoxanthin)是類胡蘿卜素中最豐富的一種化合物,它的產(chǎn)量占類胡蘿卜素總產(chǎn)量的10%以上[1]。研究表明,巖藻黃素具有高度獨(dú)特的結(jié)構(gòu),在多烯鏈中既含有環(huán)氧鍵、羥基,又含有烯丙鍵(碳碳雙鍵)和共軛羰基(碳氧雙鍵)[2,3]。這些結(jié)構(gòu)賦予了巖藻黃素抗氧化[3,4]、抗炎[5,6]、抗癌[7,8]等多種生物活性。

在工業(yè)生產(chǎn)中,巖藻黃素主要來(lái)源于海帶(Laminaria japonica)、裙帶菜(Undaria pinnatifda)以及羊棲菜(Hizikia fusiforme)等大型藻類[9],但其中巖藻黃素含量較低。另一方面,大型海藻多在開(kāi)放的自然海區(qū)養(yǎng)殖,受海域、季節(jié)變化以及養(yǎng)殖海域的水質(zhì)等因素的影響[10],大型海藻來(lái)源的巖藻黃素質(zhì)量和產(chǎn)量相對(duì)不穩(wěn)定。這些特點(diǎn)都阻礙了大型海藻在巖藻黃素方面的生產(chǎn)應(yīng)用[10,11]。

海洋硅藻在海洋環(huán)境中分布廣泛,是現(xiàn)代海洋中生物量最為豐富的微型藻類,具有極高的生物多樣性[12]。硅藻中巖藻黃素含量約占干重的0.22%—2.17%,高于大型海藻含量的4倍以上[13—15],是巖藻黃素生產(chǎn)的重要來(lái)源[1]。而且,硅藻具有易于培養(yǎng)、生長(zhǎng)速度快、生長(zhǎng)環(huán)境可控等優(yōu)勢(shì)[16—18]。因此,硅藻在巖藻黃素的工業(yè)化清潔生產(chǎn)中有著巨大潛力[19],被認(rèn)為是潛在的替代大型海藻的巖藻黃素生產(chǎn)者[20]。

類胡蘿卜素的產(chǎn)生一般與環(huán)境條件有關(guān),例如受到光照強(qiáng)度的影響[21]。光照強(qiáng)度的增加會(huì)導(dǎo)致微藻中采光色素含量的降低[21]。臧正蓉等[22]在對(duì)三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)和球等鞭金藻(Isochrysis galbana)生產(chǎn)巖藻黃素的研究中發(fā)現(xiàn),90 μmol/(m2·s)和紅光條件可促進(jìn)三角褐指藻的生長(zhǎng)以及提高三角褐指藻的巖藻黃素含量,90 μmol/(m2·s)和綠光條件可促進(jìn)球等鞭金藻的生長(zhǎng)以及提高巖藻黃素的含量。同時(shí),不同地域來(lái)源的藻株,巖藻黃素含量存在差異。Wu等[23]對(duì)六株不同來(lái)源的三角褐指藻的研究中發(fā)現(xiàn),來(lái)自福州海岸的三角褐指藻中巖藻黃素的產(chǎn)量最高。硅藻巖藻黃素是一種重要的光合色素,位于巖藻黃素-葉綠素a蛋白復(fù)合體上,作為天線色素將激發(fā)能轉(zhuǎn)運(yùn)到葉綠素[24]。巖藻黃素可以將高達(dá)60%的能量轉(zhuǎn)移到葉綠素a中[24]。不同藻株、不同環(huán)境條件,均可導(dǎo)致色素組成含量的變化[25—27]?？梢?jiàn),硅藻的生長(zhǎng)和巖藻黃素含量在不同種類、藻株之間存在很大差異,并且培養(yǎng)條件同樣影響其巖藻黃素產(chǎn)量。因此,有必要篩選優(yōu)質(zhì)藻株以及獲取最優(yōu)培養(yǎng)條件以提高硅藻巖藻黃素的產(chǎn)量。

本研究對(duì)16株海洋硅藻的巖藻黃素產(chǎn)量和得率進(jìn)行測(cè)定分析,以評(píng)估同種不同株或不同種的藻株巖藻黃素生產(chǎn)潛能。針對(duì)其中最具高生產(chǎn)潛力的藻株,研究光照強(qiáng)度和光質(zhì)對(duì)藻細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中巖藻黃素含量的影響,以及巖藻黃素與關(guān)鍵光合色素葉綠素a和β-胡蘿卜素的消長(zhǎng)關(guān)系,為篩選巖藻黃素優(yōu)質(zhì)藻株及其優(yōu)化生產(chǎn)工藝提供參考。

1 材料與方法

1.1 藻種的來(lái)源

本實(shí)驗(yàn)所采用的藻種均為寧波大學(xué)海洋微藻藻種庫(kù)保存硅藻,具體種屬及庫(kù)存種質(zhì)編號(hào)如表1所示。

表 1 實(shí)驗(yàn)用藻種種名及庫(kù)存編號(hào)Tab.1 Algal cultures and the stock codes in Microalgae Collection Center in Ningbo University (MCCNBU)

1.2 不同藻株巖藻黃素提取率和含量分析

藻株培養(yǎng)與生物質(zhì)收集本實(shí)驗(yàn)選取的16株海洋硅藻均采用f/2培養(yǎng)基。在逐級(jí)擴(kuò)大預(yù)培養(yǎng)基礎(chǔ)上,將生長(zhǎng)至指數(shù)期的微藻接種到5000 mL三角瓶中進(jìn)行定量培養(yǎng),水體總體積4000 mL,各三組平行。在溫度為(23±1)℃、光照強(qiáng)度50 μmol/(m2·s),光照周期為L(zhǎng)∶D=12h∶12h的條件下培養(yǎng)8d,每天人工搖瓶2次。

生長(zhǎng)至平臺(tái)期的藻液,4℃、8000×g離心20min(冷凍離心機(jī),天美科學(xué)儀器有限公司,中國(guó)),去上清液,收集藻細(xì)胞于-80℃冰箱中保存。將樣品真空冷凍干燥48h,獲得干燥的藻粉(冷凍干燥機(jī),Labconco,USA)。

巖藻黃素的提取為了克服丙酮或其他有機(jī)溶劑不可在食品原料生產(chǎn)中使用及其易制毒和易殘留等缺點(diǎn),本研究利用無(wú)水乙醇作為提取溶劑。將實(shí)驗(yàn)所得硅藻藻粉每份均勻稱取0.1 g,按照10 mL/g的料液比比例向收集的藻粉中加入無(wú)水乙醇充分震蕩,使藻細(xì)胞與提取液充分接觸,在25℃水溫、超聲條件下破碎細(xì)胞5min。4℃,12000×g離心10min(離心機(jī),Eppendorf AG,Germany),獲得巖藻黃素第一次提取液,將所得提取液分裝到對(duì)應(yīng)EP管中。向離心后離心管中的沉淀再次加入1 mL無(wú)水乙醇重復(fù)以上操作,得第二次提取液。

巖藻黃素檢測(cè)用巖藻黃素標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma,USA),采用LC-MS(ACQUITY UPLC I-Class,Waters,USA;Waters XEVO-TQD,Waters,USA)方法,使用ZORBAX SB-C18色譜柱(Waters BEH Amide 1.7 μm 2.1×100 mm,Waters,USA)。液相色譜中(表2),流動(dòng)相A: 5 mmol/L乙酸銨-水溶液,流動(dòng)相B: 乙腈,等度洗脫A%=2%、B%=98%,流速: 0.30 mL/min,運(yùn)行時(shí)間: 5min,柱溫: 30℃,進(jìn)樣量: 2 μL,檢測(cè)波長(zhǎng): 450 nm。質(zhì)譜采用ESI-正離子模式,毛細(xì)管電壓: 3.50 kV,錐孔電壓: 30.00 V,二級(jí)錐孔萃取電壓: 3.00 V,源溫度: 150℃,脫溶劑氣溫度: 400℃,氣簾氣流量: 50 L/Hr,脫溶劑氣流量: 900 L/Hr。繪制巖藻黃素的標(biāo)準(zhǔn)曲線。在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi),峰面積與質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系。

1.3 光強(qiáng)和光質(zhì)對(duì)牟氏角刺藻累積巖藻黃素的影響

本研究選取一株牟氏角刺藻(Chaetoceros muelleri,編號(hào)4,庫(kù)存編號(hào): NMBguh003-11)進(jìn)行光強(qiáng)和光質(zhì)影響硅藻巖藻黃素含量變化的研究,同時(shí)分析兩種重要光合色素(葉綠素a和β-胡蘿卜素)含量的變化。

實(shí)驗(yàn)設(shè)置將預(yù)培養(yǎng)至指數(shù)期的實(shí)驗(yàn)微藻接種于f/2培養(yǎng)基中,起始密度約1.34×104cells/mL,于250 mL三角瓶中培養(yǎng),藻液總體積200 mL。白色熒光燈光源(T8),設(shè)置低50 μmol/(m2·s)、中100 μmol/(m2·s)、高200 μmol/(m2·s)三個(gè)光照強(qiáng)度。以LED光源設(shè)置單色紅、藍(lán)光質(zhì)實(shí)驗(yàn)組,光照強(qiáng)度50 μmol/(m2·s)。全部頂部給光,光照周期為L(zhǎng)∶D=12h∶12h。培養(yǎng)溫度(23±1)℃。每天人工搖瓶2次。分別在第1、第2、第4、第6、第8天取樣以血球計(jì)數(shù)板檢測(cè)藻細(xì)胞數(shù)。光強(qiáng)實(shí)驗(yàn)組在培養(yǎng)第2和第6天時(shí)、單色光質(zhì)實(shí)驗(yàn)組在培養(yǎng)第4和第8天時(shí),各實(shí)驗(yàn)組取10 mL藻樣,以玻璃纖維濾膜(GF/F)過(guò)濾,避光保藏于-80℃冰箱中,用于分析三種藻色素(巖藻黃素、葉綠素a和β-胡蘿卜素)含量。

表 2 質(zhì)譜中MRM參數(shù)Tab.2 MRM parameters in mass spectrometry

光合色素分析用巖藻黃素、葉綠素a和β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma,USA),同上文檢測(cè)巖藻黃素含量的方法,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)得色素峰面積,計(jì)算得出不同色素含量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

第一次提取和第二次提取所得巖藻黃素的提取率來(lái)評(píng)價(jià)提取方法的可行性,并以兩次提取巖藻黃素的干重含量和提取率來(lái)確定干藻粉中巖藻黃素的真實(shí)含量,根據(jù)對(duì)不同硅藻的提取率和巖藻黃素含量分析。

提取率:X(%)=(1-m2/m1)×100%;

干重含量=m1+m2;

實(shí)際含量(mg/g)=m1/X

細(xì)胞增殖速率rt=ln(Nt-N0)/t式中,X為提取率;m1為第一次提取,巖藻黃素的得率;m2為第二次提取,巖藻黃素的得率;rt為細(xì)胞增殖速率;Nt為t時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞密度;N0為起始細(xì)胞密度;t為培養(yǎng)時(shí)間間隔。

數(shù)據(jù)采用Origin 2019軟件進(jìn)行制圖,采用SPSS 13.0單因素方差分析(One way ANOVA)執(zhí)行顯著性差異分析。

2 結(jié)果

2.1 不同藻株巖藻黃素提取率和含量分析

相同條件下培養(yǎng)增殖并在相同時(shí)期收集的16株硅藻,其巖藻黃素的提取率和巖藻黃素的含量具有較大的差異(表3)。直鏈藻和雙尾藻(編號(hào)分別為13和14)的提取率最高,達(dá)89%以上。而一種角刺藻(編號(hào)為7)的提取率小于1%。對(duì)同種硅藻而言,不同株牟氏角刺藻(編號(hào)1—5)的提取率也存在差異,其提取率在20%—85%,分析檢測(cè)的巖藻黃素含量為1.3—2.3 mg/g,按提取率及實(shí)測(cè)黃素含量估算的實(shí)際含量在1.3—5 mg/g。巖藻黃素的含量在不同種類的硅藻,以及同種不同株之間都存在較大差異。在此實(shí)驗(yàn)中我們認(rèn)為提取率大于80%為有效的提取方法。綜合考慮微藻增殖速率、巖藻黃素含量以及提取率大于80%方法標(biāo)準(zhǔn),選取牟氏角刺藻(藻株編號(hào)4),作為后續(xù)研究的藻株。

表 3 不同硅藻巖藻黃素的提取率和含量比較Tab.3 Extraction rates and content of fucoxanthin in different strains of diatom

2.2 光照對(duì)牟氏角刺藻細(xì)胞增殖和色素變化的影響

光強(qiáng)對(duì)藻株生長(zhǎng)及光合色素變化的影響 牟氏角刺藻在高200 μmol/(m2·s)、中100 μmol/(m2·s)、低50 μmol/(m2·s)三種光強(qiáng)下平均增殖率為分別為0.082、0.067和0.068/d,無(wú)顯著性差異(P＜0.05),培養(yǎng)一周(第6天)后進(jìn)入平臺(tái)期,其最大生物量平均

3.4×104cells/mL(圖1A)。

分別取培養(yǎng)初期(2d)和平臺(tái)期(6d)的藻樣,測(cè)定巖藻黃素、葉綠素a及β-胡蘿卜素三種色素的單細(xì)胞含量。如圖1B所示,比較培養(yǎng)初期和平臺(tái)期色素變化: 在低光照下,葉綠素a、巖藻黃素和β-胡蘿卜素的含量在培養(yǎng)初期和平臺(tái)期均沒(méi)有顯著差異(P＜0.05)。在高、中光強(qiáng)下,葉綠素a的含量在培養(yǎng)初期高于平臺(tái)期;β-胡蘿卜素含量在平臺(tái)期高于培養(yǎng)初期;巖藻黃素含量則沒(méi)有顯著差異。比較不同光強(qiáng)下的各色素變化,在低光強(qiáng)下,巖藻黃素的含量為1.2×10-2ng/cell均高于較高光強(qiáng);中、高光照條件下沒(méi)有顯著差異,平均含量為8.0×10-3和7.1×10-3ng/cell。β-胡蘿卜素的含量隨著光照強(qiáng)度的升高而增加,高光照強(qiáng)度下平臺(tái)期單位細(xì)胞含量為4.0×10-4ng/cell,較起始增加111.2%。葉綠素a單細(xì)胞含量,在培養(yǎng)初期隨著光強(qiáng)增加而增加,培養(yǎng)平臺(tái)期不同光強(qiáng)下無(wú)顯著差異。

從巖藻黃素和β-胡蘿卜素分別相對(duì)于葉綠素a的比值變化來(lái)看(圖1C),兩個(gè)比值在平臺(tái)期均較培養(yǎng)初期顯著增加,但隨光強(qiáng)增強(qiáng),該比值增加的幅度不同: 巖藻黃素與葉綠素a的比值隨光強(qiáng)增加其增幅降低,從786.7%降至184.7%。β-胡蘿卜素與葉綠素a的比值隨光強(qiáng)增加其增幅增加,從3.6%增加到10.4%。平臺(tái)期時(shí),在低光照條件下巖藻黃素相對(duì)于葉綠素a的比值最高(786.7%),β-胡蘿卜素相對(duì)于葉綠素a的比值最低(3.6%)。

光質(zhì)對(duì)藻株生長(zhǎng)及光合色素變化的影響如圖2所示,在藍(lán)光下的生長(zhǎng)相對(duì)穩(wěn)定,4d增殖速率為0.049/d,平臺(tái)期維持時(shí)間長(zhǎng)(圖2A);而在紅光條件下,培養(yǎng)初期增殖相對(duì)較快,4d增殖速率為0.095/d,但平臺(tái)期維持時(shí)間相對(duì)短。在相同光強(qiáng)下,紅光最大生物量出現(xiàn)在第4天,為3.3×104cells/mL,藍(lán)光最大生物量在第8天,為3.0×104cells/mL。

分析紅、藍(lán)單色光質(zhì)條件下進(jìn)入平臺(tái)期后的單位細(xì)胞色素含量變化結(jié)果顯示(圖2B),三種色素的含量在生長(zhǎng)平臺(tái)期維持過(guò)程中,均出現(xiàn)上升的特征。在紅光條件下,巖藻黃素、葉綠素a和β-胡蘿卜素分別上升89.0%、542.8%和1686.3%;在藍(lán)光條件下,分別上升195.1%、651.5%和368.6%。巖藻黃素與葉綠素a在紅光條件下上升幅度高于藍(lán)光組,產(chǎn)量也高于藍(lán)光組。β-胡蘿卜素在藍(lán)光條件下上升幅度高于紅光組,產(chǎn)量也高于紅光組。紅光組和藍(lán)光組比較,平臺(tái)初期,紅光組的巖藻黃素較藍(lán)光組高,平臺(tái)后期兩組沒(méi)有顯著差異;藍(lán)光組的β-胡蘿卜素含量均高于紅光組。

從巖藻黃素和β-胡蘿卜素分別相對(duì)于葉綠素a的比值來(lái)看(圖2C),前者的比值在平臺(tái)維持期顯著降低,β-胡蘿卜素與葉綠素a的比值變化沒(méi)有顯著性差異(P＜0.05)。

圖1 不同光照強(qiáng)度對(duì)牟氏角刺藻的影響Fig.1 Ef fects of different illumination intensitice on Chaetoceros muelleri

3 討論

巖藻黃素是硅藻中最豐富的類胡蘿卜素之一,具有豐富的生物活性。優(yōu)化巖藻黃素提取工藝是實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)的關(guān)鍵過(guò)程之一。在工業(yè)化生產(chǎn)中,以食用級(jí)乙醇作為提取試劑,能滿足食品安全或化妝品生產(chǎn)中對(duì)清潔生產(chǎn)的要求。在本研究中,用乙醇提取不同株硅藻的巖藻黃素,檢測(cè)結(jié)果表示不同株硅藻中巖藻黃素含量差異較大,從無(wú)法計(jì)算(一種角毛藻Chaetocerossp.)到高達(dá)5.0 mg/g(兩種角毛藻:C. debilis和C. muelleri)。實(shí)驗(yàn)組中最高含量與Foo等[28]使用甲醇提取角毛藻(C. calcitrans)中的巖藻黃素含量相近[(5.3±0.03) mg/g]。在Kim等[29]的研究中,乙醇提取三角褐指藻(P. tricornutum)的巖藻黃素的提取產(chǎn)率最高,為15.7 mg/g。但Foo等[30]的研究表明,與其他微藻(如角毛藻C. calcitrans和球等鞭金藻I. galbana)相比,三角褐指藻中提取的巖藻黃素僅為0.07 mg/g,且檢測(cè)其總提取物的抗氧化活性最小?？梢?jiàn),在不同的研究中,微藻巖藻黃素含量、提取率及生物活性都可能存在顯著差異。因此,典型藻株巖藻黃素累積的生物學(xué)機(jī)制研究是生產(chǎn)工藝優(yōu)化的基礎(chǔ)。

圖2 不同光質(zhì)對(duì)牟氏角刺藻的影響Fig.2 Effects of different light on Chaetoceros muelleri

影響微藻生理生化的一個(gè)關(guān)鍵因子——光強(qiáng)作為重要的光合色素之一,巖藻黃素與藻類生長(zhǎng)、培養(yǎng)條件及光合系統(tǒng)調(diào)節(jié)過(guò)程都密切相關(guān),光強(qiáng)是關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子之一。本研究顯示,在相對(duì)低光強(qiáng)條件下[50 μmol/(m2·s)],牟氏角刺藻巖藻黃素累積最高。Song等[9]發(fā)現(xiàn),在長(zhǎng)耳齒狀藻(Odontella aurita)中與較高光強(qiáng)[300 μmol/(m2·s)]相比,在較低的光強(qiáng)[100 μmol/(m2·s)]下具有較高的巖藻黃素產(chǎn)生。Li等[31]的研究表明,高光強(qiáng)抑制了湛江等鞭金藻(Isochrysis zhangjiangensis)中巖藻黃素的積累,而低光強(qiáng)促進(jìn)了其中巖藻黃素的產(chǎn)生。Guo等[32]在三個(gè)光照條件下研究小環(huán)藻(Cyclotella cryptica),結(jié)果也發(fā)現(xiàn),相對(duì)低光強(qiáng)下巖藻黃素含量最高。巖藻黃素含量受光強(qiáng)影響含量相對(duì)變化的特點(diǎn),與藻色素受光調(diào)節(jié)合成代謝相關(guān)。紫黃素是合成巖藻黃素的重要前提物質(zhì)[33,34],在強(qiáng)光照射下,為了提供有效的光保護(hù),硅藻會(huì)把紫黃素轉(zhuǎn)化為玉米黃素,通過(guò)非光化學(xué)過(guò)程(葉黃素循環(huán))耗散多余的光能[35,36],這也就降低了巖藻黃素的產(chǎn)生。而在低光照下,碳骨架會(huì)轉(zhuǎn)換成3-磷酸甘油醛并轉(zhuǎn)入類胡蘿卜素,尤其是巖藻黃素中。因此,藻株培養(yǎng)過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)鹽充足且光照條件較弱的情況下巖藻黃素的富集量較高[37]。本研究結(jié)果顯示,在三種光強(qiáng)下,培養(yǎng)初期和平臺(tái)期的巖藻黃素含量并沒(méi)有顯著差異。顯然,兩個(gè)生長(zhǎng)期的營(yíng)養(yǎng)鹽水平是有差異的。因此,除藻株因素之外,光強(qiáng)是影響巖藻黃素含量變化的關(guān)鍵因子。

不同藻種或不同藻株的巖藻黃素含量受光強(qiáng)影響下的相對(duì)變化,還與各研究所設(shè)置的光照強(qiáng)度區(qū)段相關(guān)。在本研究中,最低光強(qiáng)[50 μmol/(m2·s)]下巖藻黃素的含量最高,但在100和200 μmol/(m2·s)的光強(qiáng)下,單位藻細(xì)胞的巖藻黃素含量沒(méi)有顯著差異。而Mcclure等[21]的研究顯示,在此高光強(qiáng)區(qū)間,三角褐指藻的巖藻黃素含量仍然是比相對(duì)較低的光照條件下含量高。Guo等[32]以黑暗條件下培養(yǎng)為對(duì)照組發(fā)現(xiàn),小環(huán)藻在10—30 μmol/(m2·s)的光照強(qiáng)度促進(jìn)巖藻黃素積累,而40 μmol/(m2·s)對(duì)于巖藻黃素的積累沒(méi)有有益效果。當(dāng)光照強(qiáng)度低于50 μmol/(m2·s)[例如10—40 μmol/(m2·s)]或者高于50 μmol/(m2·s)時(shí),硅藻中巖藻黃素含量隨光照強(qiáng)度的增加而降低。

在本研究中,巖藻黃素、葉綠素a以及β-胡蘿卜素在不同光強(qiáng)條件下的消長(zhǎng),反映了微藻在光能適應(yīng)中的調(diào)節(jié)特征。葉綠素a與β-胡蘿卜素在本實(shí)驗(yàn)的最高光照強(qiáng)度50 μmol/(m2·s)下含量最高。β-胡蘿卜素通常被認(rèn)為是巖藻黃素生物合成的前體物質(zhì),但兩者尚未發(fā)現(xiàn)直接的定量相關(guān)關(guān)系。巖藻黃素和葉綠素a一起構(gòu)成了硅藻重要的光合作用捕光色素,在光系統(tǒng)光收集復(fù)合物中進(jìn)行光收集和能量傳遞[37]。微藻通過(guò)調(diào)節(jié)各色素的含量實(shí)現(xiàn)對(duì)光合作用有效光能的充分利用和抗逆保護(hù)。例如,硅甲藻黃素(Diadinoxanthin)和硅藻黃質(zhì)(Diatoxanthin)的二氨基黃素循環(huán)是微藻的短期光保護(hù)機(jī)制[38]。兩種葉黃素的含量變化隨光強(qiáng)的增加而增加[32]。Erdo?an等[39]的研究發(fā)現(xiàn),在氧化應(yīng)激的作用下新月菱形藻(Cylindrotheca closterium)中的巖藻黃素含量增加了50%以上。因此,以培養(yǎng)海洋硅藻進(jìn)行巖藻黃素的規(guī)模化生產(chǎn),尚需對(duì)多因子綜合影響的色素調(diào)節(jié)過(guò)程進(jìn)行系統(tǒng)研究,以獲得最優(yōu)培養(yǎng)工藝。

影響微藻生理生化的一個(gè)關(guān)鍵因子——光質(zhì) 光質(zhì)是環(huán)境光照影響微藻生理生化過(guò)程的另一個(gè)關(guān)鍵因子。在本研究中,牟氏角刺藻巖藻黃素的含量在紅光條件下遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于藍(lán)光。臧正蓉等[40]研究也顯示,通過(guò)紅光光照能夠使三角褐指藻細(xì)胞中的巖藻黃素產(chǎn)量提高。在紅光下,葉綠素a的含量也較藍(lán)光下高。巖藻黃素以吸收光合作用有效光譜中的藍(lán)光為主,在單色紅光條件下,巖藻黃素與葉綠素a含量增加,可能是微藻對(duì)能量較低的紅光波長(zhǎng)需增大吸收強(qiáng)度。與本研究中光強(qiáng)影響不同,在單色紅光或藍(lán)光下,平臺(tái)前期和平臺(tái)后期營(yíng)養(yǎng)鹽差異可能導(dǎo)致藻細(xì)胞色素的累積差異。平臺(tái)后期較平臺(tái)前期,巖藻黃素和葉綠素a的含量均顯著增加。研究結(jié)果不僅說(shuō)明單色紅光利于巖藻黃素的累積,而且在該條件下,營(yíng)養(yǎng)鹽脅迫可能提高巖藻黃素的累積。在藻細(xì)胞的培養(yǎng)過(guò)程中,單色藍(lán)光條件下β-胡蘿卜素富集[41,42],與β-胡蘿卜素具有光保護(hù)作用相關(guān)。

規(guī)?；a(chǎn)微藻中重要色素時(shí)(如β-胡蘿卜素和蝦青素的工業(yè)生產(chǎn)),常常面臨的一個(gè)問(wèn)題是最適細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)條件與最適色素累積的培養(yǎng)條件的矛盾。因此,工業(yè)上常采用兩步法生產(chǎn)工藝。在第一階段,微藻在最佳條件下生長(zhǎng),以使生物量最大化;而在第二階段,使微藻生長(zhǎng)受到脅迫以利于目標(biāo)色素的累積。目前,以微藻為培養(yǎng)目標(biāo)生產(chǎn)巖藻黃素尚未實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。本研究顯示,規(guī)?；囵B(yǎng)至高密度時(shí),藻細(xì)胞間的遮光會(huì)利于巖藻黃素的累積,此為工業(yè)化生產(chǎn)微藻巖藻黃素的一大優(yōu)勢(shì)。針對(duì)典型藻株進(jìn)行培養(yǎng)時(shí),以最適生長(zhǎng)的光強(qiáng)進(jìn)行增殖培養(yǎng),以平臺(tái)期低光照或紅光脅迫,還可能進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)工藝優(yōu)化。本研究關(guān)于三種關(guān)鍵光合色素的消長(zhǎng)特征還顯示,可能葉綠素含量低的藻株更能積累巖藻黃素,并且葉綠素含量低的藻株很可能更容易高密度培養(yǎng)。此結(jié)果提示了微藻巖藻黃素優(yōu)勢(shì)藻株的篩選和種質(zhì)創(chuàng)制的研究目標(biāo)。

4 結(jié)論

本研究對(duì)16株海洋硅藻巖藻黃素含量進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)不同種或同種不同株的硅藻,即使在完全相同的條件下,其提取效率具有差異,從而導(dǎo)致對(duì)含量評(píng)價(jià)的差異。對(duì)一株提取率大于80%的牟氏角刺藻進(jìn)行了光強(qiáng)和光質(zhì)條件對(duì)重要光合色素影響的分析,證明了低光照和紅光條件是硅藻累積生產(chǎn)巖藻黃素的關(guān)鍵因子。本文為后續(xù)篩選素優(yōu)質(zhì)藻株、巖藻黃素的提取和分析以及累積生產(chǎn)工藝優(yōu)化提供了參考。