王鑫毅 趙 婧 金 珊 趙青松 周素明 竺俊全

(1.寧波大學(xué)海洋學(xué)院,寧波 315832;2.寧波大學(xué)高等技術(shù)研究院,寧波 315211)

近年來(lái),隨著縊蟶(Sinonovacula constricta)養(yǎng)殖的不斷發(fā)展,高密度集約化的養(yǎng)殖方式使得縊蟶養(yǎng)殖過(guò)程中經(jīng)常出現(xiàn)縊蟶生長(zhǎng)速度慢,活力低下甚至頻發(fā)不明原因死亡的現(xiàn)象,而養(yǎng)殖水體環(huán)境的惡化是造成以上情況的主要原因[1],其中氨氮污染是水產(chǎn)養(yǎng)殖中的最直接、最重要的脅迫因子[2]。養(yǎng)殖環(huán)境中過(guò)高的氨氮會(huì)造成水生動(dòng)物的毒害作用,導(dǎo)致免疫力下降,增加感染疾病的風(fēng)險(xiǎn)[2,3]。據(jù)報(bào)道,養(yǎng)殖環(huán)境中的氮素主要來(lái)源于飼料及養(yǎng)殖生物的排泄物,Hargreaves等[4]的研究表明,大約只有30%左右的飼料氮素被養(yǎng)殖生物利用,而70%左右的飼料氮素被排放到養(yǎng)殖環(huán)境中;Jackson等[5]對(duì)蝦類養(yǎng)殖過(guò)程進(jìn)行了監(jiān)測(cè),結(jié)果顯示投入的飼料氮只有22%轉(zhuǎn)化為蝦生物量,而14%沉積在底泥,54%被排放到水環(huán)境中;高攀等[6]對(duì)草魚的養(yǎng)殖研究也認(rèn)為只有占總氮35.4%—37.9%的氮素是以魚體的形式產(chǎn)出。因此,如何解決氮素污染是目前水產(chǎn)養(yǎng)殖綠色發(fā)展面臨的關(guān)鍵問(wèn)題。

自然界對(duì)氮素污染物的自凈能力主要取決于氮素轉(zhuǎn)化微生物的作用,而硝化作用是自然界氮素循環(huán)的核心環(huán)節(jié),也是氨氮脫除過(guò)程中至為重要的一步,其包括氨氧化作用以及亞硝化作用[7]。氨氧化作用是硝化作用的第一步,也被認(rèn)為是硝化作用的限速步驟,主要由氨氧化細(xì)菌(Ammonia-oxidizing bacterial,AOB)和氨氧化古菌(Ammonia-oxidizing archaea,AOA)進(jìn)行驅(qū)動(dòng)[8]。已有的研究表明,AOA和AOB的氨氧化作用主要是由其體內(nèi)的氨單加氧酶(Ammonia monooxygenase,AMO)催化的,而amoA基因編碼了AMO其中一個(gè)亞基[9],由于amoA基因具有較強(qiáng)的保守性,且已被證實(shí)在AOA和AOB中均含有amoA基因[10,11],因此,現(xiàn)今amoA基因已成為AOA和AOB的主要分子標(biāo)記之一[7]。目前,對(duì)于AOA和AOB的研究主要集中于湖泊沉積物[12—14]、土壤[15,16]等環(huán)境中,而關(guān)于水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境的相關(guān)報(bào)道較少,主要有南美白對(duì)蝦(Penaeus vanname)[17]、草魚(Ctenopharyngodon idellus)[18]及太湖中魚蝦蟹混養(yǎng)區(qū)[19]等水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖環(huán)境中AOA和AOB的相關(guān)分析,且已有的研究基本也是針對(duì)淡水養(yǎng)殖環(huán)境的。因此,為了進(jìn)一步明確海水養(yǎng)殖環(huán)境中氨氧化微生物的動(dòng)態(tài)變化及與養(yǎng)殖動(dòng)物的相關(guān)性,本研究利用熒光定量PCR技術(shù)對(duì)縊蟶養(yǎng)殖池塘水體和沉積物中AOA和AOB的amoA基因進(jìn)行了定量分析,探討縊蟶養(yǎng)殖過(guò)程中氨氧化微生物的季節(jié)動(dòng)態(tài)變化及環(huán)境因子相關(guān)性,以期為養(yǎng)殖過(guò)程中氮素循環(huán)的有效管理及水質(zhì)調(diào)控技術(shù)的研發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

試驗(yàn)用水樣、泥樣及縊蟶均來(lái)自寧波市寧海縣長(zhǎng)街鎮(zhèn)合成村(29.21N,121.7E)養(yǎng)殖狀況良好的縊蟶養(yǎng)殖塘(153 m×62 m),塘深約1 m,養(yǎng)殖塘于2018年4月4日放養(yǎng)來(lái)自三門縣的甬樂(lè)一號(hào)苗200 kg,8000粒/kg。試驗(yàn)于2018年4月(春季)、7月(夏季)、10月(秋季)、2019年1月(冬季)利用5點(diǎn)采樣法采集樣品,每個(gè)點(diǎn)使用2.5 L有機(jī)玻璃采水器采取養(yǎng)殖水體中上層距離水面約40 cm處水樣[20],再將5個(gè)點(diǎn)的水樣均勻混合作為每個(gè)月的試驗(yàn)用水樣;泥樣也分為相同的5個(gè)點(diǎn),將每個(gè)點(diǎn)取得的泥樣均勻混合后作為每個(gè)月試驗(yàn)用泥樣,每種樣本按相同的方法采三次作為試驗(yàn)平行,將所采樣品于4℃保存,所有樣品的DNA提取在24h內(nèi)完成。

1.2 養(yǎng)殖池塘水質(zhì)指標(biāo)測(cè)定

溫度、溶解氧、pH采用YSI 556水質(zhì)檢測(cè)儀測(cè)定,透明度利用透明度盤測(cè)定,鹽度利用鹽度計(jì)測(cè)定,其余水質(zhì)因子依據(jù)海洋監(jiān)測(cè)規(guī)范(GB17378.4—2007)進(jìn)行測(cè)定,過(guò)硫酸鉀氧化法測(cè)定總氮(TN)和總磷(TP),次溴酸鈉氧化法測(cè)定氨氮(NH),鋅鎘還原法測(cè)定硝態(tài)氮(NO),鹽酸萘乙二胺測(cè)定亞硝酸鹽氮(NO),磷鉬藍(lán)法測(cè)定活性磷(PO),高錳酸鉀氧化法測(cè)定化學(xué)需氧量(COD)。

1.3 樣品DNA提取

水樣每組平行100 mL水用0.22 μm的無(wú)菌纖維素濾膜過(guò)濾,過(guò)濾后的濾膜剪碎,用于DNA提取;沉積物樣每個(gè)平行取500 mg。各樣品都利用Fast DNA Spin Kit for Soil試劑盒(MPbio,USA)按照試劑盒說(shuō)明書提取總DNA,經(jīng)Nano Drop 2000蛋白質(zhì)核酸分析儀(ThermoFisher,USA)測(cè)定提取出的DNA濃度和純度后,將DNA樣品于-20℃中保存,用于后續(xù)分析。

1.4 絕對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

將提取的水樣及沉積物樣的DNA作為PCR擴(kuò)增模板,AOBamoA基因擴(kuò)增引物為bamoA1F(5′-GGGGTTTCTACTGGTGGT-3′)和bamoA2R(5′-CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC-3′)[21],AOAamoA基因擴(kuò)增引物為amoAF(5′-STAATGGTCTG GCTTAGACG-3′)和R(5′-GCGGCCATCCATCT GTATGT-3′)[21],擴(kuò)增體系為2×TaqMasterMix(康為世紀(jì))25 μL,正反向引物濃度為10 μmol/L各2 μL,DNA模板2 μL,加ddH2O補(bǔ)足至50 μL。PCR擴(kuò)增程序如下: AOB: 94℃,2min;(94℃,30s;55℃,30s;72℃,30s)×35;72℃,2min;AOA: 94℃,2min;(94℃,30s;53℃,30s;72℃,30s)×35;72℃,2min。使用Gel Extraction Kit (OMEGA) 切膠回收試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收,回收產(chǎn)物與pMD18-T載體連接后轉(zhuǎn)入DH5α 感受態(tài)細(xì)胞中,進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。選取白色克隆后利用菌落PCR進(jìn)行陽(yáng)性克隆鑒定,載體引物為M13F和M13R,將挑取出的白色克隆進(jìn)行測(cè)序,與NCBI比對(duì),AOB與亞硝化單胞菌(KU365739.1)amoA基因同源性99%,AOA與泉古菌(JQ345856.1)amoA基因同源性99%,因此可作為絕對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)品。利用Plasmid Mini Kit (OMEGA)提取重組質(zhì)粒,經(jīng)Nano Drop 2000蛋白質(zhì)核酸分析儀測(cè)定DNA濃度,AOB重組質(zhì)粒DNA濃度為80.09 ng/μL,AOA重組質(zhì)粒DNA濃度為452.02 ng/μL。根據(jù)阿伏伽德羅常數(shù)計(jì)算amoA基因拷貝數(shù),AOB為2.30×1010copies/μL,AOA為1.24×1011copies/μL,將AOA及AOB重組質(zhì)粒DNA以10倍濃度稀釋6個(gè)梯度,用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。

1.5 amoA基因熒光定量PCR

采用Roche LighterCycler?480 Ⅱ熒光定量PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行定量,擴(kuò)增體系為: 2×Trans Start Tip Green qPCRSuper Mix(全式金) 10 μL,濃度為10 μmol/L的AOA、AOB正反向引物各0.4 μL,DNA模板1 μL,用dd H2O補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)程序如下: AOB:94℃,30s;(94℃,5s;55℃,15s;72℃,10s)×40;AOA: 94℃,30s;(94℃,5s;53℃,15s;72℃,10s)×40。每個(gè)樣品設(shè)置三個(gè)平行。

1.6 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,利用單因素方差分析(One way ANOVA)比較水質(zhì)因子、AOB和AOA豐度的季節(jié)變化的顯著性,利用Pearson相關(guān)系數(shù)法分析豐度與水環(huán)境因子的相關(guān)性,利用多元線性回歸方程做環(huán)境因子與氨氧化微生物豐度的回歸分析。

2 結(jié)果

2.1 不同季節(jié)縊蟶養(yǎng)殖池塘水質(zhì)指標(biāo)

如表1所示,季節(jié)變化對(duì)于池塘水質(zhì)理化因子有一定的影響,四季的水溫、硝氮、亞硝氮及透明度均呈顯著差異(P＜0.05);冬季溶氧和總氮含量顯著高于其他季(P＜0.05),而春夏季無(wú)顯著差異(P＞0.05);春季總磷最低,且顯著低于夏秋季(P＜0.05),與冬季無(wú)顯著差異(P＞0.05);活性磷在春季顯著高于其余三季(P＜0.05),夏秋季無(wú)顯著差異(P＞0.05);氨氮濃度在秋季最高,顯著高于冬夏兩季(P＜0.05);夏季化學(xué)需氧量顯著高于其余三季(P＜0.05)。

2.2 不同季節(jié)AOB和AOA的 amoA基因豐度變化

如圖1所示,在水體中,四個(gè)季節(jié)AOB的amoA基因拷貝數(shù)變化范圍在(1.82—5.13)×104copies/mL,其中秋季最高且顯著高于其余三季(P＜0.05),其余三季之間無(wú)明顯差異(P＞0.05);AOA的amoA基因拷貝數(shù)變化范圍為(5.65—6.73)×105copies/mL,冬季為最低值且與春秋兩季有顯著差異(P＜0.05)。在沉積物中,四個(gè)季節(jié)的AOB的amoA基因拷貝數(shù)變化范圍在(1.45—8.35)×107copies/g,最高值在冬季且顯著高于其余三季(P＜0.05),春夏秋季含量無(wú)明顯差異(P＞0.05);AOA的amoA基因拷貝數(shù)變化范圍在(2.546.04)×108copies/g,最高值在冬季且顯著高于其余三季(P＜0.05),春夏秋季含量無(wú)明顯差異(P＞0.05)。

表 1 不同季節(jié)縊蟶養(yǎng)殖池塘水質(zhì)指標(biāo)Tab.1 Water quality index of Sinonovacula sinensis pond in different seasons

從圖2中可以看出在縊蟶養(yǎng)殖池塘水體及沉積物中的AOA的數(shù)量均比AOB的數(shù)量高一個(gè)數(shù)量級(jí),在夏季水體中比值達(dá)到最高,且與秋冬季呈顯著差異(P＜0.05),而在沉積物中秋季比值達(dá)到最高,與冬季呈顯著差異(P＜0.05)。

2.3 水體及沉積物中AOB和AOA豐度與水環(huán)境因子的相關(guān)性

如表2所示,在水中,AOB豐度與酸堿度(r=?0.722,P=0.008)、氨氮(r=0.698,P=0.012)呈顯著正相關(guān),與亞硝氮(r= -0.589,P=0.044)、透明度(r=0.728,P=0.007)呈顯著負(fù)相關(guān),與水溫、溶解氧、總磷、活性磷、總氮、硝氮和化學(xué)需氧量相關(guān)性不顯著(P＞0.05);AOA豐度與水溫(r=0.631,P=0.028)呈正顯著相關(guān),與硝氮(r=-0.720,P=0.008)呈負(fù)顯著相關(guān),與溶解氧、酸堿度、總磷、活性磷、總氮、氨氮、亞硝氮、化學(xué)需氧量及透明度呈不顯著相關(guān)(P＞0.05)。在沉積物中,AOB豐度與溶解氧(r=0.742,P=0.006)、硝氮(r=0.938,P=0.000)、總氮(r=0.655,P=0.021)及亞硝氮(r=0.577,P=0.050)呈顯著正相關(guān),與水溫(r=-0.885,P=0.000)呈顯著負(fù)相關(guān),與酸堿度、總磷、活性磷、氨氮、化學(xué)需氧量及透明度呈不顯著相關(guān)(P＞0.0 5);A O A 豐度與溶解氧(r=0.7 2 9,P=0.007)、總氮(r=0.676,P=0.016)、硝氮(r=0.895,P=0.000)呈顯著性正相關(guān),與水溫(r= -0.863,P=0.000)、活性磷(r= -0.587,P=0.045)呈負(fù)顯著相關(guān),與酸堿度、總磷、氨氮、亞硝氮、化學(xué)需氧量及透明度呈不顯著相關(guān)(P＞0.05)。

通過(guò)將水體中AOA和AOB、沉積物中AOA和AOB的豐度作為因變量,水環(huán)境因子作為自變量進(jìn)行多元逐步回歸分析。由表3可知,硝氮、透明度、化學(xué)需氧量和總磷有入選回歸方程,其中水體中AOA豐度的回歸方程水質(zhì)因子中有硝氮入選;水體中AOB豐度的回歸方程中有透明度和化學(xué)需氧量?jī)蓚€(gè)水質(zhì)因子入選;沉積物中AOA豐度的回歸方程有硝氮及總磷兩個(gè)水質(zhì)因子入選;沉積物中AOB豐度的回歸方程只有硝氮入選。其中硝氮入選了3個(gè)方程,說(shuō)明硝氮與縊蟶養(yǎng)殖池塘中氨氧化微生物豐度密切相關(guān)。

3 討論

3.1 縊蟶養(yǎng)殖池塘AOA和AOB的豐度

已有的研究表明,氨氧化微生物廣泛分布于淡水和海水水域及自然界的土壤系統(tǒng)中,由于這兩類細(xì)菌的生理生化等特性的差別,從而使得它們?cè)诓煌沫h(huán)境中存在著不同的生態(tài)位分化[22]。本文利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)不同季節(jié)縊蟶養(yǎng)殖池塘水體及沉積物中的AOA和AOB的豐度進(jìn)行了研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在不同季節(jié)縊蟶養(yǎng)殖池塘環(huán)境中AOA豐度均比AOB豐度高一個(gè)數(shù)量級(jí),在數(shù)量上占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì),這與高利海等對(duì)南美白對(duì)蝦養(yǎng)殖塘底泥[23]和Wuchter等[24]和Mincer等[25]對(duì)海洋環(huán)境的研究結(jié)果一致,而與Wu等[26]對(duì)太湖湖灣養(yǎng)魚區(qū)及Lu等[27]對(duì)湖北崇湖漁場(chǎng)的研究結(jié)果不同。作者認(rèn)為這可能是AOA和AOB對(duì)海淡水環(huán)境的適應(yīng)性不同所導(dǎo)致,由于AOA擁有比AOB更寬的生態(tài)位[28],使得AOA更能適應(yīng)貧營(yíng)養(yǎng)、厭氧、高鹽度等復(fù)雜的生態(tài)環(huán)境,因此,在縊蟶養(yǎng)殖池塘環(huán)境的氨氧化作用中AOA起著主導(dǎo)地位,而鹽度也是影響?zhàn)B殖池塘氨氧化微生物菌群結(jié)構(gòu)的一個(gè)重要的因素,隨著養(yǎng)殖環(huán)境鹽度的上升,AOA的相對(duì)豐度會(huì)升高[29]。

圖1 水體和沉積物中AOB和AOA豐度的季節(jié)變化Fig.1 Seasonal abundance of the AOB and AOA in water and sediments

圖2 不同季節(jié)水體和沉積物中AOA與AOB的豐度比值變化Fig.2 Abundance ratio of AOA and AOB in water and sediments in different seasons

3.2 縊蟶養(yǎng)殖池塘AOA和AOB的季節(jié)動(dòng)態(tài)變化與水環(huán)境因子的相關(guān)性

本研究結(jié)果表明,縊蟶養(yǎng)殖池塘水體及沉積物中的AOA和AOB豐度呈現(xiàn)一定的季節(jié)性波動(dòng),水中的AOB及AOA豐度均在秋季最高,且AOB顯著高于其余三季(P＜0.05),沉積物中的AOB及AOA均在冬季顯著高于其余三季(P＜0.05),而其余季節(jié)間無(wú)明顯差異。環(huán)境因子相關(guān)性分析顯示,水溫是影響縊蟶養(yǎng)殖池塘氨氧化微生物豐度的重要因素之一,水體中AOB與水溫呈負(fù)相關(guān)但不顯著(P＞0.05),AOA與水溫呈正顯著相關(guān)(P＜0.05),而沉積物中AOA和AOB與水溫呈顯著負(fù)相關(guān)(P＜0.05),這與潘彥宇等[12]、覃雅等[18]的研究結(jié)果相似。作者認(rèn)為由于目前已知的AOB大多是屬于中溫類菌群,適合在40℃以下生長(zhǎng),最適生長(zhǎng)溫度為20—30℃,而AOA對(duì)溫度的響應(yīng)范圍要比AOB更廣,其對(duì)高溫環(huán)境和低溫環(huán)境的適應(yīng)性高于AOB[30,31]。

此外,隨著養(yǎng)殖進(jìn)程的推進(jìn),由于投餌、施肥及縊蟶等生物的糞便產(chǎn)生,使得養(yǎng)殖底泥中含氮物質(zhì)不斷積累,而AOB和AOA是自然界氨氮物質(zhì)硝化作用的推動(dòng)者,因此沉積物中總氮、硝氮及亞硝氮均在冬季達(dá)到最高且顯著高于其余三季(P＜0.05),而本研究的結(jié)果表明,氨氮、亞硝氮及硝氮的濃度也在一定程度上影響著縊蟶養(yǎng)殖池塘氨氧化微生物的豐度。已有的研究表明,在一定范圍內(nèi)氨氮含量的增加會(huì)促進(jìn)氨氧化反應(yīng)和氨氧化微生物的生長(zhǎng),但高水平的氨會(huì)抑制AOA的生長(zhǎng)[32,33],Yasuda等[34]的研究發(fā)現(xiàn)AOA豐度與某些特異性游離氨濃度成正比,Limpiyakorn等[35]的實(shí)驗(yàn)顯示AOA的氨氮半飽和濃度范圍在0.001—0.01 mg/L,而AOB的半飽和濃度則比AOA高1—4個(gè)數(shù)量級(jí)。而本研究檢測(cè)四季水體中氨氮濃度均小于1 mg/L,因此這可能也是縊蟶養(yǎng)殖池塘中AOA占主導(dǎo)地位的原因之一。

縊蟶養(yǎng)殖過(guò)程中養(yǎng)殖池塘與外界水體交換相對(duì)較少,當(dāng)養(yǎng)殖密度過(guò)高或投餌量過(guò)大的時(shí)候,水體溶解氧會(huì)被大量消耗。而氨氧化過(guò)程是以氧氣作為反應(yīng)基質(zhì),因此氧氣的濃度從某種意義上決定了AOA和AOB種類的分布[36]。在本研究中,沉積物中的AOA和AOB豐度均與溶解氧成顯著正相關(guān)(P＜0.05),且AOA在低氧濃度下更具生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì),這與印度池塘養(yǎng)殖沉積物[37]、美國(guó)湖泊沉積物[38]、黃東海泥質(zhì)區(qū)[39]中的研究結(jié)果相類似,當(dāng)溶解氧降低的時(shí)候養(yǎng)殖環(huán)境中的氨氧化過(guò)程會(huì)受到影響。另外,多元回歸方程和相關(guān)性結(jié)果也顯示,總磷、化學(xué)需氧量等其他環(huán)境因子對(duì)AOA和AOB的豐度也有一定的影響。

綜上所述,縊蟶養(yǎng)殖池塘中AOA及AOB的生長(zhǎng)受到鹽度、溫度、氨氮濃度及溶解氧等多種環(huán)境因子的共同影響,由于AOA和AOB在自然界氮循環(huán)中有著重要的作用,尤其是AOA可能占據(jù)著縊蟶養(yǎng)殖塘氨氧化進(jìn)程的主導(dǎo)地位。因此,在縊蟶養(yǎng)殖過(guò)程中需要加強(qiáng)水質(zhì)指標(biāo)的監(jiān)控,尤其是含氮營(yíng)養(yǎng)鹽指標(biāo),控制好養(yǎng)殖密度、投餌量及廢棄物的排放,適當(dāng)投喂微生物等環(huán)境改良劑,防止水體富營(yíng)養(yǎng)化,確保養(yǎng)殖過(guò)程中氮循環(huán)的穩(wěn)定性,注重水產(chǎn)養(yǎng)殖與環(huán)境的可持續(xù)發(fā)展,提高縊蟶養(yǎng)殖產(chǎn)量。

表 2 水體及沉積物中AOB和AOA豐度與水環(huán)境因子的Pearson相關(guān)系數(shù)Tab.2 Pearson correlation coefficient of AOB and AOA abundance with water environmental parameters in water and sediments

表 3 縊蟶養(yǎng)殖池塘氨氧化微生物豐度與水環(huán)境因子的多元逐步回歸方程Tab.3 Stepwise multiple regression equation of ammoniaoxidized microbial abundance and water environment factors in Sinonovacula constricta pond