慈一帆 王海桃,2 劉曉涵 陳沉 李倩倩 宋揚(yáng)

(1 青島大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，山東 青島 266071； 2 青島大學(xué)第二附屬醫(yī)院)

結(jié)直腸癌(CRC)是世界上發(fā)病率排第三位的腫瘤[1]。據(jù)目前估計(jì)，全世界每年大約新增100多萬例CRC患者[2]。CRC的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的、長期的過程[3]，在腫瘤微環(huán)境中，各種促炎遞質(zhì)通過復(fù)雜的信號(hào)傳導(dǎo)途徑促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展[4]?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMP)由腫瘤細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞合成，在CRC的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[5]。其中MMP-2和MMP-9與細(xì)胞分化、凋亡、血管生成、免疫反應(yīng)和癌細(xì)胞生長有關(guān)[6]?？ㄅ嗨麨I是臨床上治療CRC的常用藥物，通過干擾細(xì)胞DNA合成，發(fā)揮抗腫瘤作用，但應(yīng)用卡培他濱的部分患者容易發(fā)生腹瀉等副作用[7-9]。植酸(IP6)是一種天然抗氧化劑，存在于全谷類、堅(jiān)果類及豆類中[10]，具有抗腫瘤作用[11]。肌醇(INS)是一種飽和的環(huán)狀多元醇，能協(xié)同IP6抑制CRC的發(fā)生和發(fā)展[12]。IP6與INS在正常飲食中大量存在，能安全有效地從胃腸道吸收[13]，IP6與INS合用可以輔助治療乳腺癌、CRC，緩解傳統(tǒng)化學(xué)療法的副作用，提高患者生活質(zhì)量[14-17]。IP6+INS是否可以輔助卡培他濱抑制CRC生長，目前尚未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究通過盲腸壁下注射腫瘤細(xì)胞方法建立小鼠CRC原位移植模型，研究IP6+INS輔助卡培他濱對(duì)CRC干預(yù)作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及飼養(yǎng)

SPF級(jí)BALB/c雄性小鼠100只，6～7周齡，購買于濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司。在SPF級(jí)(無特定病原體)條件下，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，平均濕度(52±8)%，平均溫度(24±2)℃，AIN93M標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由飲水。該研究通過了青島大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的審批(倫理編號(hào)：QYFYWZLL25667)。

1.2 細(xì)胞株及細(xì)胞培養(yǎng)

鼠CRC細(xì)胞CT-26購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。細(xì)胞培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)0.15的胎牛血清以及10 g/L青鏈霉素(100 kU/L青霉素,0.1 g/L鏈霉素)的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.3 試劑

IP6以及卡培他濱(上海麥克林生化科技有限公司)，INS(上海源葉生物科技有限公司)，ELISA試劑盒(武漢基因美生物科技有限公司)，D-熒光素蟲鉀鹽(北京索萊寶科技有限公司)，TRNzol總RNA提取試劑(天根生化科技(北京)有限公司)，PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser以及SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus)ROX plus(寶生物工程(大連)有限公司)，Western blot相關(guān)試劑(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)。

1.4 小鼠CRC原位移植模型的制備

體外培養(yǎng)CRC細(xì)胞CT-26，首先用慢病毒轉(zhuǎn)染CT-26細(xì)胞，后用嘌呤霉素篩選出能穩(wěn)定表達(dá)熒光蛋白的CT-26細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，用2.5 g/L胰蛋白酶消化重懸細(xì)胞，制備成1×109個(gè)細(xì)胞/L密度的細(xì)胞懸液備用。100只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周以后，腹腔注射10 g/L的戊巴比妥鈉(80 mg/kg)麻醉，在小鼠左下腹做一長1.5 cm左右的縱切口，用1 mL注射器采集0.2 mL細(xì)胞懸液，注射到小鼠盲腸漿膜層下，注射完畢后小心退出注射器，確認(rèn)無出血后逐層關(guān)腹縫合。

1.5 小鼠腫瘤生長情況觀察

根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在造模后第3周對(duì)小鼠進(jìn)行活體成像檢測，觀察小鼠腫瘤生長情況。

1.6 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及干預(yù)

活體成像結(jié)果顯示，在造模后第3周，有69只造模小鼠出現(xiàn)腫瘤。剔除體質(zhì)量較輕和生長狀態(tài)差的成瘤小鼠，最終將48只成瘤小鼠納入實(shí)驗(yàn)研究。按IP6+INS(干預(yù)和不干預(yù))和卡培他濱(干預(yù)和不干預(yù))兩個(gè)因素及兩個(gè)因素的不同水平交叉組合分為4組，分別為模型組(A組)、卡培他濱組(B組)、IP6+INS組(C組)、卡培他濱+IP6+INS組(D組)，4組小鼠分別用生理鹽水0.2 mL、60 mg/kg卡培他濱0.2 mL、80 mg/kg IP6和80 mg/kg INS共0.2 mL、60 mg/kg卡培他濱和80 mg/kg IP6及80 mg/kg INS共0.2 mL灌胃，每周灌胃5 d，連續(xù)灌胃6周。記錄小鼠進(jìn)食飲水量(每2 d記錄一次，計(jì)算各組小鼠日平均進(jìn)食飲水量)，觀察小鼠一般生長狀態(tài)。各組小鼠日平均進(jìn)食飲水量=記錄的各組小鼠進(jìn)食飲水總量/(該組小鼠總數(shù)×2)。

1.7 動(dòng)物處理及原位瘤組織稱質(zhì)量

根據(jù)小鼠的生存狀態(tài)確定處死時(shí)間。于末次灌胃12 h(禁食禁水)后摘除眼球取血并處死小鼠，血液離心后取上清液于-80℃冰箱保存。取原位瘤組織稱質(zhì)量。

1.8 小鼠血清中趨化因子CCL20、白細(xì)胞介素10(IL-10)、IL-12表達(dá)水平的檢測

按照酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒說明書操作，于酶標(biāo)儀中讀取波長450 nm處各孔吸光度，按稀釋標(biāo)準(zhǔn)品制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血清中CCL20、IL-10、IL-12水平。

1.9 小鼠原位瘤組織中MMP-2、MMP-9 mRNA表達(dá)的檢測

取50 mg原位瘤組織，在預(yù)冷的研缽中將組織樣本研磨成粉末狀后加入Trizol，提取總RNA。使用NanoDrop?ND-2000測定RNA濃度和純度，然后使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)2 μg總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，在20 μL反應(yīng)體系中進(jìn)行PCR。PCR采用兩步法，條件如下，95 ℃預(yù)變性5 min；然后95 ℃變性30 s, 60 ℃退火/延伸34 s,共進(jìn)行50個(gè)循環(huán)。檢測原位瘤組織中目的mRNA的CT值，計(jì)算得到各組目的mRNA的相對(duì)表達(dá)水平(計(jì)算公式2-△△CT)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取均值。引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列和產(chǎn)物長度

1.10 小鼠原位瘤組織中MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)的檢測

取約50 mg原位瘤組織，加入含有磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，提取腫瘤組織的總蛋白。采用BCA蛋白測定法測定蛋白濃度。測定完成后向各組蛋白中加入上樣緩沖液，混勻加熱，使蛋白變性。蛋白冷卻后加入到SDS-PAGE凝膠上電泳分離，將分離后的蛋白分子轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用含脫脂奶粉的TBST封閉2 h后，漂洗3次，加入一抗孵育3～4 h，漂洗后重新加入二抗孵育2 h。在顯影儀中顯影，得到目的蛋白條帶。以目的蛋白與內(nèi)參灰度值的比值表示蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.11 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠平均進(jìn)食飲水量的變化

析因設(shè)計(jì)方差分析結(jié)果顯示，IP6+INS與卡培他濱無交互作用(P>0.05)，IP6+INS干預(yù)可以升高腫瘤小鼠的日均進(jìn)食飲水量(F=10.627、18.053，P<0.05)，卡培他濱干預(yù)對(duì)腫瘤小鼠日平均進(jìn)食飲水量無明顯影響(P>0.05)。見表2。

表2 各組小鼠日均進(jìn)食量、飲水量比較

2.2 活體成像結(jié)果

活體成像結(jié)果顯示，造模3周后，小鼠原位組織區(qū)域出現(xiàn)顯影(圖1)，有腫瘤生長。

圖1 小鼠CRC原位移植模型建立3周時(shí)活體成像結(jié)果

2.3 各組小鼠生存情況及原位瘤質(zhì)量比較

實(shí)驗(yàn)期間A、B組各有4只和2只小鼠死亡，為惡病質(zhì)或原位腫瘤致腸梗阻所致。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)A、B、C、D組小鼠的原位瘤質(zhì)量分別為(5.90±0.41)、(2.55±0.41)、(3.53±0.96)、(1.71±0.58)g,經(jīng)析因設(shè)計(jì)方差分析結(jié)果顯示，IP6+INS與卡培他濱對(duì)原位瘤質(zhì)量有交互作用(F=13.772，P<0.05)，當(dāng)有或無卡培他濱干預(yù)時(shí)，IP6+INS對(duì)原位瘤質(zhì)量均具有明顯影響(F=8.868、62.123,P<0.05)，當(dāng)有或無IP6+INS干預(yù)時(shí)，卡培他濱對(duì)原位瘤質(zhì)量均有明顯影響(F=45.698、114.796,P<0.05)。

2.4 各組小鼠血清中CCL20、IL-10、IL-12表達(dá)水平比較

析因設(shè)計(jì)方差分析結(jié)果顯示，IP6+INS與卡培他濱有交互作用(F=5.731～50.311，P<0.05)；有或無卡培他濱干預(yù)時(shí)，IP6+INS對(duì)小鼠血清中CCL20、IL-10和IL-12表達(dá)水平均具有明顯的影響(F=30.753～321.372，P<0.05)；有或無IP6+INS干預(yù)時(shí)，卡培他濱對(duì)小鼠血清中CCL20、IL-10以及IL-12表達(dá)水平均具有明顯的影響(F=20.578～757.673，P<0.05)。見表3。

表3 各組小鼠血清中CCL20、IL-10和IL-12表達(dá)水平比較

2.5 各組小鼠原位瘤組織中MMP-2、MMP-9蛋白及mRNA表達(dá)情況比較

析因設(shè)計(jì)方差分析結(jié)果顯示，IP6+INS與卡培他濱有交互作用(F=7.007～9.974，P<0.05)；當(dāng)有或無卡培他濱干預(yù)時(shí)，IP6+INS對(duì)小鼠腫瘤組織中MMP-2、MMP-9蛋白以及mRNA表達(dá)水平均有明顯的影響(F=7.330～82.807，P<0.05)；當(dāng)有或者無IP6+INS干預(yù)時(shí)，卡培他濱對(duì)小鼠腫瘤組織中MMP-2、MMP-9蛋白及mRNA表達(dá)水平均有明顯的影響(F=10.687～80.808，P<0.05)。見表4。

表4 各組小鼠腫瘤組織中MMP-2、MMP-9蛋白及mRNA表達(dá)水平比較

3 討 論

本研究采用盲腸壁下注射腫瘤細(xì)胞的方法建立小鼠CRC原位移植模型，模型中小鼠的腫瘤發(fā)生率為69%，通過卡培他濱、IP6+INS、卡培他濱+IP6+INS 3種方式對(duì)腫瘤模型小鼠進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果表明3種干預(yù)方式均可以顯著降低小鼠的原位瘤質(zhì)量，其中卡培他濱+IP6+INS降低CRC原位瘤質(zhì)量的效果最為顯著，說明IP6+INS不僅可以抑制腫瘤的進(jìn)展，而且可以協(xié)同卡培他濱更好地發(fā)揮抗腫瘤的作用。

CRC的發(fā)生發(fā)展與機(jī)體免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)密切相關(guān)[18]，炎癥細(xì)胞因子在免疫細(xì)胞的分化、成熟、增殖、激活、免疫調(diào)節(jié)和介導(dǎo)炎癥反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用，參與多種生理和病理反應(yīng)[19]。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，IL-10作為一種重要的免疫抑制因子，可以通過多種途徑抑制免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤的殺傷作用，促進(jìn)腫瘤的發(fā)展[20]。IL-12是一種由樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和B淋巴母細(xì)胞在抗原刺激下自然產(chǎn)生的細(xì)胞因子，在自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用[21]。腫瘤細(xì)胞分泌的CCL20不僅可以影響免疫細(xì)胞的功能，還可以直接作用于腫瘤細(xì)胞，目前已有研究表明CCL20通過刺激CCR6/NF-kB信號(hào)和PI3K/AKT-ERK信號(hào)調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移[22-23]。本研究結(jié)果顯示，卡培他濱、IP6+INS、卡培他濱+IP6+INS 3種干預(yù)措施均可以顯著降低CRC小鼠血清中IL-10、CCL20表達(dá)水平，升高IL-12表達(dá)水平，以卡培他濱+IP6+INS效果最為顯著。

研究顯示MMP可以影響免疫反應(yīng)，并能促進(jìn)血管生成影響腫瘤進(jìn)展[5-6]。KATRIN等[6]研究發(fā)現(xiàn)，MMP-2和MMP-9蛋白在惡性結(jié)腸黏膜中的表達(dá)增加。本研究發(fā)現(xiàn)，卡培他濱、IP6+INS、卡培他濱+IP6+INS 3種干預(yù)措施均可以降低CRC小鼠原位瘤組織中MMP-2、MMP-9蛋白及mRNA的表達(dá)，以卡培他濱+IP6+INS的作用效果最佳。

CRC的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的過程，其中炎癥因子以及MMP在CRC發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用[6，19]。本研究結(jié)果顯示，卡培他濱、IP6+INS、卡培他濱+IP6+INS均可以影響炎癥因子以及MMP的表達(dá)，具體表現(xiàn)為降低CRC小鼠血清中IL-10和CCL20的表達(dá)水平，升高IL-12的表達(dá)水平；降低CRC小鼠原位瘤組織中MMP-2、MMP-9 mRNA以及蛋白的表達(dá)水平，其中以卡培他濱+IP6+INS作用效果最佳。

綜上所述，IP6+INS可以輔助卡培他濱抑制BALB/c小鼠CRC的生長，其作用機(jī)制可能與影響炎癥因子及降低MMP-2、MMP-9 mRNA及蛋白的表達(dá)有關(guān)，但其具體作用機(jī)制還需要進(jìn)一步深入研究。