韓清昕 侯琳 吳琍 陳鳳婷 于超 紀(jì)涵青

(1 青島大學(xué)附屬醫(yī)院乳腺外科，山東 青島 266003； 2 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室)

MicroRNAs是一類由20～25個(gè)核苷酸組成的非編碼單鏈小分子RNA，通過與mRNA的3′非翻譯區(qū)(3′UTR)堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，沉默后續(xù)靶基因發(fā)揮調(diào)控作用[1]。miR-429是miRNA-200家族成員之一，其作為癌基因或者抑癌基因在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的調(diào)控作用[2]。miR-429在多種組織中均有表達(dá)，如在胃癌、結(jié)直腸癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌組織中均呈異常表達(dá)[3]。低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1(LRP1)是一種多功能內(nèi)吞細(xì)胞信號(hào)受體[4]，表達(dá)于多種細(xì)胞表面。LRP1可通過介導(dǎo)細(xì)胞外配體的內(nèi)吞作用影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展[5]。本研究擬探討miR-429對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的影響及其作用機(jī)制，為進(jìn)一步尋找乳腺癌診斷治療的標(biāo)志物奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

293T細(xì)胞(中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)提供)，人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部中心實(shí)驗(yàn)室提供)。

1.2 儀器與試劑

Tecan Infinite Pro全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司)，MTT試劑(美國(guó)Sigma公司)，鼠抗人GAPDH抗體(北京全式金生物技術(shù)有限公司)，兔抗人LRP1抗體(恩晶生物科技有限公司)，pSI-Check2載體、HB-infusionTM無縫克隆試劑盒(漢恒生物科技有限公司)，大腸桿菌菌株DH5a(美國(guó)Invitrogen公司)，LRP1基因野生型3′UTR(LRP1-3UTR-wt)、突變型3′UTR(LRP1-3UTR-mu)片段由漢恒生物科技有限公司合成，質(zhì)粒DNA抽提試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞接種于含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清和10 g/L的青鏈霉素溶液的高糖DMEM培養(yǎng)基中，于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)用于后續(xù)細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

1.4 MTT方法檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231細(xì)胞，以每孔約6 000個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，共鋪5塊板，待細(xì)胞密度達(dá)到40%左右進(jìn)行轉(zhuǎn)染，每孔按mimics NC 0.6 μL+EL轉(zhuǎn)染試劑0.4 μL的體系加入不同的轉(zhuǎn)染成分，按轉(zhuǎn)染成分不同共分為5組，分別為mimics NC組(A組)、空白對(duì)照組(B組)、inhibitors組(C組)、inhibitors NC組(D組)和miR-429 mimics組(E組)。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞繼續(xù)于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。于轉(zhuǎn)染后的0、24、48、72、96 h分別檢測(cè)細(xì)胞活力。檢測(cè)前每孔加入稀釋好的5 g/L的MTT溶液10 μL，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后棄去培養(yǎng)液，每孔加入100 μL溶解甲瓚顆粒，震蕩2 min，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔490 nm波長(zhǎng)處的吸光度值(A)。

1.5 Western blot方法檢測(cè)細(xì)胞LRP1蛋白的相對(duì)表達(dá)量

將轉(zhuǎn)染后的5組細(xì)胞去除殘留培養(yǎng)液并用PBS清洗3次，加入RIPA蛋白裂解液，提取總蛋白，以BCA法檢測(cè)蛋白濃度。按SDS-PAGE凝膠試劑盒說明配置體積分?jǐn)?shù)0.10分離膠以及體積分?jǐn)?shù)0.05的濃縮膠，待電泳分離蛋白以后轉(zhuǎn)移至膜孔徑為0.45 μm的PVDF膜上；將剪好的條帶置于搖床上于50 g/L脫脂奶粉中封閉2 h，用1∶1 000稀釋好的鼠抗人GAPDH抗體、兔抗人LRP1抗體于室溫?fù)u床上孵育2.5 h，4 ℃下孵育過夜，TBST洗膜10 min，共3次；二抗室溫孵育1 h后，TBST洗膜3次。采用ECL發(fā)光液顯影，目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量以目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值計(jì)算。

1.6 構(gòu)建熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒

以人基因組DNA為模板，應(yīng)用TargetScan 7.1軟件預(yù)測(cè)miR-429與LRP1基因3′UTR潛在的互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，預(yù)測(cè)的結(jié)合位點(diǎn)位于第167～174個(gè)堿基。構(gòu)建含有miR-429應(yīng)答序列的LRP1基因3′UTR片段，然后突變結(jié)合位點(diǎn)，構(gòu)建突變型基因片段，目的基因片段及突變型基因片段兩端均添加與線性化載體兩端一致的基因序列，以便于拼接反應(yīng)的進(jìn)行。交由公司合成目的基因片段及突變型基因片段。按照HB-infusionTM無縫克隆試劑盒配置40 μL的酶切體系：400 mg/L載體2 μL，酶1 μL，10×buffer 4 μL、ddH2O 33 μL；將pSI-Check2載體進(jìn)行雙酶切，并跑膠回收；回收的線性化載體置于20 μL連接反應(yīng)體系中50 ℃溫浴20 min，將合成的基因片段與線性化載體連接。

向在室溫解凍的100 μL DH5a感受態(tài)細(xì)胞懸液中加入6 μL連接產(chǎn)物，搖勻后置于冰上30 min，于42 ℃水浴中熱擊90 s并迅速置于冰上冷卻。加入1 mL不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，混勻后置于37 ℃搖床220 r/min振蕩培養(yǎng)1 h。菌液搖勻離心后，取去除900 μL上清液后的100 μL培養(yǎng)基吸打混勻后涂布于含氨芐西林(Amp)的篩選平板上。平板正面向上至菌液完全吸收后倒置培養(yǎng)皿，37 ℃培養(yǎng)24 h。轉(zhuǎn)化后的菌落在平板上挑菌，37 ℃下250 r/min搖菌14 h后用菌液進(jìn)行雙酶切，將陽性克隆菌液送測(cè)序公司測(cè)序。野生型報(bào)告基因質(zhì)粒含有正確結(jié)合位點(diǎn)的基因序列，突變型報(bào)告基因質(zhì)粒含有經(jīng)突變過的結(jié)合位點(diǎn)基因序列，將構(gòu)建的野生型以及突變型熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒分別命名為h-LRP1-3UTR-wt和h-LRP1-3UTR-mu。

1.7 重組載體與miR-429 mimics或NC mimics分別共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞

將293T細(xì)胞按照轉(zhuǎn)染的成分不同隨機(jī)分為4組，分別為轉(zhuǎn)染h-LRP1-3UTR-mu與NC mimics組(F組)、h-LRP1-3UTR-mu與miR-429 mimics組(G組)、h-LRP1-3UTR-wt與NC mimics組(H組)、h-LRP1-3UTR-wt與miR-429 mimics組(I組)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，待96孔板中的293T細(xì)胞密度達(dá)到50%～70%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，使用的是漢恒生物濃度為0.8 g/L的轉(zhuǎn)染試劑。將10 μL DMEM與0.16 μg的h-LRP1-3UTR-wt/h-LRP1-3UTR-mu目的質(zhì)粒以及5 pmoL的miR-429 mimics/NC mimics充分混勻后室溫放置(溶液1)，將10 μL DMEM與0.3 μL的轉(zhuǎn)染試劑輕輕混勻(溶液2)，室溫放置5 min后將溶液1與溶液2充分混勻，放置20 min。轉(zhuǎn)染前為細(xì)胞換取新鮮培養(yǎng)基，加入轉(zhuǎn)染混合物混勻后于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染6 h后換取新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后進(jìn)行熒光素酶活性檢測(cè)。

1.8 雙熒光素酶報(bào)告基因活性的檢測(cè)與分析

轉(zhuǎn)染后的F、G、H、I組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h，棄掉舊的培養(yǎng)基，用PBS清洗2次，96孔板每孔加入100 μL蒸餾水稀釋的1×PLB，用移液槍吹散細(xì)胞，置于搖床上室溫緩慢搖15 min以后，吸取細(xì)胞裂解液至1.5 mL離心管中，4 ℃下12 000 r/min離心10 min，取上清液于新的EP管中；在96孔板中每孔加入100 μL熒光素酶檢測(cè)試劑 Ⅱ (LAR Ⅱ)工作液；每孔加入20 μL細(xì)胞裂解液，移液槍吹打混勻2～3次以后測(cè)定記錄螢火蟲熒光素酶活性值，此值為內(nèi)參值。每樣品中再加入Stop & Glo?Reagent 100 μL，移液槍吹打混勻后測(cè)定記錄海腎熒光素酶活性值，為報(bào)告基因發(fā)光值。熒光檢測(cè)儀會(huì)根據(jù)之前檢測(cè)到的螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶活性值的比值表示相對(duì)熒光素酶活性。應(yīng)用KEGG信號(hào)通路分析預(yù)測(cè)miR-429調(diào)控LRP1的表達(dá)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的作用機(jī)制。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 miR-429表達(dá)對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖影響

析因設(shè)計(jì)的方差分析結(jié)果顯示，分組、時(shí)間及分組與時(shí)間對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖活力有明顯的影響(F=3.94～342.90，P<0.05)。自細(xì)胞培養(yǎng)的第2天始各組細(xì)胞增殖活力與第0、1天比較差異有顯著性(F=40.53～116.33，P<0.05)；在細(xì)胞培養(yǎng)的第2～4天，E組細(xì)胞的增殖活力明顯低于B、C、D組(F=4.53～19.12，P<0.05)。見表1。

表1 各組細(xì)胞增殖活力比較

2.2 miR-429表達(dá)對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞LRP1蛋白表達(dá)的影響

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，E、A、B、C、D組細(xì)胞的LRP1蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為0.51±0.07、1.11±0.29、2.38±0.77、1.83±0.48、1.93±0.48，E組細(xì)胞LRP1蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯低于A、B、C、D組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=6.26，P<0.05)。

2.3 LRP1與miR-429的結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)

通過TargetScan 7.1軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，LRP1與miR-429存在結(jié)合位點(diǎn)(圖2)。

圖2 TargetScan 7.1軟件預(yù)測(cè)miR-429與LRP1 3′UTR的結(jié)合位點(diǎn)

E、A、B、C、D分別為E、A、B、C、D組

圖1 Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各組MDA-MB-231細(xì)胞LRP1蛋白的表達(dá)情況

2.4 重組載體構(gòu)建質(zhì)粒結(jié)果

將雙酶切后的h-LRP1-3UTR-wt和h-LRP1-3UTR-mu載體質(zhì)粒進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后，切膠回收的片段交由公司測(cè)序。比較圖3A(LRP1基因3′UTR野生型部分測(cè)序圖，陰影部分為與miR-429結(jié)合序列)和圖3B(LRP1基因 3′UTR突變型部分測(cè)序峰圖，陰影部分為突變與miR-429結(jié)合序列)的測(cè)序圖，表明兩種重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

A：h-LRP1-3UTR-wt部分測(cè)序圖；B：h-LRP1-3UTR-mu部分測(cè)序圖

2.5 熒光素酶活性分析

熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果顯示，I組、H組熒光素酶活性分別為0.50±0.01、1.00±0.02，兩組比較差異有顯著性(t=39.78，P<0.01)。突變后，G組、F組熒光素酶活性分別為0.99±0.38、1.00±0.01，兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。通過KEGG信號(hào)通路分析LRP1基因結(jié)果顯示，細(xì)胞膜表面的LRP1蛋白可通過參與調(diào)節(jié)胞內(nèi)β淀粉樣蛋白(Aβ)低聚體的水平，調(diào)控細(xì)胞周期。

3 討 論

細(xì)胞膜表面的LRP1蛋白可內(nèi)吞Aβ，在胞內(nèi)進(jìn)一步濃縮聚合為Aβ聚合體[6]，Aβ是由在各種組織中廣泛存在的淀粉樣前體蛋白(APP)經(jīng)β和γ-分泌酶水解產(chǎn)生。當(dāng)miR-429過表達(dá)使LRP1蛋白翻譯量減少時(shí)，Aβ聚合體的合成減少，更多的Aβ以低聚Aβ的形式進(jìn)入細(xì)胞，在線粒體內(nèi)抑制細(xì)胞色素c氧化酶Ⅳ亞型(CxⅣ)以及A-β結(jié)合乙醇脫氫酶(ABAD)的作用使線粒體功能紊亂誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，或在線粒體內(nèi)直接作用于肽基脯氨酸順反異構(gòu)酶D(CypD)，通過線粒體膜通道孔(MPTP)進(jìn)入細(xì)胞基質(zhì)，活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase 3)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。已有研究表明APP與侵襲性乳腺癌密切相關(guān)，可能抑制乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[7]。本課題前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在MDA-MB-231細(xì)胞中上調(diào)miR-429表達(dá)可降低LRP1蛋白表達(dá)水平，乳腺癌細(xì)胞的遷移能力降低[8]。這可能是由LRP1表達(dá)量降低時(shí)Aβ聚合體生成減少，抑制APP水解，APP積聚增多而低聚Aβ生成增多引起。

miR-429與人類多種惡性腫瘤密切相關(guān)，在不同的癌組織中發(fā)揮抑癌或者促癌作用。miR-429通過靶向調(diào)控基因表達(dá)在腫瘤中發(fā)揮抑癌作用，該結(jié)果在對(duì)骨肉瘤、宮頸癌、胃癌、口腔鱗癌、食管癌及膠質(zhì)瘤的研究中得到證實(shí)[9-14]。有研究表明，miR-429在肺癌、前列腺癌及子宮內(nèi)膜癌中通過靶向調(diào)控基因表達(dá)發(fā)揮促癌作用[15-17]。YU等[18]的研究結(jié)果表明，miR-429在胰腺癌中可通過調(diào)節(jié)程序性細(xì)胞死亡因子4(PDCD4)的表達(dá)，提高胰腺癌細(xì)胞對(duì)吉西他濱的敏感性。本研究MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，上調(diào)miR-429表達(dá)后MDA-MB-231細(xì)胞增殖活力明顯降低，說明miR-429表達(dá)可抑制人乳腺癌細(xì)胞的增殖。

LRP1作為一種多功能內(nèi)吞細(xì)胞信號(hào)受體，具有內(nèi)吞和信號(hào)活性。在腫瘤中LRP1的表達(dá)水平經(jīng)常被下調(diào)，有研究認(rèn)為低LRP1水平是不良預(yù)后因素[19]。已經(jīng)研究證實(shí)LRP1在食管癌中發(fā)揮調(diào)控作用[20]。SONG等[21]的研究表明，miR-205可通過下調(diào)LRP1基因的表達(dá)來抑制腫瘤細(xì)胞的遷移，人類LRP1的表達(dá)部分受特異性miRNA的調(diào)控，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞遷移減少。本研究Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在MDA-MB-231細(xì)胞中上調(diào)miR-429的表達(dá)水平可致LRP1蛋白表達(dá)量下調(diào)。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)的結(jié)果顯示，miR-429可顯著下調(diào)h-LRP1-3UTR-wt的熒光素酶表達(dá)，說明兩者間存在結(jié)合作用，miR-429未能下調(diào)h-LRP1-3UTR-mu的熒光素酶的表達(dá)，說明了突變成功。miR-429對(duì)LRP1存在靶向調(diào)控作用，在蛋白質(zhì)翻譯的過程中下調(diào)LRP1基因的表達(dá)。目前關(guān)于miR-429以及LRP1在乳腺癌中的研究較少，本研究通過雙熒光素酶報(bào)告基因的方法成功構(gòu)建LRP1-3UTR熒光素酶報(bào)告基因載體，并首次驗(yàn)證了miR-429與LRP1的靶向調(diào)控關(guān)系，并通過KEGG通路分析初步證實(shí)了miR-429可能是通過調(diào)節(jié)LRP1基因的表達(dá)調(diào)控乳腺癌細(xì)胞周期的作用機(jī)制。

總之，本研究首次驗(yàn)證miR-429通過對(duì)LRP1基因的靶向調(diào)控作用來抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖，其對(duì)LRP1基因的靶向調(diào)控作用是通過與LRP1基因3′UTR互補(bǔ)結(jié)合得以實(shí)現(xiàn)的，但miR-429靶向調(diào)控LRP1基因發(fā)揮抑癌作用的機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。