何曉燕 崔寶龍 李鵬飛 姚魯清 趙芳 周暢

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，山東 青島 266003)

肌萎縮側(cè)索硬化癥(ALS)是一種選擇性作用于運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的致命性神經(jīng)退行性疾病，患者的發(fā)病年齡、發(fā)病部位、疾病進(jìn)展情況以及存活時(shí)間等方面差異很大[1]。ALS的特征性病理表現(xiàn)是運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元內(nèi)某些蛋白聚集，常見(jiàn)的有超氧化物歧化酶1(SOD1)、TAR DNA/RNA 結(jié)合蛋白43(TDP43)、肉瘤融合基因蛋白等[2]。ALS發(fā)病原因尚不清楚，但有研究顯示ALS中運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的死亡可能是非細(xì)胞自主性的，提示ALS的發(fā)病可能與非運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞有關(guān)[3-5]。星形膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)含量最多的非神經(jīng)元細(xì)胞，對(duì)神經(jīng)元起著營(yíng)養(yǎng)支持作用[1]。研究顯示非神經(jīng)元細(xì)胞中的星形膠質(zhì)細(xì)胞在病理狀態(tài)下，如轉(zhuǎn)染SOD1質(zhì)粒的星形膠質(zhì)細(xì)胞和正常神經(jīng)元在體外共培養(yǎng)時(shí)，能夠促進(jìn)神經(jīng)元的死亡[6]。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，星形膠質(zhì)細(xì)胞可能與散發(fā)性ALS(sALS)有關(guān)[7]。更應(yīng)引起注意的是，來(lái)源于家族性ALS(fALS)和sALS患者的星形膠質(zhì)細(xì)胞或星形膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基與神經(jīng)元共培養(yǎng)后，均能夠?qū)ι窠?jīng)元產(chǎn)生同樣的毒性作用[8]。目前的研究已經(jīng)表明，ALS運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的選擇性神經(jīng)退行性變性與星形膠質(zhì)細(xì)胞有關(guān)，但關(guān)于星形膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)毒性的潛在機(jī)制仍不是很清楚[9]。熱休克反應(yīng)(HSR)是在應(yīng)激狀態(tài)下誘導(dǎo)一組熱休克蛋白基因發(fā)生轉(zhuǎn)錄的一種內(nèi)源性細(xì)胞保護(hù)機(jī)制[10]。HSR異?？赡苁茿LS潛在的病理機(jī)制之一，但關(guān)于星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)神經(jīng)元HSR的影響及其機(jī)制還有待深入研究。神經(jīng)元在應(yīng)激狀態(tài)下的HSR能夠保護(hù)細(xì)胞避免產(chǎn)生錯(cuò)誤折疊蛋白，從而避免產(chǎn)生蛋白沉淀，并能夠促進(jìn)錯(cuò)誤折疊蛋白如TDP43的清除[11]。百草枯(PQ)是一種農(nóng)藥，能夠引起神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)TDP43蛋白聚集，常用來(lái)制作ALS疾病模型[12]。本實(shí)驗(yàn)旨在探討PQ誘導(dǎo)下星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)熱休克蛋白表達(dá)以及神經(jīng)細(xì)胞存活率的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y細(xì)胞系和人星形膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87細(xì)胞系均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。胎牛血清購(gòu)于美國(guó)BI公司；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó) Gibco公司；PQ購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；CCK8試劑購(gòu)于美國(guó)MCE公司；Anti-HSF1、Anti-HSPB8、Anti-HSP70抗體購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling Technology公司；內(nèi)參GAPDH和二抗均購(gòu)于中國(guó)Elabscience公司。

1.2 建立細(xì)胞共培養(yǎng)體系

SH-SY5Y細(xì)胞以4.5×104/cm2的密度接種于6孔板上(下室)，U87細(xì)胞以4.5×104/cm2的密度接種于上室的聚碳酸酯膜上(孔徑0.4 μm，直徑30 mm)，上下兩室分別加入DMEM完全培養(yǎng)基分開(kāi)培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，將上室U87細(xì)胞插入下室SH-SY5Y細(xì)胞中，置于含體積分?jǐn)?shù)0.1胎牛血清和10 U/L青鏈霉素的DMEM中，于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，模擬神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境，建立Trans-well系統(tǒng)共培養(yǎng)體系。

1.3 CCK8法檢測(cè)U87細(xì)胞和SH-SY5Y細(xì)胞存活率

U87細(xì)胞和SH-SY5Y細(xì)胞分為未經(jīng)PQ處理組(對(duì)照組)及經(jīng)100、200、300、400、500 μmol/L PQ處理組(實(shí)驗(yàn)組)，以只含培養(yǎng)基組為空白組。各組培養(yǎng)在24 h后，按照1∶10的體積比加入CCK8，37 ℃孵育1 h后，酶標(biāo)儀測(cè)560 nm波長(zhǎng)處的吸光度值(A值)。細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組A值-空白組A值)/(對(duì)照組A值-空白組A值)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.4 細(xì)胞免疫熒光化學(xué)染色法檢測(cè)SH-SY5Y細(xì)胞中TDP43蛋白的定位表達(dá)情況

實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組(SH-SY5Y細(xì)胞無(wú)PQ處理)、模型對(duì)照組(SH-SY5Y細(xì)胞經(jīng)300 μmol/L PQ處理24 h)。各組細(xì)胞用多聚甲醛室溫下固定15 min, 以體積分?jǐn)?shù)0.005 Triton X-100室溫下通透20 min，后以體積分?jǐn)?shù)0.1的山羊血清室溫下封閉30 min，然后以TDP43一抗4 ℃下孵育過(guò)夜，再以綠色熒光二抗37 ℃孵育1 h，DAPI復(fù)染核，含抗熒光淬滅劑的封片劑封片，于倒置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.5 CCK8法檢測(cè)各組SH-SY5Y細(xì)胞存活率

實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組(SH-SY5Y細(xì)胞無(wú)PQ處理)、模型對(duì)照組(SH-SY5Y細(xì)胞經(jīng)300 μmol/L PQ處理24 h)及共培養(yǎng)組(U87細(xì)胞和SH-SY5Y細(xì)胞共培養(yǎng)體系經(jīng)300 μmol/L PQ處理24 h)。CCK8法檢測(cè)各組SH-SY5Y細(xì)胞存活情況，并計(jì)算存活率。

1.6 蛋白免疫印跡法(Western blotting)檢測(cè)SH-SY5Y細(xì)胞中熱休克蛋白和TDP43蛋白表達(dá)

提取空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、共培養(yǎng)組SH-SY5Y細(xì)胞總蛋白，每孔20 μg蛋白等質(zhì)量上樣，經(jīng)SDS-丙烯酰胺凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05的脫脂牛奶封閉1 h后，一抗HSF1(1∶ 1 000)、HSPB8(1∶1 000)、HSP70(1∶1 000)、TDP43(1∶1 000)、GADPH(1∶1 000)孵育過(guò)夜；二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h后，ECL發(fā)光劑顯色發(fā)光，成像分析儀檢測(cè)分析，Image J軟件分析灰度值后計(jì)算蛋白含量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用單因素方差分析(AN0VA)以及LSD法進(jìn)行組間比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PQ對(duì)U87細(xì)胞和SH-SY5Y細(xì)胞存活率影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著PQ濃度的增加，U87細(xì)胞以及SH-SY5Y細(xì)胞的存活率均呈逐漸降低(F=9.14、37.52,P<0.01)；與對(duì)照組相比較，當(dāng)PQ濃度為200 μmol/L時(shí)，SH-SY5Y細(xì)胞存活率明顯降低,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),PQ濃度為300 μmol/L 時(shí)，U87細(xì)胞的存活率明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 不同濃度的PQ對(duì)SH-SY5Y和U87細(xì)胞存活率的影響

2.2 各組細(xì)胞內(nèi)TDP43蛋白的表達(dá)情況

細(xì)胞免疫熒光化學(xué)染色結(jié)果顯示，空白對(duì)照組SH-SY5Y細(xì)胞中的TDP43蛋白在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)，模型對(duì)照組SH-SY5Y細(xì)胞中的TDP43蛋白在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)(圖 1)。

箭頭所示為T(mén)DP43蛋白，免疫化學(xué)染色，100 μm

2.3 各組SH-SY5Y細(xì)胞存活率比較

空白對(duì)照組、模型對(duì)照組和共培養(yǎng)組之間的SH-SY5Y細(xì)胞存活率具有顯著性差異(F=22.69,P<0.01)；與空白對(duì)照組相比較，模型對(duì)照組SH-SY5Y細(xì)胞存活率明顯降低(P<0.01)；與模型對(duì)照組相比，共培養(yǎng)組SH-SY5Y細(xì)胞存活率也明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.4 各組SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)熱休克蛋白和TDP43蛋白表達(dá)水平比較

空白對(duì)照組、模型對(duì)照組和共培養(yǎng)組間細(xì)胞內(nèi)HSF1、HSP70、HSPB8和TDP43蛋白表達(dá)差異有顯著性(F=6.42～28.19,P<0.05)；與空白對(duì)照組相比較，模型對(duì)照組SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)的HSP70、HSPB8以及TDP43表達(dá)明顯升高(P<0.05)。與模型對(duì)照組相比較，共培養(yǎng)組SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)的HSF1、HSPB8表達(dá)均降低(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 PQ對(duì)各組SH-SY5Y細(xì)胞的存活率、熱休克蛋白及TDP43蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

研究顯示神經(jīng)元的存活會(huì)受到非神經(jīng)元細(xì)胞的影響[5]。在突變的超氧化物歧化酶1(mSOD1)轉(zhuǎn)基因嵌合體小鼠模型內(nèi)，表達(dá)mSOD1的非神經(jīng)元細(xì)胞與野生型運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元共培養(yǎng)后，野生型運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元內(nèi)出現(xiàn)ALS的典型病理特征——泛素陽(yáng)性的蛋白質(zhì)聚集體[13]，提示表達(dá)mSOD1的非神經(jīng)元細(xì)胞可導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的損傷。

星形膠質(zhì)細(xì)胞是最常見(jiàn)的非神經(jīng)元細(xì)胞，廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)[1]。體外研究結(jié)果顯示，表達(dá)mSOD1的星形膠質(zhì)細(xì)胞和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元共培養(yǎng)時(shí)，能夠使運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的存活明顯減少[6]。并且表達(dá)mSOD1的星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元具有選擇性毒性，但對(duì)背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元等來(lái)源的中間神經(jīng)元沒(méi)有毒性[14]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，表達(dá)mSOD1的星形膠質(zhì)細(xì)胞在大鼠體內(nèi)對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元具有毒性作用，能夠引起運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元死亡，導(dǎo)致大鼠前肢運(yùn)動(dòng)功能和呼吸功能障礙[15]。來(lái)源于7例sALS患者和1例fALS患者的星形膠質(zhì)細(xì)胞與運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元共培養(yǎng)后，均產(chǎn)生了同樣的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元毒性效應(yīng)，提示星形膠質(zhì)細(xì)胞在ALS發(fā)病中發(fā)揮了重要作用[8]。

但BHATIA等[16]的研究結(jié)果表明，PQ處理后的星形膠質(zhì)細(xì)胞仍然能對(duì)神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)中，原代神經(jīng)元經(jīng)PQ處理后與星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)，并再次用PQ處理共培養(yǎng)后的2種細(xì)胞，結(jié)果顯示，PQ誘導(dǎo)后的星形膠質(zhì)細(xì)胞仍能促進(jìn)神經(jīng)元的存活，不會(huì)失去對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用。

本研究結(jié)果顯示，經(jīng)PQ處理后的星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞共培養(yǎng)后，神經(jīng)細(xì)胞的存活率明顯降低，提示PQ誘導(dǎo)后的星形膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的死亡，與 CLEMENT等[13]的研究結(jié)果一致，但與BHATIA等[16]的研究結(jié)果截然相反，可能與選擇的細(xì)胞類型不同、PQ處理的濃度不同或者實(shí)驗(yàn)方法存在差異等有關(guān)，因此還需要更深入的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)行驗(yàn)證。

HSR是在應(yīng)激狀態(tài)下誘導(dǎo)熱休克蛋白表達(dá)，以維持細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)正常折疊的一種內(nèi)源性細(xì)胞保護(hù)機(jī)制[10]。應(yīng)激狀態(tài)下的HSR能夠減少神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)錯(cuò)誤折疊蛋白的產(chǎn)生，以及促進(jìn)異常聚集蛋白的清除[17]。現(xiàn)有研究顯示，脊髓原代細(xì)胞培養(yǎng)中，誘導(dǎo)HSR后，星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的HSP70明顯上調(diào)，但運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中HSP70的表達(dá)并沒(méi)有增加，提示應(yīng)激狀態(tài)下的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元缺乏HSR[18]。本研究中神經(jīng)細(xì)胞經(jīng)PQ處理后熱休克蛋白表達(dá)增加，提示神經(jīng)細(xì)胞在應(yīng)激狀態(tài)下能夠提高自身HSR；但將PQ誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞與PQ誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)后，神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)HSF1、HSPB8的表達(dá)減少，提示PQ誘導(dǎo)后星形膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)抑制神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)熱休克蛋白的表達(dá)，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用。但PQ誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞抑制熱休克蛋白表達(dá)的同時(shí)，并未促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)TDP43蛋白聚集增加。提示神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)HSR異常，可能不是導(dǎo)致TDP43蛋白聚集的病理機(jī)制。

綜上所述，PQ誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞能抑制神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)熱休克蛋白的表達(dá)，并促進(jìn)細(xì)胞死亡，但對(duì)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)TDP43的表達(dá)無(wú)影響，提示HSR異?？赡懿皇?ALS的病理機(jī)制，仍需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行探究。