劉靖 王凱 錢麗麗 董妍涵

(青島大學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院，山東 青島 266021)

心肌肥厚是患者心臟在超負(fù)荷工作時表現(xiàn)出的一種生理性、代償性和適應(yīng)性反應(yīng)，持續(xù)性心肌肥厚可能導(dǎo)致心臟重構(gòu)和心力衰竭，甚至猝死[1]，然而心肌肥厚潛在的分子機制尚沒有完全研究清楚，識別調(diào)節(jié)心肌肥厚的分子對于預(yù)防和治療心力衰竭具有重要意義。piwi互作RNA(piRNA)是一類長度為26～31個核苷酸(nt)的非編碼RNA[2]。此前在對果蠅睪丸和胚胎的研究中發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)的piRNA可以抑制轉(zhuǎn)座子活性從而維持基因組的完整性和穩(wěn)定性[3-4]，能夠在生殖細胞或體細胞等不同組織基因中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[5]，還可以作為癌基因或腫瘤抑制因子在許多腫瘤中發(fā)揮作用[6]，如piRNA-39980與神經(jīng)母細胞瘤(NB)的發(fā)生有關(guān)，過表達的piRNA-39980可促進腫瘤發(fā)生，敲低piRNA-39980則能夠降低腫瘤活性[7]。已有研究表明，在心臟中存在著多種類型的piRNA，并且在心臟發(fā)育過程中表達豐度也會發(fā)生改變，推測piRNA很有可能具有調(diào)控心臟發(fā)育的功能，對心血管系統(tǒng)疾病如心肌肥厚等或許也有一定的調(diào)控作用[8]。前期預(yù)實驗中發(fā)現(xiàn)，在異丙腎上腺素(ISO)誘導(dǎo)的肥大心肌細胞中，有多種piRNA表達量發(fā)生異常，其中piRNA-514表達異常程度最高，因此本研究以piRNA-514作為研究對象，旨在探討piRNA-514對心肌細胞肥大的調(diào)控作用及其機制，為臨床治療心肌肥厚提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來源

1～2日齡雌雄不限的C57乳鼠以及8周齡雄性C57小鼠均購買自青島大任富城畜牧有限公司。DMEM-F12培養(yǎng)基、PBS緩沖液、胎牛血清(美國Gibco公司)，RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Trizol Reagent、胰蛋白酶、Ⅱ型膠原酶、SYBR Fast qPCR mix、DEPC原液(日本TaKaRa公司)，PCR引物(深圳華大基因)，siRNA序列及NC對照序列(上海吉瑪生物科技有限公司)，Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑(美國Invitrogen公司)，多聚甲醛、乙醇(北京索萊寶科技有限公司)，鹽酸阿霉素(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，Mito-Tracker、Phalloidin(上海翊圣生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1獲取小鼠組織 乙醚氣霧麻醉小鼠后，斷頸處死，用手術(shù)剪剪開小鼠腹腔，依次取出腎、肝、脾、肺和心臟組織，于-80℃超低溫冰箱中保存。

1.2.2原代心肌細胞培養(yǎng) 將乳鼠解剖取出心臟，PBS緩沖液中洗滌至無血污，將心臟切碎并與含有胰酶和膠原酶的消化工作液混合，在37 ℃恒溫水浴鍋中消化5～6 min，收集每次消化后的上清液，剩余組織加入消化液繼續(xù)消化，直至組織塊被完全消化；將收集到的上清液以800～1 000 r/min離心5 min，留沉淀懸浮于DMEM-F12完全培養(yǎng)基中，再次離心去上清液，剩余沉淀懸浮于DMEM-F12完全培養(yǎng)基中，通過250目過濾網(wǎng)過濾到培養(yǎng)皿中，在37 ℃細胞培養(yǎng)箱中差速貼壁培養(yǎng)1 h，最后接種于細胞培養(yǎng)皿中。

1.2.3細胞轉(zhuǎn)染 當(dāng)原代心肌細胞生長到融合度60%～70%時可進行轉(zhuǎn)染。將agomir-piR-514加入到100 μL無血清的DMEM-F12培養(yǎng)基中混勻，室溫放置3～5 min；將5 μL lipofectamin 3000加入95 μL無血清的DMEM-F12中混勻，室溫放置3～5 min；上述二者混合均勻，室溫靜置20～25 min后加入到細胞培養(yǎng)皿中。agomir-piR-514序列為5′-AAUCAGAUGCACCUCAUCUGGUGA-3′，以化學(xué)修飾的寡聚脫氧核苷酸agomir-NC為陰性對照，序列為5′-CAGUACUUUGUGUAGUACAA-3′。

1.2.4實時定量PCR(qPCR)檢測小鼠組織和心肌細胞中piRNA-514、心房肽(ANF)、腦利鈉肽(BNP)和β-肌球蛋白重鏈(β-MHC)的相對表達量采用Trizol試劑提取小鼠組織RNA和原代心肌細胞總RNA，測定RNA濃度及純度，進行PCR反轉(zhuǎn)錄和qPCR實驗，模板cDNA使用Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒構(gòu)建，qPCR體系采用Takara試劑盒構(gòu)建。qPCR定量結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化，piRNA-514相對表達量以U6為對照，ANF、BNP和β-MHC的相對表達量以GAPDH值為對照。引物序列見表1。

表1 qPCR引物序列

1.2.5測定細胞表面積 將轉(zhuǎn)染或加藥處理后的原代心肌細胞加入多聚甲醛固定5 min，PBS緩沖液洗滌，丙酮脫水3 min，洗滌后用Triton X-100室溫處理20 min，PBS洗滌，加入Phalloidin-TRITC在37 ℃下避光染色45 min，PBS緩沖液洗滌，最后用含DAPI的封片劑進行染色，在激光共聚焦顯微鏡(Leica TCS SP8，德國)下觀察并拍攝細胞熒光照片，用Image J軟件測定細胞表面積并做定量分析。

2 結(jié) 果

2.1 ISO對小鼠部分組織及心肌細胞piRNA-514表達的調(diào)控作用

qPCR檢測顯示，在小鼠的腎、肝、脾、肺以及心臟中piRNA-514的相對表達量分別為1.00±0.02、1.80±0.02、2.08±0.05、10.12±0.01、19.37±0.01，piRNA-514在心臟中的表達量為最高(F=24.47,P<0.01)；qPCR方法檢測結(jié)果顯示，ISO誘導(dǎo)原代心肌細胞0、8、12和24 h時，piRNA-514相對表達量逐漸降低，分別為1.00±0.01、0.80±0.02、0.65±0.01、0.32±0.05(F=12.26，P<0.01)，ANF相對表達量逐漸升高，分別為1.00±0.01、1.42±0.05、1.98±0.02、2.02±0.05(F=4.49，P<0.01)。

2.2 過表達piRNA-514對心肌細胞肥大抑制作用

qPCR檢測顯示，對照組、ISO組、轉(zhuǎn)染agomir-piR-514組、agomir-NC組心肌細胞piRNA-514的相對表達量分別為1.00±0.01、1.42±0.02、1.98±0.05、1.32±0.01，BNP的相對表達量分別為1.00±0.01、2.12±0.05、1.28±0.02、1.12±0.01，ANF的相對表達量分別為1.00±0.01、2.42±0.01、1.48±0.01、1.12±0.05，對照組和轉(zhuǎn)染agomir-piR-514組間以上指標(biāo)比較差異具有顯著性(F=7.91～14.25，t=14.84～29.43，P<0.05)；Image J軟件計算得出各組細胞表面積分別為100±4、187±4、118±2、102±5，對照組和轉(zhuǎn)染agomir-piR-514組間細胞表面積比較差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(F=36.12，t=8.73，P<0.05)。

2.3 過表達piRNA-514對ISO誘導(dǎo)的心肌細胞肥大的抑制作用

qPCR檢測結(jié)果顯示，對照組、ISO組、agomir-piR-514+ISO組、agomir-NC+ISO組心肌細胞中piRNA-514的相對表達量分別為1.00±0.01、0.62±0.01、0.98±0.02、0.66±0.01，ANF的相對表達量分別為1.00±0.01、2.62±0.04、1.28±0.02、2.75±0.01，β-MHC的相對表達量分別為1.00±0.01、2.49±0.01、1.16±0.01、2.51±0.05，ISO組和agomir-piR-514+ISO組間以上指標(biāo)比較差異具有顯著性(F=10.89～21.57，t=6.94～12.96，P<0.05)；計算得出各組的細胞表面積分別為100±5、192±4、118±2、172±5，ISO組和agomir-piR-514+ISO組間細胞表面積比較差異具有顯著性(F=23.82，t=16.41，P<0.05)。激光共聚焦顯微鏡圖像顯示，與ISO組相比，agomir-piR-514+ISO組的心肌細胞面積減小，肌節(jié)組織也減少。見圖1。

A:對照組;B:ISO組;C:agomir-piR-514+ISO;D:agomir-NC+ISO組

3 討 論

心肌肥厚是健康心臟對增加生物力學(xué)應(yīng)力的外在和內(nèi)部刺激做出的應(yīng)激反應(yīng)[9]，主要特征是心肌細胞體積增大[10-12]。持續(xù)性心肌肥厚會導(dǎo)致心力衰竭，甚至猝死[12]，因此針對心肌肥厚的分子機制進行研究以尋找新的治療靶點具有重要的意義。

ANF是一種由心房分泌的循環(huán)肽，能夠在心肌肥厚的發(fā)生階段被激活[13-16]；BNP是利鈉肽系統(tǒng)的組成部分，常作為代償性心力衰竭和心肌肥厚患者的預(yù)后標(biāo)志物[17]；心臟中β-MHC的表達變化會改變心肌功能，抑制β-MHC的表達能夠預(yù)防ISO引起的心肌肥厚[18-19]。因此臨床上常采用以上指標(biāo)作為心肌肥厚標(biāo)記物，通過檢測它們的表達水平來探討心肌肥厚的發(fā)生機制。

piRNA是一類新型的非編碼RNA[20]，通常與piwi蛋白相互作用形成RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物[21]，這些復(fù)合體通過沉默轉(zhuǎn)座因子在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平上對細胞基因的調(diào)控發(fā)揮著關(guān)鍵作用[22]。轉(zhuǎn)座因子通過加速基因組序列的易位、外顯子的改組和雙鏈斷裂的修復(fù)來促進進化，從而在生物基因組序列中發(fā)揮作用[23-24]。另外反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在糖尿病、腫瘤和其他疾病中也有重要作用[25]，piRNA的發(fā)現(xiàn)改變了我們對轉(zhuǎn)座子等基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的認(rèn)知。

piRNA可以在生殖細胞、腦細胞、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和各種體細胞中表達[26-27]，但是關(guān)于其在心血管疾病方面的的研究甚少。研究證明piRNA能夠存在于心臟系統(tǒng)中，并且在心臟發(fā)育過程中表達量會發(fā)生改變，因此推測piRNA在心臟中具有調(diào)控作用，或許與心血管疾病如心肌肥厚也存在一定關(guān)聯(lián)。

本研究通過預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)，在ISO誘導(dǎo)的肥大心肌細胞中，有多個顯著差異表達的piRNA，但只有piRNA-514異常程度最高，并且在小鼠不同組織器官檢測發(fā)現(xiàn)piRNA-514在心臟中的表達峰度最高，進一步證明了piRNA-514與心肌細胞具有一定的聯(lián)系，所以篩選出piRNA-514作為此次研究對象。本研究采用ISO誘導(dǎo)原代心肌細胞，實驗結(jié)果表明隨著誘導(dǎo)時間的延長，心肌細胞中piRNA-514表達量降低，ANF表達量升高，證明ISO可抑制piRNA-514的表達上調(diào)，并且ISO誘導(dǎo)24 h時心肌細胞肥大效果最佳。

同時本研究將能夠升高piRNA-514表達水平的agomir-piR-514轉(zhuǎn)染進原代心肌細胞，檢測心肌肥厚標(biāo)記物ANF和BNP的表達變化以及心肌細胞表面積，結(jié)果顯示，與對照組相比，轉(zhuǎn)染agomir-piR-514組心肌細胞ANF和BNP的表達量降低，細胞表面積減小，證明piRNA-514能夠抑制心肌細胞發(fā)生肥大。另外在ISO誘導(dǎo)24 h后的體外心肌細胞肥大模型中，將agomir-piR-514轉(zhuǎn)染進心肌細胞，檢測ANF以及β-MHC的相對表達量，觀察心肌細胞形態(tài)的變化以及測定細胞表面積，結(jié)果顯示升高piRNA-514表達水平以后，與ISO組相比，agomir-piR-514+ISO組心肌細胞ANF和β-MHC的表達量明顯降低，細胞體積和表面積也相應(yīng)減小，證明了過表達piRNA-514可以抑制ISO誘導(dǎo)的心肌細胞肥大。

本實驗證明了piRNA-514具有調(diào)控心肌細胞肥大的功能，過表達piRNA-514能夠抑制ISO誘導(dǎo)的心肌細胞肥大，但是有關(guān)心肌肥厚的分子機制尚未研究清楚。有多種生物因子與心肌肥厚的發(fā)生過程緊密相關(guān)，例如MITF和Foxo3a是常見的轉(zhuǎn)錄因子，某些miRNA可能是它們在心肌肥厚發(fā)生途徑中的下游因子[28]。另外，還有多種信號通路參與調(diào)控心肌肥厚的發(fā)生，如常見的Akt和ERK1/2信號通路、MAPK通路以及PI3K介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑等[29]。我們下一步將通過轉(zhuǎn)錄組測序?qū)嶒灒瑢ふ襭iRNA-514的下游靶點，找出piRNA-514與靶向因子共同調(diào)控心肌細胞肥大的信號通路，為將來的臨床應(yīng)用提供較好的參考依據(jù)。