張娜，趙良友，劉永武，王宇，安柏松，劉樹民*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學藥物安全性評價中心，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥研究院，黑龍江 哈爾濱 150040)

馬錢子，為馬錢科植物馬錢(Strychnosnux-vomicaL.)的干燥成熟種子，味苦，性寒，有大毒，具有通絡(luò)止痛，散結(jié)消腫的功效，治療風濕頑痹、麻木癱瘓、疽癰腫痛療效非常顯著[1]。張錫純謂馬錢子“能潤動神經(jīng)，使之靈活”，表明馬錢子對神經(jīng)肌肉疾病有獨特的藥效作用，盡管馬錢子臨床療效確切，但近年來對馬錢子毒性的病例報道也屢見不鮮，尤其是馬錢子堿致腎衰竭的臨床報道居多，影響馬錢子及其復方的臨床安全使用及國際準入?！爱愵愊嘀啤崩碚撌侵赣卸局兴幣c不同性味、不同功效藥物的合理配伍，以調(diào)其偏性、制其毒性、起到全面兼顧病情、增強藥效、減輕或消除毒性的作用[2]。近年來代謝組學技術(shù)成為研究中藥毒性成分很好的工具，它能夠通過定量表征生物體內(nèi)源性小分子的動態(tài)變化從整體角度評價生物體產(chǎn)生的毒性變化，預測毒性產(chǎn)生，尋找毒性相關(guān)的生物標志物，從整體角度闡明中藥毒性機制作用以及復方配伍減毒可能干預的代謝通路[3-4]。

基于中醫(yī)理論健脾通絡(luò)理論和的臨床經(jīng)驗“治痿獨取陽明”的思想[5-8]，以大劑量黃芪與馬錢子、地龍配伍組成健脾通絡(luò)復方，三者配比(24:2:1)，三藥配伍治“痿證”，具有行補而不滯邪，通而不傷正之功。采用血液生化檢測馬錢子與其復方血液中有關(guān)腎臟損傷的金指標肌酐(CREA)和尿素氮(UREA)[9]，通過HE染色觀察腎組織病變程度，代謝組學技術(shù)獲取血清差異代謝產(chǎn)物，尋找內(nèi)源性腎毒性生物標志物，探討“異類相制”理論指導下對含有馬錢子中藥復方配伍減毒的物質(zhì)基礎(chǔ)，闡明配伍減毒的效應(yīng)機制。

課題組前期考察了馬錢子不同炮制方法的量效關(guān)系和毒性關(guān)系，確定了油炸馬錢子LD50值為192.05 mg/kg[10]，藥典中馬錢子成人每日最大用量為0.6 g，是臨床指導的22倍，而士的寧是馬錢子中最主要的毒性成分，測定制馬錢子中士的寧含量為1.6%，加入適量淀粉，配研，制成含有士的寧含量為0.8%的馬錢子調(diào)和粉，以下實驗均采用馬錢子調(diào)和粉。

1 材料

1.1 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠，體質(zhì)量(200±20)g，購于黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物中心，許可證號：SCXK(黑)2018-007。飼養(yǎng)地點：黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物中心屏障系統(tǒng)實驗室。飼養(yǎng)條件：12 h光照、12 h避光循環(huán)飼養(yǎng)，室內(nèi)溫度為(22±1)℃，相對濕度為40%～50%，飼喂標準飼料、飲用水。

1.2 藥物與試劑

中藥飲片制馬錢子、地龍、黃芪(均購于黑龍江雪靈峰中藥飲片有限公司，批號：D8030101、180301、181201)；馬錢子堿、士的寧混合對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：112030-201601)；色譜級乙腈(美國Thermo Fisher科技公司)；色譜級甲酸(美國Dikma科技公司)；亮氨酸腦啡肽(美國Sigma-Aldrich公司)；微晶尿酸鈉結(jié)晶(monosodium urate crystal，MSU,美國Sigma-Aldrich公司)；蒸餾水(屈臣氏)。

馬錢子粉制備：稱取制馬錢子粉6.4 g，加0.3%CMC水溶液至500 mL，制成馬錢子生藥的質(zhì)量濃度為12.8 mg/mL，呈混懸液，置于4℃冰箱。

健脾通絡(luò)方實驗室制備：稱取黃芪768 g加水4 L，提取2次，每次2 h，合并2次提取液，過濾，濃縮至400 mL。稱取制馬錢子粉6.4 g，地龍粉3.2 g，與黃芪水煎液混合定容至500 mL，制成健脾通絡(luò)方(方中馬錢子質(zhì)量濃度為12.8 mg/mL，黃芪：馬錢子：地龍=24∶2∶1)，置于4 ℃冰箱，保存在藥物安評價中心，編號：20180601。

1.3 儀器

QI軟件(Waters3.0)；超高液相色譜-飛行時間-質(zhì)譜(UPLC-TOF-MS)儀(美國Waters公司)；KDC-160HR高速冷凍離心機(科大創(chuàng)新有限公司中佳分公司)；MassLynx V4.1工作站(美國Waters公司)；電子天平AB265-S電子分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)； SIM-F124制冰機(日本三洋公司)；BX41TF光學顯微鏡(OLYMPUS)；LKB-8800超薄切片機(瑞典)；超純水儀(美國Millipore公司)；超凈工作臺(中國上海精密儀器儀表公司)；高壓滅菌器(德國BMT有限公司)；羅氏COBAS c311生化分析儀。

2 方法

2.1 分組及給藥

將SD大鼠30只，隨機分為空白對照組( control group)、馬錢子組(Strychnos group)和健脾通絡(luò)復方組(Formulation group)，每組10只。給藥體積為10 mL/kg體質(zhì)量，馬錢子組給藥量為128 mg/kg體質(zhì)量，含有士的寧量為1.02 mg/kg，相當于LD50值的1/3，相當于藥典中臨床指導用量7倍；健脾通絡(luò)復方組給藥量為1 728 mg/kg體質(zhì)量，給藥周期1次/d，連續(xù)30 d，每周稱體質(zhì)量，重新?lián)Q算給藥量。對照組給予0.3%CMC水溶液。

2.2 血清樣本的收集與制備

末次給藥24 h后，將大鼠麻醉，腹主動脈取血，將取出的血液常溫下靜置30 min，4 ℃，13 000 r/min離心10 min，取上清液，一部分做生化指標檢測，一部分凍存-80 ℃冰箱中做代謝組學備用。

采用速率A法測定血清中UREA的含量，采用兩點終點法測定血清中CREA的含量。

2.3 組織病理學檢查

動物以3%戊巴比妥鈉麻醉安樂死后，將腎臟置于10%中性福爾馬林固定液固定，充分固定的組織制片后進行HE染色，光學顯微鏡檢查，記錄病變。

2.4 代謝組學樣本分析方法的建立

2.4.1 UPLC條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)，進樣量：3 μL，流速：0.4 mL/min，流動相：0.1%甲酸乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B)，洗脫梯度：1%～10%A(0～2.5 min)；10%～40%A(2.5～3.5 min)；40%～70%A(3.5～11 min)；70%～80%A(11～12 min)；80%～100%A(12～13 min)，柱溫40 ℃。

2.4.2 MS條件

電噴霧離子源(ESI)，采用正、負離子模式下檢測，Lock Mass采用全掃描方式，質(zhì)量掃描范圍為質(zhì)荷比m/z100～1 500，噴霧頻率為10 s，采用美國Waters公司LockSprayTM校正系統(tǒng)進行在線質(zhì)量校正。亮氨酸腦啡肽準分子離子峰[M+H]+556.277 1及[M-H]-554.261 5，鎖定質(zhì)量濃度為1 ng/mL，體積流量為30 μL/min。檢測條件詳見表1。

2.4.3 多元數(shù)據(jù)分析

通過UPLC-TOF-MS技術(shù)對所得離子產(chǎn)生的質(zhì)譜峰進行分析，制得總離子流色譜圖并同時開展對離子峰的提取、對齊和匹配，將數(shù)據(jù)導入Progenesis QI并聯(lián)合使用Marker Lynx XS軟件進行分析，即可確定數(shù)據(jù)中代謝物的分子質(zhì)量。將所獲得數(shù)據(jù)篩選內(nèi)源性成分后進入Ezinfo 2.0軟件處理分析，將原始數(shù)據(jù)可視化處理，對大鼠血清中代謝物組進行無監(jiān)督的主成分分析(PCA)來檢查異常值和分類趨勢，并且繪制Scores plot圖，以反應(yīng)組間離散度情況，同時對獲得的復雜多維數(shù)據(jù)進行降維處理，其中每個點代表準確的保留時間，X軸代表變量，距離原點越遠的數(shù)據(jù)的相對貢獻度越大，探討各自組內(nèi)的代謝物軌跡相似度情況及是否呈現(xiàn)聚類效應(yīng)。結(jié)合各組間各離子點量的變化趨勢，在S-plot圖中選擇潛在的生物標志物，采用變量投射重要性(VIP)>4的離子作為投射篩選條件，且t檢驗P<0.05的變量作為顯著差異物質(zhì)的候選變量，找出重要性生物標志物，結(jié)合軟件中代謝物數(shù)據(jù)庫檢索、人類代謝組學數(shù)據(jù)庫(HMDB)和京都基因與基因組百科全書數(shù)據(jù)庫(KEGG)，最終鑒定出代謝產(chǎn)物及相關(guān)代謝通路。

表1 質(zhì)譜檢測條件

3 結(jié)果

3.1 外觀行為學觀察

空白對照組大鼠給藥期間外觀無異常，背毛有光澤，口鼻干凈無分泌物；飲食、水正常體質(zhì)量呈增加趨勢；馬錢子組大鼠給藥中期有震顫、流涎、煩躁等癥狀，后期出現(xiàn)活動較少等癥狀，飲食、水減少，體質(zhì)量呈平穩(wěn)趨勢略有增加；健脾通絡(luò)復方組給藥中期有脫毛、稀便、活動減少等現(xiàn)象，給藥后期恢復正常，飲食、水減少，懷疑是由給藥量過大，導致大鼠食欲減少，體質(zhì)量呈平穩(wěn)增長趨勢(見圖1)。

圖1 大鼠體質(zhì)量趨勢圖

3.2 生化指標檢測

大鼠給藥90 d時，馬錢子組大鼠血清中CREA和UREA水平與空白組對照比較都有極顯著性升高(P<0.01)；健脾通絡(luò)復方組大鼠血清中CREA水平與空白對照組比較有顯著性升高(P<0.05)，與馬錢子組比較有顯著性降低(P<0.05)；UREA水平與空白對照組比較無顯著性差異，與馬錢子組比較有極顯著性降低(P<0.01)(見圖2,表2)。

注：與對照組比較,*P<0.05,**P<0.01;與馬錢子組比較,#P<0.05,##P<0.01圖2 大鼠血清中CREA(A)和UREA(B)表達水平

表2 大鼠血清中CREA 和UREA表達水平

3.3 組織病理學檢測

腎臟經(jīng)HE染色鏡下觀察可以發(fā)現(xiàn)：馬錢子組大鼠腎臟組織部分腎小管腫脹管腔變窄(見圖3A)、上皮細胞細胞核腫脹(見圖3B)、明顯的腎小管上皮變性萎縮(見圖3C)、皮髓交界處伴有纖維增生(見圖3D)，并伴有炎性細胞浸潤(見圖3B)和管型(見圖3E)等組織病理學變化；與馬錢子組相比，健脾通絡(luò)復方組大鼠腎臟在腎小管上皮變性(見圖3H)、上皮細胞細胞核腫脹(見圖3F)、腎小管腫脹(見圖3G)、炎性細胞浸潤等組織病理學變化程度較輕，未見管型；空白對照組大鼠腎臟腎小球大小無明顯變化，腎臟腎小球毛細血管未出現(xiàn)擴張充血，上皮細胞未觀察到萎縮、腫脹、變性或脫落，腎小管內(nèi)無紅細胞、白細胞以及管型，腎臟組織未見明顯異常(見圖3 I)。

注：A、B、C、D、E為馬錢子組；F、G、H為健脾通絡(luò)復方組；I為空白對照組圖3 大鼠腎臟組織病理切片HE染色(×400)

3.4 大鼠血清代謝輪廓分析

為了闡明健脾通絡(luò)方中黃芪、地龍對馬錢子的貢獻，通過對UPLC-TOF-MS產(chǎn)生的數(shù)據(jù)進行分析，應(yīng)用非監(jiān)督性3D-PCA和多維與降維的處理，以此比較馬錢子組、健脾通絡(luò)復方組與空白組三組樣本點之間大鼠血清代謝輪廓狀態(tài)。結(jié)果表明馬錢子組與空白對照組可以完全區(qū)分開，說明馬錢子組大鼠機體生理及物質(zhì)代謝狀況已經(jīng)發(fā)生了明顯的改變，而健脾通絡(luò)復方組向空白組接近，表明由馬錢子產(chǎn)生的偏離得到了明顯的改善。模型的得分圖見圖4。

3.5 差異代謝物篩選和鑒定

通過VIP-plot結(jié)合S-plot參數(shù)獲取差異變量，篩選VIP>4的差異變量，且t檢驗P<0.05的差異變量才被認為是潛在的差異性生物標志物，見圖5。獲取差異變量，共篩選出9個對影響馬錢子配伍減毒貢獻大的潛在生物標志物(見表2)，熱圖(圖6)展示了這9個差異代謝物在馬錢子組和健脾通絡(luò)組的變化規(guī)律，喹啉酸(Quinolinic acid)、L-脯氨酸(L-Proline)、肌酸酐(creatinine)、吲哚乙酸(indoleacetic acid)、胍基丁二酸(Guanidinosuccinic Acid)、同型半胱氨酸(Homocysteine)呈上調(diào)趨勢，L-精氨酸(L-Arginine)、檸檬酸(Citric acid)、牛磺酸(Taurine)呈下調(diào)趨勢。

圖4 馬錢子組和空白對照組正(A)、負離子(B)模型，三組之間正(A)、負離子(B)模型的3D-PCA圖

注：A、B正離子模式；C、D負離子模式圖5 VIP得分圖(A、C)；S-plot圖(B、D)

表2 血清代謝組學結(jié)果

注：豎列:樣品;橫排:代謝物,顏色越深代表代謝物表達量越高，反之則越低;M為馬錢子組;Z為健脾通絡(luò)復方組圖6 血清樣品可視化熱圖

3.6 血清中潛在生物標志物的通路分析

將被篩選出來的生物標志物進行富集，以此作為馬錢子配伍減毒的大鼠血清代謝組學中標志性生物標志物，通過通路分析來尋找相關(guān)的代謝途徑。潛在代謝通路的臨界值大于0.10，結(jié)果顯示出10個代謝通路(見表3和圖7)。關(guān)鍵代謝途徑主要富集于?；撬岷痛闻；撬岽x(Taurine and hypotaurine metabolism)、精氨酸和脯氨酸代謝(Arginine and proline metabolism)、精氨酸生物合成(Arginine biosynthesis)、三羧酸循環(huán)(TCA cycle)、色氨酸代謝(Tryptophan metabolism)。在健脾通絡(luò)復方給藥干預后，代謝通路紊亂的現(xiàn)象明顯改善，代謝產(chǎn)物的含量出現(xiàn)回調(diào)趨勢，在代謝通路的水平上，顯示出馬錢子配伍后對大鼠腎毒性有明顯的減輕作用。

注：1代表?；撬岷痛闻；撬岽x;2代表精氨酸和脯氨酸代謝;3代表精氨酸生物合成;4代表三羧酸循環(huán);5代表色氨酸代謝圖7 代謝通路對減毒影響分析

表3 代謝通路對減毒的影響

4 結(jié)果與討論

血液的生化指標肌酐(CREA)和尿素氮(UREA)被認為是傳統(tǒng)的腎功能損傷標志物，CREA是人體肌肉中代謝產(chǎn)物，在外源性攝入量與體內(nèi)生成量基本恒定的前提下，血清CREA濃度主要取決于腎小球濾過功能，當腎功能受到損傷時，血清肌酐濃度由于蓄積會迅速上升；UREA也是評價腎功能的主要指標，各種腎實質(zhì)性病變均可使血清中UREA增高。其作為血清生化指標在臨床診斷中被廣泛應(yīng)用，但當生化指標出現(xiàn)改變時，往往已經(jīng)造成了器質(zhì)性病變[9]，當腎臟受損傷時，生物合成和分解代謝之間平衡已被破壞，積極評估早于臨床生化指標變化的內(nèi)源性敏感腎毒性生物標志物更為重要。本文基于血清生化、組織病理學結(jié)合血清代謝組學，從整體和微觀角度描述了馬錢子復方配伍前后大鼠血清代謝輪廓的變化及腎臟組織之間的病理狀態(tài)，闡明馬錢子腎毒性的機制作用以及健脾通絡(luò)方配伍減毒可能干預的代謝通路。在血清代謝組學研究中，各組3D-PCA圖結(jié)果顯示，對照組和馬錢子組呈不同聚類，而健脾通絡(luò)方組能夠使代謝軌跡從馬錢子組向?qū)φ战M轉(zhuǎn)移，提示了健脾通絡(luò)方配伍減毒的作用，通過VIP-plot結(jié)合S-plot參數(shù)獲取差異變量，鑒別出9個對影響馬錢子配伍減腎毒貢獻大的潛在生物標志物主要參與?；撬岷痛闻；撬岽x、精氨酸和脯氨酸代謝、精氨酸生物合成、三羧酸循環(huán)、色氨酸代謝。

?；撬?taurine)是半胱氨酸的代謝產(chǎn)物，在細胞質(zhì)中由黃丙氨酸在谷氨酸脫羧酶1和半胱氨酸亞磺酸脫羧酶作用下脫去二氧化碳轉(zhuǎn)化形成，次?；撬?hypotaurine)是?；撬岬闹苯忧绑w。?；撬崾莾?nèi)源性抗氧化劑，具有抗氧化、抗炎和免疫調(diào)節(jié)等廣泛生物效應(yīng)，可提高氧化酶活性，改善腎組織氧化損傷程度[11]。代謝通路富集分析發(fā)現(xiàn)?；撬崤c次?；撬岽x是馬錢子引起腎損傷最重要的代謝通路之一(見圖6、7)，有研究表明?；撬岷痛闻；撬岽x可以對T2DM模型引起的腎損傷有保護作用[12]。馬錢子組大鼠血清中?；撬岷砍氏陆第厔?，引起明顯的腎功能損傷，血清生化檢測和腎臟組織病變相互佐證，推測健脾通絡(luò)復方通過?；撬岷痛闻；撬岽x途徑調(diào)節(jié)脂質(zhì)過氧化改善氧化損傷，有效抑制馬錢子引起的腎毒性。

L-脯氨酸(L-Proline)參與谷氨酸的合成，是一種潛在的內(nèi)源性神經(jīng)毒素，可對神經(jīng)細胞和組織造成損害。L-精氨酸(L-Arginine)是一種半必需氨基酸，但在某些病理狀態(tài)下則為必需氨基酸，是mTOR的誘導劑，通過mTOR途徑誘導蛋白合成，很多分解代謝性疾病如損傷、癌癥等都會導致精氨酸耗竭[13]。其代謝產(chǎn)物為多胺、一氧化氮(NO)和氧化氮，研究表明NO具有廣泛的生化活性，可消除活性氧自由基，改善組織微循環(huán)；通過精氨酸酶-1將精氨酸分解為聚胺，參與合成和穩(wěn)定細胞外基質(zhì)[14]；本實驗證明馬錢子組大鼠血清中L-脯氨酸升高、L-精氨酸濃度降低，這與該組大鼠癥狀觀察體現(xiàn)的抽搐、煩躁、活動減少等神經(jīng)毒性癥狀相呼應(yīng)。另外，肌酸酐(creatinine)由血清轉(zhuǎn)移到腎臟，通過腎小球濾過和腎小管排泄排出體外，通常被作為腎功能損傷評價指標[15]。

檸檬酸(Citric acid)參與三羧酸(TCA)循環(huán)，是機體獲得能量的主要方式之一，常在線粒體中進行[16]，受線粒體功能及體內(nèi)能量產(chǎn)生、利用的影響，TCA循環(huán)作為物質(zhì)和能量代謝的總樞紐，是三大營養(yǎng)素的最終代謝通路。然而TCA 循環(huán)需要丙酮酸的參與，當TCA循環(huán)受到抑制，使得丙酮酸積累導致α-酮戊二酸脫氫酶系統(tǒng)活性增強，促進活性氧(ROS)產(chǎn)生，使氧化應(yīng)激反應(yīng)增加，從而產(chǎn)生炎癥反應(yīng)[17]。有研究證明TCA循環(huán)異?？梢詫е戮€粒體功能失調(diào)，從而導致腎臟組織損傷[18]。本實驗血清代謝組學顯示，馬錢子組中檸檬酸含量呈下降趨勢，推測健脾通絡(luò)復方可能通改善三羧酸循環(huán)，抑制線粒體、細胞凋亡，改善腎功能損傷。

吲哚乙酸(indoleacetic acid,IAA)是色氨酸代謝的分解產(chǎn)物，色氨酸能夠減少應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。色氨酸代謝的主要方式是犬尿酸原代謝途徑，該途徑可以產(chǎn)生乙酰輔酶A，其是TCA循環(huán)的起始底物，可以進入TCA循環(huán)進行徹底氧化供能，有研究表明黃芪可以顯著降低大鼠吲哚乙酸的含量，使乙酰輔酶A產(chǎn)量正常，可以有效調(diào)節(jié)能量代謝紊亂情況[19]。本實驗發(fā)現(xiàn)馬錢子組大鼠血清吲哚乙酸含量明顯升高，健脾通絡(luò)復方干預后可以逆轉(zhuǎn)此趨勢。推測黃芪配伍馬錢子可以通過調(diào)節(jié)色氨酸代謝途徑，減少氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)從而改善腎損傷，這與色氨酸的另一個代謝產(chǎn)物喹啉酸(Quinolinic acid)生物效應(yīng)一致，喹啉酸常被激活的巨噬細胞釋放，作為內(nèi)源性腦興奮毒素[20]。健脾通絡(luò)復方中馬錢子通過配伍黃芪調(diào)節(jié)精氨酸生物合成與色氨酸代謝，抑制巨噬細胞產(chǎn)生內(nèi)源性興奮毒素，提高抗氧化能力，減少氧化應(yīng)激從而制約馬錢子毒性。

胍基丁二酸(Guanidinosuccinic Acid,GSA)是由尿素水平升高刺激精氨酸琥珀酸(ASA)被自由基氧化產(chǎn)生的，它和IAA被認為是尿毒癥毒素[21]，在此代謝過程中還會導致同型半胱氨酸(Homocysteine,Hcy)的積累，Hcy是由蛋氨酸去甲基化形成的，腎臟組織中含有豐富的甲基化酶，當發(fā)生腎損傷時，甲基化酶的缺失會導致Hcy的甲基化減速引起Hcy水平升高，進而造成腎功能惡化，所以Hcy常被看作腎功能標志物[22-23]。

本實驗采用代謝組學技術(shù)結(jié)合血清生化和組織病理學手段，從整體微觀角度描述了馬錢子復方配伍前后機體變化，提示健脾通絡(luò)方配伍減毒的作用。代謝通路結(jié)果提示，馬錢子主要影響了機體的氨基酸代謝、能量代謝以及線粒體功能障礙，而健脾通絡(luò)復方則能逆轉(zhuǎn)這些異常發(fā)揮配伍減毒的作用，從而揭示了“異類相制”的科學內(nèi)涵。