BVT-14225通過抑制11β-羥基類固醇脫氫酶1還原活性促進神經(jīng)干細胞增殖和遷移

馬君梅，南海函，胡志妍，陳依爾，崔燕華，陳星馳，李 莉，蘇 穎，梅虹霞，繆項慧，張旭彤，林 函，

〔1.溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院、育英兒童醫(yī)院麻醉與圍術期醫(yī)學科，浙江 溫州 325027；2.溫州醫(yī)科大學檢驗醫(yī)學院（生命科學學院），浙江 溫州 325035；3.浙江省麻醉學重點實驗室，浙江 溫州 325035；4.溫州市人民醫(yī)院，浙江 溫州 325000〕

神經(jīng)干細胞（neural stem cells，NSC）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的多能性細胞，具有不斷自我更新的增殖能力，向神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞的分化能力及向特定腦區(qū)的遷移能力[1]，對于保持中樞神經(jīng)系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)和正常腦組織的發(fā)育具有重要的作用[2-3]。STROEMER等[4]研究表明，向卒中大鼠同側殼核植入NSC，可顯著改善大鼠的感覺運動功能和NSC的分化能力；同時，NSC替代治療策略已進入臨床試驗。KALLADKA等[5]研究表明，向缺血性卒中患者同側殼核注射NSC 2年后，患者的腦成像以及卒中評分較2年前均表現(xiàn)出顯著的改善和提高。當中樞神經(jīng)系統(tǒng)受到損傷時，促進NSC的發(fā)育對保持認知功能和修復受損的腦細胞起著至關重要的作用[6]。

糖皮質(zhì)激素作為重要的應激激素，在孕婦、胎兒及嬰幼兒手術的圍術期顯著增高；在慢性社會應激的情況下也會升高。而高濃度的糖皮質(zhì)激素對中樞神經(jīng)系統(tǒng)，特別是NSC的發(fā)育也會產(chǎn)生不良影響。SUNDBERG等[7]研究表明，在體外培養(yǎng)的NSC中，活性糖皮質(zhì)激素（皮質(zhì)酮）可顯著抑制NSC的增殖，從而影響神經(jīng)發(fā)育。LEMAIRE等[8]通過建立胎鼠應激模型的研究表明，在Morris水迷宮實驗的空間學習任務中，應激SD大鼠的潛伏期和軌跡總距離在獲得性訓練時均顯著延長。TIAN等[9]研究表明，手術應激參與了糖皮質(zhì)激素受體（glucocorticoid receptor，GR）的早期激活；且GR拮抗劑可緩解手術應激引起的認知功能障礙。所以，我們提出科研假設：這種認知障礙或神經(jīng)損傷可能與圍術期應激導致糖皮質(zhì)激素分泌增加而造成的神經(jīng)發(fā)育毒性有關，降低圍術期應激水平可能有助于緩解糖皮質(zhì)激素對NSC的損害，從而達到神經(jīng)保護的作用。

11β-羥基類固醇脫氫酶1（11β-hydroxysteroid dehydrogenase type 1，11β-HSD1），是糖皮質(zhì)激素的代謝酶，可催化非活性的可的松〔在嚙齒動物為 11-脫氫皮質(zhì)酮（11-dehydrocorticosterone，DHC）〕和活性的氫化可的松〔即皮質(zhì)醇，在嚙齒類動物為皮質(zhì)酮（corticosterone，CORT）〕的相互轉化[10-12]，從而維持局部組織活性糖皮質(zhì)激素濃度的穩(wěn)定。機體局部活性糖皮質(zhì)激素的濃度受到11β-HSD1 活性的影響，BVT-14225（BVT）是11β-HSD1的特異性抑制劑。但NSC上是否存在11β-HSD1，其是否可對NSC發(fā)育產(chǎn)生影響，目前未見報道。為此本研究就BVT對NSC發(fā)育的影響及其機制進行研究，旨在闡明BVT是否通過調(diào)節(jié)11β-HSD1活性對圍術期的NSC起到保護作用，為將來藥物開發(fā)提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑和儀器

CORT，美國陶素生化公司；DHC，美國Steroids公司；BVT，美國MCE公司；DMEM、DMEM/F12（1∶1）、B27 supplement、N-2 supplement和accutase消化酶，美國Gibco公司；堿性成纖維生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）和 表 皮生長因子（epidermal growth factor，EGF），美國Peprotech公司；CytoTox96?非放射性細胞毒性試劑盒，美國Promega公司；DMSO，美國Sigma公司；基質(zhì)膠，美國BD公司；Click-iT?EdUAlexa Fluor488高通道顯像試劑盒和Trizol試劑盒，美國Invitrogen公司；小鼠抗大鼠巢蛋白單克隆抗體、兔抗人性別決定基因相關轉錄因子-2〔SRY（sex determining region Y）-box transcription factor-2，Sox2〕多克隆抗體、山羊抗人膠質(zhì)細胞原纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）多克隆抗體、小鼠抗人神經(jīng)元核抗原（neuronal nuclei，NeuN）單克隆抗體、兔抗人11β-HSD1單克隆抗體、熒光基團488標記的驢抗兔IgG多克隆抗體、熒光基團488標記的驢抗山羊IgG多克隆抗體和熒光基團594標記的驢抗小鼠IgG多克隆抗體，美國Abcam公司；兔抗人β-微管蛋白多克隆抗體，美國Proteintech公司；4‘，6-二脒基-2-苯基吲哚（4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）溶液，索萊寶公司；逆轉錄試劑盒RR037A，日本TaKaRa公司；qPCR試劑盒，德國Qiagen公司。正置熒光顯微鏡（TS100）和倒置熒光顯微鏡（Olympus Cx21），日本Nikon公司；超微量生物檢測儀（Nano?drop2000c），美國 Thermo公司；CO2培養(yǎng)箱（SPX-250BS/S-Ⅱ），上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；超高效液相色譜-質(zhì)譜儀（Waters TQD），美國Waters公司。

1.2 神經(jīng)干細胞的提取、培養(yǎng)和鑒定

體質(zhì)量250～350 g的SD大鼠（溫州醫(yī)科大學實驗動物中心，動物許可證編號：SCXK（浙）2015-0001），以雌雄比1∶1置入交配籠里進行交配，室溫控制在21～23℃，12 h晝夜交替，將觀察到陰拴日記為孕第0天（E0）。對E15孕鼠以0.01 mL·kg-1ip給予5%水合氯醛進行麻醉，麻醉后無菌環(huán)境下取出胎鼠的大腦皮質(zhì)進行增殖培養(yǎng)提取NSC。增殖培養(yǎng)基為含神經(jīng)營養(yǎng)因子（2%B27，bFGF 20 μg·L-1和EGF 20 μg·L-1）和1%青鏈霉素混合液的DMEM/F12（1∶1），培養(yǎng)條件為5% CO2，37℃。培養(yǎng)約5 d進行細胞傳代，穩(wěn)定培養(yǎng)至第2代可接種于基質(zhì)膠預先包被的培養(yǎng)板，隨后進行NSC標志物巢蛋白和Sox2的免疫熒光染色：4%多聚甲醛固定30 min，0.5%曲拉通X-100透膜20 min和5%驢血清封閉孵育1 h后，加入含有巢蛋白和Sox2抗體（稀釋比例均為1∶200）的一抗稀釋液。4℃搖床孵育16～20 h后，加入含有驢抗小鼠IgG抗體和驢抗兔IgG抗體（稀釋比例均為1∶500）的二抗稀釋液（用0.01 mol·L-1磷酸鹽緩沖液稀釋），室溫搖床孵育1 h，并用DAPI溶液對所有細胞核進行復染。然后用正置熒光顯微鏡拍照，用巢蛋白陽性和Sox2陽性細胞比例代表NSC純度，以鑒定NSC。巢蛋白陽性細胞比例（%）=巢蛋白陽性細胞數(shù)/DAPI陽性細胞數(shù)×100%，Sox2陽性細胞比例（%）=Sox2陽性細胞數(shù)/DAPI陽性細胞數(shù)×100%。

除劃痕實驗細胞接種前培養(yǎng)板不需要基質(zhì)膠預處理外，其他實驗細胞培養(yǎng)板均用基質(zhì)膠預處理，并置于細胞培養(yǎng)箱內(nèi)6～12 h，以促進NSC貼壁。

1.3 逆轉錄PCR及凝膠電泳檢測11 β-HSD1 mRNA在神經(jīng)干細胞的表達

以每孔5.0×105L-1的密度將細胞接種于6孔板，每孔加入增殖培養(yǎng)基2 mL，置于細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h后更換增殖培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。按Trizol試劑說明書提取NSC的總RNA，測定總RNA濃度及A260nm/A280nm的比值；利用TaKaRa逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA，進行PCR，并用瓊脂糖凝膠電泳法檢測PCR產(chǎn)物。以EB核酸染色劑染色，在Bio-Rad曝光機凝膠成像系統(tǒng)的紫外線下對瓊脂糖凝膠進行曝光處理，用Image Lab 3.0軟件觀察目的基因11β-HSD1和內(nèi)參RS16的曝光條帶。內(nèi)參基因RS16的上游引物（F）AAGTCTTCG?GACGCAAGAAA，下游引物（R）TTGCCCAGAAGCAGAACAG；目的基因11β-HSD1的上游引物（F）CGAAGAAGCATGGAGGTCAAC，下游（R）GCAGAGTAGGAAGCAATCAGAG；反應條件：預變性（95℃，3 min），變性（95℃，15 s），退火（60℃，15 s）及延伸（72℃，60 s），共35循環(huán)，最后72℃延伸5 min。

1.4 免疫熒光法檢測NSC增殖能力

1.4.1 DHC對NSC增殖的影響

將NSC以每孔0.5×105L-1的密度接種于預先放入爬片的24孔板，每孔加入增殖培養(yǎng)基500 μL。在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，將細胞隨機分為細胞對照組，溶劑對照組（0.1% DMSO處理48 h），CORT陽性對照組（CORT 1.0 μmol·L-1處理48 h），DHC組（DHC 0.1，1.0和10.0 μmol·L-1處理48 h）。在處理結束前 4 h 加入終濃度為 10 μmol·L-1的5-乙炔基-2’脫氧尿嘧啶核苷（5-ethynyl-2′-deoxy?uridine，EdU），處理結束后按照Click-iT? EdU Alexa Fluor488試劑盒說明書進行EdU和Hoechst 33342免疫熒光實驗。用正置萊卡顯微鏡拍攝照片，ImageProPlus 6.0軟件計數(shù)EdU陽性細胞數(shù)和Hoechst陽性細胞數(shù)，并計算EdU陽性的細胞比例，以此代表NSC的增殖能力。NSC增殖率（%）=EdU陽性細胞數(shù)/Hoechst陽性細胞數(shù)×100%。

1.4.2 BVT對NSC增殖的影響

將NSC以每孔0.5×105L-1的密度接種于預先放入爬片的24孔板，每孔加入增殖培養(yǎng)基500 μL。在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，將細胞隨機分為細胞對照組（培養(yǎng)48 h），溶劑對照組（0.1% DMSO處理48 h），DHC模型組（DHC 10.0 μmol·L-1處理48 h），BVT對照組（BVT 10.0 μmol·L-1處理48 h），BVT干預組（BVT 10.0 μmol·L-1處理1 h后再給予DHC 10.0 μmol·L-1，繼續(xù)處理48 h）。在處理結束前4 h加入終濃度為 10.0 μmol·L-1的EdU，處理結束后，按1.4.1進行檢測和分析NSC的增殖率。

1.4.3 BVT對NSC分化的影響

將NSC按1.0×105L-1的細胞密度接種于預先放入爬片的24孔板，每孔加入增殖培養(yǎng)基500 μL，在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，更換為含有1% N-2 supplement（100×）和 1%青、鏈霉素混合液的DMEM/F12（3∶1）的分化培養(yǎng)基500 μL并將細胞按1.4.2分組處理，48 h后更換分化培養(yǎng)基，結束藥物處理。以后每2 d更換一次分化培養(yǎng)基，直至細胞總分化時間達到7 d。然后對各組細胞進行GFAP、NeuN以及DAPI（可對所有細胞核進行染色）的免疫熒光染色實驗：4%多聚甲醛固定30 min，0.5%曲拉通X-100透膜20 min和5%驢血清封閉孵育1 h后，加入含有GFAP和NeuN抗體（稀釋比例均為1∶500）的一抗稀釋液。4℃搖床孵育16～20 h后，加入含有驢抗山羊和驢抗小鼠IgG抗體（稀釋比例均為1∶500）的二抗稀釋液（用0.01 mol·L-1磷酸鹽緩沖液稀釋），室溫搖床孵育1 h，最后用DAPI溶液復染細胞核。用正置萊卡顯微鏡拍攝照片，ImageJ 1.51軟件和ImageProPlus 6.0軟件分別計數(shù)GFAP陽性、NeuN陽性和DAPI陽性細胞數(shù)，以GFAP陽性和NeuN陽性細胞比例分別反映NSC的星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元的分化能力。GFAP陽性細胞比例（%）=GFAP陽性細胞數(shù)/DAPI陽性細胞數(shù)×100%，NeuN陽性細胞比例（%）=NeuN陽性細胞數(shù)/DAPI＋細胞數(shù)×100%。

1.5 乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）釋放法檢測細胞毒性

將NSC以每孔1.0×105L-1的密度接種于96孔板，每孔增殖培養(yǎng)基100 μL，在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，將細胞按1.4.2分組處理，并增設最大LDH釋放組，在處理結束前40 min向最大LDH釋放組的每個孔均加入10 μL的裂解液，處理結束后按照CytoTox 96非放射性細胞毒性試劑盒說明書，每孔各取培養(yǎng)上清液50 μL轉移至另一96孔板與檢測緩沖液底物50 μL混合，室溫下避光孵育30 min后，每孔各加終止液50 μL終止反應。用酶標儀檢測吸光度（A490nm）以反映LDH釋放量，并以LDH釋放率反映各組細胞毒性。LDH釋放率（%）＝處理組A490nm/最大LDH釋放組A490nm×100%。

1.6 超高效液相色譜-質(zhì)譜（UPLC-MS）法檢測11 β-HSD1的還原活性

將NSC以每孔0.5×105L-1的密度接種于預先放入爬片的24孔板，每孔加入增殖培養(yǎng)基500 μL，在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后將細胞隨機分為DHC模型組（DHC 10.0 μmol·L-1處理48 h）和BVT干預組（BVT 10.0 μmol·L-1處理 1 h 后再給予 DHC 10.0 μmol·L-1，繼續(xù)處理48 h），然后收集各組的細胞培養(yǎng)基并繼續(xù)進行如下UPLC-MS處理并計算培養(yǎng)基中DHC和BVT的濃度。

分別配制濃度梯度的CORT（0.01，0.02，0.1，0.5，1.0，2.0，5.0 μmol·L-1）、DHC（0.03，0.06，0.3，1.5，3.0，6.0和15.0 μmol·L-1）（標準品）原液及皮質(zhì)醇0.2 μmol·L-1（內(nèi)標），取空白培養(yǎng)基90 μL，加各梯度標準品原液10 μL置于1.5 mL塑料離心管中，加入內(nèi)標10 μL，渦旋2 min混勻，隨后加入甲醇300 μL沉淀蛋白，渦旋3 min，然后4℃，13 523×g離心10 min，取上清100 μL于進樣小瓶中進行UPLC-MS分析，以標準品與內(nèi)標的峰面積比值與相應的濃度進行加權線性回歸，分別得到CORT及DHC的標準曲線方程。然后取細胞培養(yǎng)基100 μL和空白培養(yǎng)基100 μL進行上述同樣操作，隨后將樣本與內(nèi)標的峰面積比值代入標準曲線方程，分別得出各培養(yǎng)基樣品中CORT和DHC的濃度，并計算轉化率（即酶的還原活性）。酶的還原活性（%）=CORT濃度/DHC濃度×100%。

1.7 Western印跡法檢測11 β-HSD1蛋白表達

將NSC以每孔5×105L-1的密度接種于6孔板，每孔加入增殖培養(yǎng)基2 mL，培養(yǎng)24 h后將細胞按1.6分組處理，48 h后配置蛋白裂解試劑依次加入至6孔板中，于冰上靜置10 min，收集裂解液，超聲。4℃，12 000×g離心30 min，收取上清液。用BCA工作試劑盒測定蛋白濃度，每條泳道蛋白上樣量25 μg，電泳、轉膜后用5%脫脂奶粉封閉1 h，加入內(nèi)參蛋白β微管蛋白抗體（稀釋比例1∶2000）和目的蛋白11β-HSD1抗體（稀釋比例1∶1000），4℃搖床孵育18～20 h。TBST洗膜，加入稀釋比例為1∶5000的羊抗兔生物素二抗，室溫孵育1 h，TBST充分洗膜，通過曝光后顯示條帶。ImageJ 1.51軟件分析目標蛋白條帶和內(nèi)參蛋白條帶的積分吸光度（integrated absorbance，IA），11β-HSD1蛋白相對表達水平以IA11β-HSD1/IAβ微管蛋白比值表示。

1.8 劃痕實驗檢測NSC遷移能力

將NSC以2.5×105L-1密度接種于用10%多聚鳥氨酸預處理（以促進NSC貼壁）的24孔板，每孔加入增殖培養(yǎng)基500 μL，在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待培養(yǎng)孔底部完全被細胞覆蓋，使用200 μL無菌槍頭對所有實驗孔的細胞進行劃痕處理并更換分化培養(yǎng)基，立即用倒置萊卡顯微鏡拍攝此時細胞劃痕（0 h）的照片。然后將細胞按1.4.2分組處理，48 h后在0 h各拍照位點處復拍此時的劃痕照片（48 h）。ImageJ 1.51軟件計算處理前后細胞劃痕的面積，以“愈合”率反映NSC遷移能力?！坝稀甭剩?）=（0 h的劃痕面積-48h的劃痕面積）/0h的劃痕面積×100%。

1.9 統(tǒng)計學分析

所有實驗均重復≥3次，實驗結果用±s表示，用SPSS18.0軟件進行統(tǒng)計分析。3組以上的比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD法；兩組比較采用兩獨立樣本的t檢驗。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 神經(jīng)干細胞的鑒定

原代NSC培養(yǎng)5～7 d，可逐漸增殖，形成具有良好折光性的多細胞的球體（圖1），選取400～500 μm的神經(jīng)球用消化酶消化為單個NSC進行接種貼壁培養(yǎng)，以進行鑒定和后續(xù)實驗。免疫熒光實驗結果（圖2）表明，巢蛋白（紅色）和Sox2（綠色）陽性的細胞在DAPI（藍色）細胞核染色的細胞中所占比例均>96%。因此，培養(yǎng)的細胞為NSC。

Fig.1 Photomicrograph of neural stem cells（NSCs）sphere.

2.2 11 β-HSD1 mRNA在神經(jīng)干細胞中的表達水平

11β-HSD1和RS16的核酸凝膠電泳條帶圖表明，11β-HSD1存在于NSC上（圖3）。

Fig.2 Immunofluorescence images of NSCs for nestin（A）and SRY（sex determining region Y）-box tran?scription factor-2（Sox2）（B）.DAPI：4′，6-diamidino-2-phenylindole.

Fig.3 Identification of 11 β-hydroxysteroid dehydroge?nase type 1（11 β-HSD1）by nucleic acid gel electro?phoresis.

2.3 CORT和DHC對神經(jīng)干細胞增殖能力的影響

如圖4所示，與細胞對照組相比，溶劑對照組、DHC 0.1和1.0 μmol·L-1組NSC增殖率無統(tǒng)計學差異，CORT 陽性對照組和 DHC 10.0 μmol·L-1組NSC增殖率顯著降低（P<0.01）；與溶劑對照組相比，DHC 0.1 和1.0 μmol·L-1增殖率變化無統(tǒng)計學差異，CORT陽性對照組和DHC 10.0 μmol·L-1組NSC增殖率顯著降低（P<0.01）；與CORT陽性對照組相比，DHC 0.1和1.0 μmol·L-1組NSC增殖率顯著增高（P<0.05），但DHC 10.0組NSC增殖率變化無統(tǒng)計學差異。提示DHC 0.1和1.0 μmol·L-1均不影響 NSC增殖，但 CORT 1.0 μmol·L-1和 DHC 10.0 μmol·L-1對 NSC的增殖具有相同程度抑制作用，表明非活性 DHC 10.0 μmol·L-1可建立與活性CORT 1.0 μmol·L-1等效的糖皮質(zhì)激素濃度顯著升高的環(huán)境。因此，后續(xù)實驗均以DHC 10.0 μmol·L-1作為造模濃度。

Fig.4 Effect of corticosterone（CORT）and 11-dehy?drocorticosterone（DHC） on NSC proliferation by 5-ethynyl-2′-deoxyuridine （EdU） assay.EdU positive cells refer to the cells that have the ability to proliferate，Hoechst positive cells mean total cells.DMSO group：NSCs were treated with 0.1% DMSO for 48 h；positive control group：NSCs were treated with CORT 10.0 μmol·L-1for 48 h；DHC groups：NSCs were treated with DHC 0.1，1.0 or 10.0 μmol·L-1for 48 h，respec?tively.B was the semi-quantitative result of A.±s，n=3.＊＊P<0.01，compared with cell control group；##P<0.01，compared with DMSO group；△P<0.05，compared with positive control group.

2.4 BVT和DHC對神經(jīng)干細胞的毒性作用

如表1顯示，細胞對照組、溶劑對照組，DHC模型組、BVT對照組和BVT干預組LDH釋放變化無顯著差異，各組之間均無統(tǒng)計學意義。說明BVT和DHC均不增加NSC的LDH釋放率，即BVT和DHC均無細胞毒性作用。

2.5 BVT對神經(jīng)干細胞11 β-HSD1還原活性的影響

如表2所示，BVT干預組11β-HSD1還原活性顯著低于DHC模型組（P<0.01），說明BVT可顯著抑制NSC的11β-HSD1酶的還原活性。

Tab.1 Effect of DHC and BVT-14225（BVT）on lactate dehydrogenase（LDH）release rate of NSCs

Tab.2 Effect of BVT on reduction activity of 11 β-HSD1 in NSCs by ultra performance liquid chromatographymass spectrometry（UPLC-MS）assay

2.6 BVT對神經(jīng)干細胞11 β-HSD1蛋白表達水平的影響

如圖5顯示，與DHC模型組相比，BVT干預組蛋白表達水平的變化無統(tǒng)計學差異，表明BVT不改變NSC的11β-HSD1蛋白表達。

2.7 BVT對神經(jīng)干細胞增殖能力的影響

如圖6所示，與細胞對照組相比，溶劑對照組和BVT對照組NSC增殖率無統(tǒng)計學差異，DHC模型組（P<0.01）和BVT干預組（P<0.05）NSC增殖率均顯著降低；與溶劑對照組相比，DHC模型組NSC增殖率顯著降低（P<0.01），而BVT對照組和BVT干預組NSC增殖率均無統(tǒng)計學差異；與DHC模型組相比，BVT干預組NSC增殖率顯著增強（P<0.05）。說明在糖皮質(zhì)激素濃度顯著升高時，BVT可促進NSC增殖。

2.8 BVT對神經(jīng)干細胞分化能力的影響

如圖7所示，細胞對照組、溶劑對照組，DHC模型組、BVT對照組和BVT干預組NeuN陽性和GFAP陽性細胞所占的比例變化無顯著差異，各組之間均無統(tǒng)計學意義。說明DHC不影響NSC的分化，并且在糖皮質(zhì)激素濃度顯著升高時，BVT也不影響NSC的分化。

Fig.5 Effect of BVT on 11β-HSD1 protein expression in NSCs by Western blotting.Lane 1：model group；Lane 2：BVT intervention goup.See Tab.2 for the NSC treatment.B was the semi-quantitative result of A.IA：integrated absorbance.±s，n=4.

Fig.6Effect of BVT on NSCs proliferation by EdU assay.EdU positive cells refer to the cells that have the ability to proliferate.Hoechst33342 positive cells mean total NSCs.See Tab.1 for the NSC treatment.B was the semi-quantitative result of A.±s，n=3. ＊P<0.05，＊＊P<0.01，compared with cell control group；##P<0.01，compared with DMSO group；△P<0.05，compared with model group.

2.9 BVT對神經(jīng)干細胞遷移能力的影響

Fig.7 Effect of BVT on NSC differentiation by immunofluorescence assay.Neuronal nuclei（NeuN）positive cells mean neurons，glial fibrillary acidic protein（GFAP）positive cells means astrocytes，and DAPI positive cells mean all NSCs.See Tab.1 for the NSC treatment.B and C were the semi-quantitative result of A.±s，n=3.

Fig.8 Effect of BVT on NSC migration by scratch assay.See Tab.1 for the NSC treatment.B was the semi-quantitative result of A.±s，n=3.＊P<0.05，compared with model group.

如圖8所示，細胞對照組、溶劑對照組、DHC模型組和BVT對照組NSC遷移率變化均無顯著差異，各組之間無統(tǒng)計學意義；與DHC模型組相比，BVT干擾組NSC遷移率顯著增強（P<0.05）。說明雖然DHC不影響NSC遷移，但在糖皮質(zhì)激素濃度顯著升高時，BVT可促進NSC遷移。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，NSC上存在糖皮質(zhì)激素代謝酶11β-HSD1；在本實驗條件下，非活性糖皮質(zhì)激素DHC可顯著抑制NSC的增殖，但對分化和遷移無影響；且在糖皮質(zhì)激素濃度顯著升高時，BVT可通過抑制NSC 11β-HSD1還原活性，顯著促進NSC增殖和遷移而不影響分化（本研究結果已申請國家發(fā)明專利，專利號：202010531732.9）。

HARRIS等[13]通過建立小鼠的急性束縛應激模型的研究表明，應激時，野生型小鼠血漿CORT濃度增加但DHC濃度并未增加，而11β-HSD1（-/-）小鼠的血漿CORT和DHC濃度均表現(xiàn)出顯著增高。且TA等[14]研究表明，大鼠急性應激時，血漿CORT濃度顯著增加，而血漿DHC濃度呈現(xiàn)下降的趨勢。因此，應激時HPA軸激活，機體內(nèi)大量的非活性形式的DHC在代謝酶11β-HSD1的催化下，快速轉化為活性的CORT，使機體活性的糖皮質(zhì)激素濃度迅速升高。由于本研究擬通過調(diào)節(jié)11β-HSD1還原活性研究其對NSC增殖、分化和遷移的影響以期達到神經(jīng)保護作用，所以本研究以DHC作為反應底物，模擬高糖皮質(zhì)激素環(huán)境。本研究以CORT 1.0 μmol·L-1[7，14-15]為等效性評估標準，通過檢測NSC增殖以確定DHC的等效濃度。

應激是機體重要的防御機制，應激時糖皮質(zhì)激素的升高對抵抗有害刺激和保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定起著重要的作用，但是持續(xù)高濃度的糖皮質(zhì)激素不利于NSC發(fā)育。

ANACKER 等[16]研究 表 明，神 經(jīng)祖細 胞（HPC03A/07）暴露于高濃度的皮質(zhì)醇（100μmol·L-1），其增殖能力顯著降低。SUNDBERG等[7]研究表明，在原代NSC的體外培養(yǎng)中，高濃度的地塞米松和皮質(zhì)酮（1.0 μmol·L-1）均可顯著抑制NSC的增殖能力。這與本研究中DHC轉化為CORT，抑制NSC增殖能力的實驗結果相似，也證明本研究DHC模型的可靠性。WONG等[17]通過對SD大鼠腹腔注射CORT建立應激模型的研究表明，7 d高水平的糖皮質(zhì)激素顯著降低NSC向神經(jīng)元分化的能力，不影響NSC向星形膠質(zhì)細胞的分化；而28 d高水平的糖皮質(zhì)激素顯著降低NSC向神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞的分化能力。SUNDBERG等[7]研究表明，原代NSC暴露于高濃度的地塞米松或皮質(zhì)酮5 d，分化能力無任何改變。ANACKER等[16]研究表明，高濃度的皮質(zhì)醇（100 μmol·L-1）可顯著抑制HPC03A/07細胞分化為神經(jīng)元，但并不影響其向星形膠質(zhì)細胞的分化。這與本研究中DHC或CORT不影響NSC分化能力的實驗結果似乎是矛盾的，原因為本研究中NSC暴露于DHC通過11β-HSD1轉化的CORT，48 h的暴露結束后，NSC繼續(xù)在無DHC的分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d，類似于具有5 d的暴露后“恢復期”，可能是產(chǎn)生與上述研究結果矛盾的原因。STEVENS等[18]通過建立孕期（E12）小鼠的束縛應激模型的研究表明，CORT對神經(jīng)祖細胞的遷移能力具有抑制作用。而本研究中的劃痕遷移實驗結果表明，DHC不影響NSC遷移能力，可能也是由于本實驗條件下活性CORT暴露時間短、濃度低所致。因此，DHC暴露處理48 h可導致NSC增殖能力顯著降低，但不影響NSC遷移能力和分化能力。

由于11β-HSD1在非完整細胞雖可表現(xiàn)出氧化還原雙重活性，但在完整細胞內(nèi)主要表現(xiàn)為還原活性（即催化DHC還原為CORT）[19]。而機體應激時循環(huán)中糖皮質(zhì)激素濃度的增加會導致局部腦組織糖皮質(zhì)激素濃度的增加，因此降低局部腦組織活性糖皮質(zhì)激素的濃度對NSC至關重要。所以為了消除活性糖皮質(zhì)激素的不良生物學效應，11β-HSD1是較好的糖皮質(zhì)激素受體前調(diào)控靶點。

RAJAN等[10]研究表明，DHC和CORT均顯著增強紅藻氨酸對海馬神經(jīng)元的神經(jīng)毒性，11β-HSD1還原酶抑制劑甘草次酸不改變CORT對紅藻氨酸神經(jīng)毒性的增強作用，但甘草次酸顯著降低DHC對紅藻氨酸神經(jīng)毒性的增強作用。因此，11β-HSD1在神經(jīng)元上以還原性為主，抑制其活性可減弱DHC對神經(jīng)元的毒性作用。此外，PUIGORIOLILLAMOLA等[20]研究表明，11β-HSD1抑制劑可以阻滯氧化應激小鼠的神經(jīng)退化和認知受損的進程。YAU等[21-22]研究表明，11β-HSD1（-/-）小鼠在急性應激時可表現(xiàn)出較完整的空間記憶能力。因此，抑制11β-HSD1具有顯著的神經(jīng)保護作用。

BVT-14225是Biovitrum公司開發(fā)的BVT系列11β-HSD1抑制劑之一，目前糖尿病的非臨床研究已證明，BVT系列試劑對11β-HSD1還原活性具有顯著的抑制作用[23-24]，且與其藥理作用相似的類似物已進入臨床Ⅱ期試驗。本實驗首次確證NSC上存在11β-HSD1，且以還原活性為主，所以本研究以BVT探討抑制NSC 11β-HSD1還原活性對NSC增殖、分化以及遷移的影響。UPLC-MS實驗結果表明，BVT可顯著抑制11β-HSD1的還原活性。并且LDH釋放實驗和Western印跡實驗結果證明，本實驗濃度的BVT不產(chǎn)生細胞毒性且不改變11β-HSD1蛋白表達水平。因此，結合EdU實驗、免疫熒光染色實驗和劃痕實驗結果可知，在糖皮質(zhì)激素濃度顯著升高時，BVT可通過抑制NSC 11β-HSD1的還原活性促進NSC的增殖和遷移，但不影響其分化，從而緩解過高濃度糖皮質(zhì)激素對NSC的損傷。

綜上所述，BVT或其衍生物在未來是值得的藥物開發(fā)的靶點，用于降低胎兒圍術期或病理環(huán)境下局部糖皮質(zhì)激素的濃度，以緩解過高濃度糖皮質(zhì)激素對NSC的損傷作用。但本研究均是在離體細胞中進行的，尚未在動物實驗中進行驗證。因此還需要一系列的動物實驗及臨床試驗進行驗證。