馬立威，陳 哲，陳曉婷，倪世宇，賈永明，樊 麗，劉吉成

（齊齊哈爾醫(yī)學院1.醫(yī)藥科學研究院，2.公共衛(wèi)生學院，4.藥學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；3.齊齊哈爾醫(yī)學院附屬第五醫(yī)院，黑龍江 大慶 163001）

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一。流行病學調(diào)查顯示，乳腺癌呈逐年增長趨勢，占女性惡性腫瘤發(fā)病率之首，嚴重威脅到女性的健康與生命[1-3]。數(shù)據(jù)顯示，全球癌癥發(fā)病率中乳腺癌發(fā)病率以11.6%位居第二，同時以6.6%的死亡率位居癌癥死亡率第五[4]。目前，對于乳腺癌的治療主要包括放化療和手術(shù)治療，并不十分滿意的療效讓研究者著眼于開發(fā)更好的方式手段治療乳腺癌[5-6]。

中藥多途徑、多靶點的抗癌特點逐漸得到認可。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，中藥狼毒大戟（Euphorbia fischerianaSteud.）及從中提取的單體成分具有較好的抗腫瘤尤其是抗乳腺腫瘤活性，但也有一定的副作用[7-13]。水煎劑是中藥最常用的服藥形式，對于中醫(yī)藥的傳承發(fā)展，經(jīng)典名方是重要突破口，以中藥經(jīng)典方劑為對象的研究具有非常重要的意義[14]。因此，依據(jù)張仲景的經(jīng)典名方“十棗湯”的成方原理，本研究將大戟類藥材狼毒大戟配伍大棗來緩和其峻下逐水、胃腸不適等毒副作用。另外，中藥抗腫瘤研究中，傳統(tǒng)的中藥藥理學方法是將中藥或者中藥的復方粗制劑直接加入離體反應體系中進行，但由于缺乏復方的體內(nèi)代謝物或機體反應物等實際有效成分，致使機體非吸收物質(zhì)體外直接作用而造成假陽性；另外，粗提物本身對離體反應也可能會有干擾，從而影響實驗結(jié)果的準確性。中藥血清藥理實驗是指將中藥或其復方ig給予動物一定時間后，采集動物血液、分離血清，用此含有藥物成分的血清進行體外實驗[15]，可在一定程度上避免中藥復方制劑及其粗提物用體外實驗評價藥物體內(nèi)效應的不客觀性和不確切性。本研究從狼毒大戟與大棗配伍的水煎劑大戟大棗湯（decoc?tion ofE.fischerianaSteud.andZiziphus jujubaMil.，DEFSJ）著手，將其制備成含藥血清（DEFSJ-containing serum，DEFSJ-CS），通過體外細胞實驗探討其抗乳腺腫瘤的作用及其可能的作用機制，以期為乳腺癌的臨床治療提供新的線索。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑和主要儀器

狼毒大戟全株采于黑龍江省泰康縣，經(jīng)齊齊哈爾醫(yī)學院天然藥物化學實驗中心郭麗娜教授鑒定，確定為大戟科植物狼毒大戟，取其根部入藥，備用；大棗（Z.jujubaMil.）為藥材批發(fā)市場購買（狗頭棗，陜西綠音產(chǎn)，批號：20160509-1）。

MEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；胎牛血清（美國Hyclone公司）；小鼠抗人Bcl-2單抗（美國CST公司）；兔抗人Bax單抗、兔抗人Bim單抗和羊抗小鼠IgG及羊抗兔IgG抗體（美國Abcam公司）；紫杉醇（中國北京雙鷺藥業(yè)公司）；DAPI（美國Thermo公司）；ActinGreen488（美國GeneCopoeia公司）；甲基纖維素（美國Sigma公司）；線粒體膜電位檢測試劑盒和活性氧（reactive oxygen species，ROS）試劑盒（中國碧云天生物公司，產(chǎn)品編號分別為：C2006和S0033）；逆轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒（日本TaKaRa公司，LOT#：AA5302-1）。

3111型細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo公司），IX51型倒置顯微鏡（日本Olympus公司），R-300型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)（瑞士Buchi公司），LSM710型激光共聚焦顯微鏡（德國Zeiss公司），F(xiàn)ACSCalibu型流式細胞儀（美國BD公司），S1000型梯度PCR儀和Chemi?Doc MP型全自動熒光及化學發(fā)光系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司），BioSpec-nano型微量紫外分光光度計（日本島津公司）。

1.2 DEFSJ制備

狼毒大戟與大棗按質(zhì)量比1∶1混合（狼毒大戟根1 kg，大棗1 kg），加水10 L，浸泡30 min，煎煮2次，每次2 h，過濾后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至2 L，備用。并采用高效液相色譜法（HPLC）對DEFSJ進行質(zhì)量控制分析，結(jié)果顯示主要成分穩(wěn)定，重復性好（圖1）。

1.3 動物和DEFSJ-CS的制備

20只SPF級SD雄性大鼠，體質(zhì)量300～400 g，按照SPF級動物飼養(yǎng)規(guī)范飼養(yǎng)（哈爾濱醫(yī)科大學實驗動物醫(yī)學部），許可證號：SCXK（黑）2013-001，飼養(yǎng)于齊齊哈爾醫(yī)學院實驗動物中心，許可證號：SYXK（黑）2016-001，適應性喂養(yǎng)3 d后，進行實驗。實驗和飼養(yǎng)及其他處理過程中產(chǎn)生的廢棄物及處死的大鼠均統(tǒng)一裝入指定袋中，按規(guī)定進行處理。實驗動物處置符合醫(yī)學倫理學標準。

SD大鼠隨機分成4組，每組5只。溶劑對照組大鼠ig給予生理鹽水4 mL；DEFSJ 2.5，5.0和10.0 g·kg-1組每日早、晚各ig給藥1次，共給藥3 d。末次給藥1 h后，水合氯醛麻醉，無菌條件下腹主動脈采血，離心分離（800×g，10 min）血清，獲得DEFSJ-CS，-80℃冰箱中凍存。使用前56℃水浴滅活30 min；0.22 μm濾器除菌。

1.4 細胞和分組處理

乳腺癌MCF-7細胞（中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心），本研究室液氮中保存。

Fig.1 HPLC analysis of decoction of E.fischeriana Steud.and Z.jujuba Mil.（DEFSJ）.HPLC method was used to analyze the chemical profile of DEFSJ.The comparison of 5 different times DEFSJ.

MCF-7細胞復蘇后，用MEM完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清，1%青、鏈霉素混合液）常規(guī)培養(yǎng)，2～3 d傳代1次。細胞分為細胞對照組（10%胎牛血清）、溶劑對照組（90% MEM培養(yǎng)基）、DEFSJ-CS 2.5，5.0 和10.0 g·kg-1和紫杉醇 8 mg·L-1（陽性對照）組。

1.5 甲基纖維素克隆形成實驗檢測克隆形成

參照文獻[16]方法，取對數(shù)生長期MCF-7細胞1×106L-1接種到12孔細胞培養(yǎng)板中，每孔1.0 mL，待貼壁穩(wěn)定后按1.4分組處理細胞，12 h后將預先配置好的甲纖維素培養(yǎng)體系（含甲纖維素濃度為1.2%和血清濃度為20%的MEM培養(yǎng)基）加入到各孔中，每孔1 mL，每組3個平行孔，置細胞培養(yǎng)箱中孵育7 d，計算各組細胞集落數(shù)；其中，以細胞數(shù)≥40的細胞團作為1個集落，計算克隆形成率。克隆形成率（%）=各組的集落數(shù)（均值）/細胞接種數(shù)×100%。

1.6 JC-1染色法檢測細胞線粒體膜電位

取對數(shù)生長期細胞計數(shù)后，調(diào)整細胞密度約5.0×108L-1，接種到激光共聚焦顯微鏡專用的6孔細胞培養(yǎng)板（黑壁底透）中，待細胞貼壁穩(wěn)定后，按1.4分組處理細胞；每孔對應加2.0 mL含藥血清的培養(yǎng)基，置細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育48 h；同時按試劑盒說明書，設陽性參比孔，孔內(nèi)加正常培養(yǎng)的MCF-7細胞。孵育結(jié)束后取出培養(yǎng)板，終止作用。每孔中加JC-1工作液1 mL，混勻后培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min；后用預先配制好的JC-1染色緩沖液洗滌2次，共聚焦顯微鏡下觀察并記錄接受不同處理的MCF-7細胞的形態(tài)及熒光強度（fluorescence intensity，F(xiàn)I）變化，拍照時將激光強度調(diào)成一致，最后以綠/紅FI比值表示膜電位去極化水平。

1.7 流式細胞儀檢測細胞內(nèi)ROS含量

MCF-7細胞以5.0×108L-1密度接種到6孔細胞培養(yǎng)板中，每孔2.0 mL，待細胞貼壁穩(wěn)定后，按1.4分組處理細胞；每孔對應加2.0 mL含藥血清的培養(yǎng)基，置細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育48 h后棄上清終止作用；按試劑盒說明書，每孔加入0.5 mL無血清培養(yǎng)基稀釋的探針（DCFH-DA），放入細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育30 min后收集細胞于流式管中。流式細胞儀上檢測并分析各組細胞中ROS含量變化，以樣品細胞的平均熒光強度（mean fluorescence intensity，MFI）值表示細胞中ROS含量。

1.8 RT-PCR法檢測Bcl-2，Bax和Bim mRNA表達

MCF-7細胞以5.0×108L-1密度接種到培養(yǎng)皿（35 mm）中，每孔2.0 mL，待細胞貼壁穩(wěn)定后按照1.4分組處理細胞；每皿對應加1.0 mL含藥血清培養(yǎng)基后培養(yǎng)箱中孵育48 h棄上清終止作用。Trizol法提取各組細胞的總RNA，紫外分光光度計檢測RNA濃度及純度。按試劑盒說明，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后進行PCR反應。β肌動蛋白（正向：5′-CTCCT?GAGCGCAAGTACTCC-3′，反向：5′-GTCACCTTCACCG TTCCAGT-3′，299 bp）作為內(nèi)參基因；待測基因引物Bcl-2（正向：5′-ACAGGTGTAAGCCACCGAAC-3′，反 向 ：5′-GTTGCAGTGAGC?CAAGATCA-3′，299 bp）、Bax（正向：5′-TGGT?GAAACCTTGTCTGCAC-3’，反向：5‘-CTTTGCCTTCTGGGTTCAAG-3′，297 bp）和Bim（正向：5′-TGCTGTCTCGATCCTCCAGTGG-3′，反向：5′-TCTCCAATACGCCGCAACTCTTG-3′，208 bp）；將所得PCR產(chǎn)物于1.5%濃度的瓊脂糖凝膠上電泳，成像系統(tǒng)下拍照并采集分析圖像，對目的條帶和內(nèi)參條帶的灰度（gray value，GV）值進行分析，以目的條帶GV與內(nèi)參條帶GV比值表示目的基因相對表達水平。

1.9 免疫熒光法檢測Bcl-2，Bax和Bim蛋白表達

MCF-7細胞以1.0×108L-1密度接種到共聚焦顯微鏡專用的48孔細胞培養(yǎng)板（黑壁底透），每孔2.0 mL，待細胞貼壁穩(wěn)定后，按1.4分組處理細胞；每孔里對應加0.2 mL含藥血清的培養(yǎng)基，置培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育48 h后終止作用。進行免疫熒光檢測：將培養(yǎng)板中的細胞經(jīng)固定液固定，通透液通透后；用事先配置好的封閉液（含1% BSA的PBS）在37℃封閉30 min；加一抗（Bcl-2，1∶1000；Bim，1∶1500；Bax，1∶1500）4℃孵育過夜，次日將二抗（1∶2000）對應加入細胞板各孔中，室溫、避光、孵育60 min；并按DAPI及ActinGreen488試劑說明書對細胞核及細胞骨架染色；激光共聚焦顯微鏡下觀察并記錄接受不同處理的MCF-7細胞的形態(tài)和FI變化，以FI值表示蛋白的相對表達水平。

1.10 統(tǒng)計學分析

實驗結(jié)果數(shù)據(jù)用±s表示，應用SPSS17.0軟件處理，根據(jù)方差齊性檢驗結(jié)果，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較應用Dunnettt方法，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 DEFSJ-CS對乳腺癌MCF-7細胞克隆形成率的影響

由表1顯示，與細胞對照組相比，溶劑對照組MCF-7細胞克隆形成率無統(tǒng)計學差異；與溶劑對照組比較，DEFSJ-CS 2.5，5.0和10.0 g·kg-1組及紫杉醇8 mg·L-1組克隆形成率均明顯降低（P<0.05，P<0.01）。

Tab.1 Effect of decoction of E.fischeriana Steud.and Z.jujuba Mil.containing serum（DEFSJ-CS）on clone formation in MCF-7 cells

2.2 DEFSJ-CS對乳腺癌MCF-7細胞線粒體膜電位的影響

如圖2顯示，溶劑對照組MCF-7細胞，由于存在較少的凋亡細胞，細胞的膜電位較高，細胞呈現(xiàn)較強的紅色熒光，而綠色熒光較弱；DEFSJ-CS 2.5，5.0和10.0 g·kg-1及紫杉醇8 mg·L-1組MCF-7細胞，綠色熒光的細胞比例逐漸增多，說明線粒體膜電位去極化程度增加；鏡下可見明顯細胞凋亡形態(tài)變化：細胞貼壁程度下降，形狀向橢圓形變化，細胞數(shù)量也有所減少。陽性參比孔細胞綠色熒光強度較強，但細胞形態(tài)變化不大。

2.3 DEFSJ-CS對乳腺癌MCF-7細胞ROS含量的影響

如表2所示，與溶劑對照組相比，DEFSJ-CS 2.5，5.0和10.0 g·kg-1組及紫杉醇8 mg·L-1組細胞內(nèi)ROS含量隨著DEFSJ-CS濃度增大逐漸增加（P<0.01）。

Tab.2 Effect of DEFSJ-CS on intracellular reactive oxygen species（ROS）content in MCF-7 cells

Fig.2 Effect of DEFSJ-CS on depolarization of mitochondrial membrane potential in MCF-7 cells.See Tab.1 for the cell treatment.B was the semi-quantitative result of A.±s，n=3.＊＊P<0.01，compared with vehicle control group.

2.4 DEFSJ-CS對乳腺癌MCF-7細胞Bcl-2，Bax和Bim mRNA表達的影響

如圖3所示，與溶劑對照組比較，DEFSJ-CS 2.5，5.0 和 10.0 g·kg-1組及紫杉醇 8 mg·L-1組MCF-7細胞Bax和BimmRNA相對表達水平逐漸增加，Bcl-2mRNA相對表達水平逐漸降低（P<0.05，P<0.01）。

2.5 DEFSJ-CS對乳腺癌MCF-7細胞Bcl-2，Bax和Bim蛋白表達的影響

Fig.3 Effect of DEFSJ-CS on mRNA expressions of Bcl-2，Bax and Bim in MCF-7 cells.See Tab.1 for the cell treat?ment.B was the quantitive result of A.GV：gray value.±s，n=3.＊P<0.05，＊＊P<0.01，compared with vehicle control group.

Fig.4 Effect of DEFSJ-CS on protein expressions of Bim in MCF-7 cells.See Tab.1 for the cell treatment.B was the semi-quan?titative result of A.±s，n=3.＊P<0.05，＊＊P<0.01，compared with vehicle control group.

Fig.5 Effect of DEFSJ-CS on protein expressions of Bax in MCF-7 cells.See Tab.1 for the cell treatment.B was the semi-quan?titative result of A.±s，n=3.＊P<0.05，＊＊P<0.01，compared with vehicle control group.

Fig.6 Effect of DEFSJ-CS on protein expression of Bcl-2 in MCF-7 cells.See Tab.1 for the cell treatment.B was the semiquantitative result of A.±s，n=3.＊P<0.05，＊＊P<0.01，compared with vehicle control group.

如圖4～6所示，與溶劑對照組比較，DEFSJCS 2.5，5.0和10.0 g·kg-1組及紫杉醇8 mg·L-1組MCF-7細胞Bim和Bax蛋白的熒光強度逐漸增加，Bcl-2蛋白的熒光強度逐漸降低（P<0.05，P<0.01）。DEFSJ-CS 2.5，5.0和10.0 g·kg-1及紫杉醇8 mg·L-1組，隨著DEFSJ-CS濃度的增加MCF-7細胞被DAPI染色均逐漸增強，細胞形態(tài)也出現(xiàn)了皺縮，細胞密度有所降低，并出現(xiàn)少量細胞碎片等典型的細胞凋亡的形態(tài)特征。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，DEFSJ-CS 2.5 g·kg-1濃度既可影響人乳腺癌MCF-7細胞的克隆形成。文獻報道，甲纖維素克隆形成實驗，可模擬細胞在人體內(nèi)的情況，反映細胞惡性程度的同時，也能反映細胞增殖速度的快慢[17]。這可初步證明，DEFSJ-CS可抑制MCF-7細胞增殖，其對細胞增殖的抑制作用，可能是通過誘導細胞凋亡來實現(xiàn)的。

本研究通過流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，DEFSJ-CS可下調(diào)MCF-7細胞的線粒體膜電位，增加細胞內(nèi)ROS含量，提示DEFSJ-CS能誘導MCF-7細胞凋亡。結(jié)合RT-PCR和免疫熒光法檢測發(fā)現(xiàn)，DEFSJCS能有效降低MCF-7細胞Bcl-2基因和蛋白的表達，增加Bax和Bim基因和蛋白的表達。對于腫瘤細胞的凋亡，線粒體膜電位的降低是腫瘤細胞早期凋亡的特征之一。同時也有研究報道，線粒體是細胞凋亡的控制中心，也是細胞內(nèi)ROS的主要來源[18-19]。ROS與細胞凋亡存在著十分密切的關(guān)系[20]。ROS的過量產(chǎn)生引起重要的細胞分子和結(jié)構(gòu)（如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA）氧化損傷，致使線粒體功能障礙，激活內(nèi)源性凋亡通路，最終導致細胞凋亡[21]。而研究報道，對于受基因調(diào)控的細胞凋亡，目前研究比較透徹的2條細胞凋亡傳導途徑分別為細胞外途徑即細胞表面死亡受體途徑和細胞內(nèi)途徑即線粒體途徑；其中由Bcl-2家族調(diào)節(jié)的線粒體凋亡途徑發(fā)揮重要作用[22]。Bcl-2家族相關(guān)因子（促凋亡因子Bax，Bim和Bak等，抗凋亡因子Bcl-2和Bcl-xl等）在細胞凋亡線粒體途徑中起著關(guān)鍵作用[23-24]。線粒體凋亡信號通路的激活又與線粒體膜電位的變化密不可分，而線粒體膜電位的變化受到Bcl-2家族蛋白的調(diào)控[25]。如Bax增加線粒體膜通透性，導致線粒體膜電位降低，使細胞內(nèi)ROS增加，激活胱天蛋白酶級聯(lián)反應，引發(fā)細胞凋亡；Bcl-2則產(chǎn)生相反的效應[26]。

上述結(jié)果表明，線粒體凋亡途徑參與了DEFSJCS誘導MCF-7細胞凋亡的調(diào)控。但是否還有其他調(diào)控機制的參與，有待后續(xù)深入研究。