張 嫻，楊 鵬，趙 軍，胡 娜，黨學(xué)良，張 琰

（1.空軍第986醫(yī)院藥劑科，陜西 西安 710054；2.空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院藥劑科，陜西 西安 710038）

刀豆蛋白A（concanavalin A，Con A）導(dǎo)致的肝損傷小鼠是一種自身免疫性肝損傷模型[1]，其病理機(jī)制在于Con A對CD4+T淋巴細(xì)胞和庫普弗細(xì)胞的過度激活[2-3]，并通過干擾素γ和腫瘤壞死因子α的大量釋放[4]，導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死。當(dāng)前針對Con A肝損傷的研究主要集中在免疫細(xì)胞活化[5]及相應(yīng)的抗炎治療[6-8]，而肝細(xì)胞壞死的詳細(xì)病理機(jī)制仍不清楚[9-10]。線粒體是細(xì)胞的能量工廠，線粒體結(jié)構(gòu)和功能的改變直接影響細(xì)胞的結(jié)局，是調(diào)節(jié)細(xì)胞存活或死亡的關(guān)鍵細(xì)胞器。已有文獻(xiàn)報(bào)道，Con A體外能降低肝成纖維細(xì)胞的線粒體膜電位，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[11]；而Con A導(dǎo)致小鼠肝損傷時(shí)肝細(xì)胞的死亡方式屬于壞死而不是凋亡，此時(shí)肝細(xì)胞線粒體是否存在損傷，其結(jié)構(gòu)和功能又發(fā)生了何種改變尚不清楚。線粒體的主要功能是進(jìn)行氧化磷酸化合成ATP，為細(xì)胞生命活動提供直接能源[12]。ATP與ADP和AMP的相互轉(zhuǎn)化實(shí)現(xiàn)貯能和放能，從而保證細(xì)胞各項(xiàng)生命活動的能量供應(yīng)。谷氨酸脫氫酶（glutamate dehydrogenase，GDH）是一種特異性的線粒體酶，位于線粒體基質(zhì)中，在肝組織高表達(dá)，當(dāng)線粒體損傷導(dǎo)致內(nèi)膜通透性提高時(shí)，GDH釋放到血清中[13]。因此，通過測定Con A肝損傷小鼠血清中GDH活性變化以及肝組織中各腺苷酸的含量變化，結(jié)合透射電鏡觀察線粒體形態(tài)，可反映該模型肝細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)及其功能的變化，對于揭示線粒體損傷是否參與該模型小鼠的肝細(xì)胞病理損傷機(jī)制具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 動物、藥物、試劑和儀器

C57BL/6J小鼠，SPF級，雄性，6～8周，體質(zhì)量18～22 g，由空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，合格證號SCXK（軍）2012-0007，許可證號：SYXK（軍）2012-0023。實(shí)驗(yàn)動物在20～25℃，濕度40%～60%，12/12 h晝夜節(jié)律條件下標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由飲水適應(yīng)1周。實(shí)驗(yàn)操作經(jīng)空軍軍醫(yī)大學(xué)動物倫理委員會審批。用滅菌生理鹽水將Con A分別配制成2和4 g·L-1溶液，并用0.22 μm微孔濾膜濾過，現(xiàn)用現(xiàn)配。

Con A（貨號：002631，Sigma，美國）；ATP標(biāo)準(zhǔn)品（貨號：A3854），ADP標(biāo)準(zhǔn)品（貨號：A4752），AMP標(biāo)準(zhǔn)品（貨號：HFBM150110521099）（合肥博美）；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（glutamic pyruvic transaminase，GPT）活性測定試劑盒（貨號170601）和GDH活性測定試劑盒（貨號257389）（上海透景診斷科技有限公司）。安捷倫1200高效液相色譜儀（安捷倫美國）；T10型ULTRA-TURRAX勻漿器（IKA，德國）；CR21F超高速冷凍離心機(jī)和200FR全自動生化分析儀（東芝，日本）；PB-10酸度計(jì)（賽多利斯，德國）；JEM-1230透射電鏡（JEOL，日本）。

1.2 動物分組和給藥

實(shí)驗(yàn)前，將30只C57BL/6J小鼠禁食不禁水15 h，按體質(zhì)量隨機(jī)分為3組，每組10只，分別為正常對照組（尾靜脈注射滅菌生理鹽水）、Con A 10和20 mg·kg-1組（尾靜脈注射Con A 0.05 mL·10 g-1），給藥后8 h摘眼球取血并處死[1]，全血靜置30 min后3000×g離心10 min取血清。

1.3 全自動生化分析儀檢測血清GPT和GDH活性

采用全自動生化分析儀，按照速率法測定血清GPT及GDH活性，當(dāng)測定數(shù)據(jù)超出儀器檢測線性范圍時(shí)將血清樣本用生理鹽水稀釋10倍后重新進(jìn)樣測定。

1.4 HE染色觀察肝組織病理變化

取肝左葉組織于4%多聚甲醛中固定24 h，石蠟包埋，常規(guī)方案脫蠟，進(jìn)行蘇木素和伊紅染色。

1.5 透射電鏡觀察肝細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)

取肝左葉組織于4%冷戊二醛溶液中固定8 h，0.1 mol·L-1磷酸鹽緩沖液中漂洗3次；將組織樣品在1%鋨酸中固定2 h，再次漂洗3次；然后脫水包埋在聚合物樹脂中，制備超薄切片，用2%乙酸鈾酰和檸檬酸鉛染色，通過透射電鏡觀察肝細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)。

1.6 高效液相色譜測定肝組織中ATP，ADP和AMP含量

小鼠處死后，迅速取肝組織約0.3 g，按5 mL·g-1加入預(yù)冷的0.4 mol·L-1高氯酸溶液，上述操作在30 s內(nèi)完成。冰浴上高速勻漿，10 000×g下低溫離心10 min，精密量取上清液并加同體積預(yù)冷的1 mol·L-1磷酸氫二鉀溶液，調(diào) pH 至 6.5；再次10 000×g低溫離心10 min，取上清液用0.22 μm濾膜過濾，置-20℃保存，進(jìn)行HPLC檢測。

色譜條件經(jīng)本室優(yōu)化，采用Ultimate TM AQ-C18親水色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫25℃；流動相為50 mmol·L-1磷酸二氫鉀緩沖液（pH 5.75）；流速1.4 mL·min-1；檢測波長259 nm；進(jìn)樣量20 μL。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)采用±s表示，采用GraphPad Prism 8.02軟件，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組之間比較采用單因素方差分析，各組與正常對照組比較采用Dunnettt檢驗(yàn)，P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Con A對小鼠血清GPT和GDH活性的影響

血清生化結(jié)果（圖1）顯示，給藥8 h后，與正常對照組比，ConA10和20mg·kg-1組小鼠血清GPT活性顯著升高（P<0.05，P<0.01），提示小鼠出現(xiàn)明顯的肝損傷；血清GDH活性分別升高0.34和3.04倍（P<0.01），提示Con A可致小鼠線粒體膜通透性增高。

Fig.1 Effect of concanavalin A（Con A）on activity of serum glutamic pyruvic transaminase（GPT）and glu?tamate dehydrogenase（GDH）in mice.Mice in Con A 10 or 20 mg·kg-1group were iv injected with Con A 5 mL·kg-1.The mice in normal control group were iv given with sterile saline by tail vein.±s，n=9-10.＊P<0.05，＊＊P<0.01，compared with normal control group.

2.2 Con A對小鼠肝組織病理變化的影響

HE染色結(jié)果（圖2）顯示，給藥8 h后，Con A組小鼠肝組織肝竇間隙及匯管區(qū)出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤，肝小葉有點(diǎn)灶樣壞死；Con A 20 mg·kg-1組大量肝細(xì)胞腫脹，呈片狀壞死。上述結(jié)果表明，Con A導(dǎo)致小鼠肝細(xì)胞壞死。

2.3 Con A對小鼠肝細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)的影響

透射電鏡觀察結(jié)果（圖3）顯示，正常對照組肝細(xì)胞線粒體成粒狀，雙層膜結(jié)構(gòu)以及嵴結(jié)構(gòu)清晰完整；Con A 10 mg·kg-1組線粒體部分出現(xiàn)雙層膜結(jié)構(gòu)的破壞；Con A 20 mg·kg-1組線粒體雙層膜結(jié)構(gòu)不完整，且線粒體腫脹，形狀高度不規(guī)則。表明Con A可致肝細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)完整性明顯破壞。

Fig.2 Effect of Con A on pathology changes in liver tissue of mice by HE stainning.See Fig.1 for the mouse treat?ment.Black arrows show inflammatory cells and white arrows show liver cell necrosis.

Fig.3 Effect of Con A on hepatocyte mitochondrial structure of mice by transmission electron microscopy.See Fig.1 for the mouse treatment.M：normal mitochondria；white arrow：mitochondria with loss of double limiting membrane；black arrow：large degenerative mitochondria.

2.4 Con A對小鼠肝組織中ATP，ADP和AMP含量的影響

將HPLC分析所得供試品各腺苷酸濃度（mg·L-1）按稀釋比換算為nmol·g-1肝組織（圖4A）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與正常對照組比，Con A 10和20 mg·kg-1組小鼠肝組織中ATP含量分別下降了25.6%和38.3%（P<0.01），ADP含量分別下降了36.0%和47.1%（P<0.01）。AMP含量變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

Fig.4 Effect of ConA on contents of ATP，ADP，AMP，total adenine nucleotide（TAN）and adenylate energy charges（AEC）in liver tissue of mice.See Fig.1 for the mouse treatment.TAN=ATP+ADP+AMP；AEC=〔（ATP）+1/2（ADP）〕/TAN.x±s，n=9-10.＊P<0.05，＊＊P<0.01，compared with normal control group.

將實(shí)驗(yàn)所得各組腺苷酸含量，按公式計(jì)算肝組織總體腺苷酸庫水平TAN=ATP+ADP+AMP和能荷水平 AEC=〔（ATP）+1/2（ADP）〕/TAN[14]（圖 4B和4C）。結(jié)果表明，與正常對照組比，Con A 10和20 mg·kg-1組小鼠肝組織TAN水平分別降低了16.5%和18.9%（P<0.05），AEC下降了15.7%和28.1%（P<0.01）。

3 討論

本研究結(jié)果表明，Con A可導(dǎo)致小鼠血清GPT升高，肝細(xì)胞壞死。血清GDH活性顯著升高，表明肝組織線粒體膜通透性提高，提示肝細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)完整性可能受到損傷。透射電鏡觀察肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞線粒體腫脹、形狀不規(guī)則，雙層膜結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，表明該模型中肝細(xì)胞線粒體存在明顯的結(jié)構(gòu)損傷。進(jìn)一步線粒體功能學(xué)研究表明，模型小鼠肝組織中高能化合物ATP和ADP的含量顯著下降，AMP略有升高，總體上表現(xiàn)為腺苷酸庫和能荷的顯著降低，表明肝線粒體呼吸鏈氧化磷酸化功能下降，生成高能磷酸化合物的能力下降，肝細(xì)胞能量儲備減少[14]。

線粒體是細(xì)胞能量生成和細(xì)胞存亡信號調(diào)節(jié)的關(guān)鍵細(xì)胞器。有研究表明，對乙酰氨基酚誘導(dǎo)的肝壞死小鼠和細(xì)胞模型中，當(dāng)補(bǔ)充ATP合成的前體果糖和甘氨酸后，肝細(xì)胞壞死程度顯著降低，此時(shí)再給予線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換抑制劑環(huán)孢素A，將進(jìn)一步增強(qiáng)肝細(xì)胞保護(hù)作用[15-16]。對乙酰氨基酚肝損傷模型提示，改善線粒體的功能，維護(hù)線粒體膜結(jié)構(gòu)的完整性對于抑制肝細(xì)胞壞死可能具有重要的治療意義。有研究表明，Con A體外能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[11]；但對小鼠，Con A誘導(dǎo)的肝細(xì)胞的死亡方式屬于壞死而不是凋亡[17-18]，本研究HE染色的病理結(jié)果也支持這一結(jié)論。也有文獻(xiàn)報(bào)道，清除線粒體呼吸鏈來源的氧自由基對Con A誘導(dǎo)的小鼠肝損傷具有顯著的保護(hù)作用[19]。因此提示，線粒體損傷可能是Con A誘導(dǎo)小鼠肝細(xì)胞壞死的關(guān)鍵細(xì)胞器。

綜上所述，在Con A致免疫性肝損傷小鼠中，線粒體的結(jié)構(gòu)和功能均出現(xiàn)了一定程度的損傷，表明線粒體損傷參與了免疫性肝損傷的病理機(jī)制。因此提示，修復(fù)線粒體損傷很可能是免疫性肝損傷除抗炎之外的一個新的治療策略。