郭 冉,李蕓芊,屠鵬飛,朱枝祥
(北京中醫(yī)藥大學中藥學院,北京 100029)
免疫是一種重要的機體防御功能,機體免疫系統(tǒng)通過清除入侵微生物、寄生蟲和突變細胞,維持生理功能的穩(wěn)定。免疫系統(tǒng)主要由免疫細胞和免疫因子組成,根據(jù)免疫系統(tǒng)發(fā)揮免疫調(diào)控作用的方式可分為天然免疫和適應(yīng)性免疫。天然免疫主要是天然免疫細胞通過識別病原相關(guān)模式分子(pathogen-associated molecular patterns,PAMP)或損傷相關(guān)模式分子(damage-associated molec?ular patterns,DAMP),以低特異性的方式清除大部分病原和損傷細胞[1-5]。適應(yīng)性免疫是機體針對內(nèi)外源抗原,激起的特異性免疫反應(yīng),最終通過細胞免疫或抗體介導(dǎo)的體液免疫特異清除病原體、病毒感染細胞和突變細胞,并具有免疫記憶功能[6-7]。雖然正常免疫功能對機體防御疾病發(fā)揮重要作用,但免疫功能失調(diào)也會導(dǎo)致嚴重的疾病。免疫功能缺陷會導(dǎo)致感染性疾病和腫瘤的發(fā)生,對內(nèi)、外源抗原過度激活的免疫反應(yīng)會導(dǎo)致自身免疫性疾病和過敏性疾病的發(fā)生[8-9]。
免疫細胞中的B細胞包含各種亞群,在天然免疫和適應(yīng)性免疫中均發(fā)揮重要作用,B細胞根據(jù)其對抗原的反應(yīng)特異性一般分為B1a,B1b和B2細胞。B1a細胞在PAMP刺激下直接分泌天然抗體,以低特異性清除一些常見的微生物,主要發(fā)揮天然免疫功能;B1b細胞在抗原和細胞因子刺激下以非T細胞依賴的方式分泌抗體,以較高的特異性介導(dǎo)體液免疫功能,但一般無免疫記憶功能[10-11]。B2細胞由骨髓中造血干細胞逐步分化形成原始B細胞(pre-pro-B cells)、祖B細胞(pro-B cells)和前B細胞(pre-B cells)等早期B細胞,然后繼續(xù)分化為表達B細胞受體(B-cell receptor,BCR)的T1,T2和T3期不成熟B細胞,最后再形成成熟B細胞[12-15];成熟B細胞在抗原和輔助性T細胞共刺激分子及其分泌的細胞因子刺激下,分化為記憶性B細胞和漿細胞,漿細胞分泌大量高親和力抗體發(fā)揮高特異性體液免疫功能,記憶性B細胞則讓體液免疫反應(yīng)具有免疫記憶功能[16]。
各種B細胞不僅在天然免疫和適應(yīng)性免疫的體液免疫中發(fā)揮重要功能,同時B細胞的功能失調(diào)也在自身免疫性疾病和過敏性疾病的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。B細胞亞群及其組織分布的準確分析,對開發(fā)治療自身免疫性疾病和過敏性疾病的免疫調(diào)控藥物的活性評價十分重要[17]。目前,主要利用流式細胞術(shù)對B細胞亞群進行定性定量分析。然而,在流式分析中,還缺乏對B細胞亞群表面標志物特異性的深入研究,各種文獻報道的B細胞亞群標志物組合差異較大,同時也缺乏對不同組織分布的B細胞亞群流式分析的比較研究[10-16]。本研究通過多種B細胞表面標志物的流式測定,優(yōu)化各種B細胞亞群的流式測定方法,同時也對各種組織中B細胞亞群進行系統(tǒng)研究,為免疫調(diào)控藥物活性評價提供研究方法和基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
8周齡雄性BALB/c小鼠6只,購自北京維通利華實驗動物有限公司,動物使用許可證號SYXK(京)2016-0038。小鼠在清潔級環(huán)境自由飲水進食3 d后用于實驗。所有動物實驗經(jīng)北京中醫(yī)藥大學動物實驗倫理委員會審批后進行。死細胞染色劑7-氨基放線菌素D(7-aminoactinomycin D,7-AAD)、純化的大鼠抗小鼠單克隆抗體抗-CD16/CD32(2.4G2)和熒光標記的大鼠抗小鼠單克隆抗體 APC-抗-B220(RA3-6B2)、PE-抗-CD11b(M1/70)、FITC-抗-CD43(S7)、PE-抗-CD138(281-2)及各熒光抗體的同型對照抗體,購自美國BD Biosci?ences公司;熒光標記大鼠抗小鼠單克隆抗體PE-Cy7-抗-CD5(53-7.3)、PE-抗-CD93(AA4.1)、PE-Cy7-抗-CD23(B3B4)、APC-Cy7-抗-IgM(RMM-1)、APC-Cy7-抗-CD27(LG.3A10)及各熒光抗體的同型對照抗體,購自美國Biolegend公司;紅細胞裂解液(貨號:CC051),購自中科邁晨科技有限公司;牛血清白蛋白(貨號:V900933),購自美國Sigma-Aldrich公司;其他生化試劑,購自北京化工廠。5424R臺型離心機,購自德國Eppendorf公司;FACSCantoTMⅡ流式細胞儀,購自美國BD Bio?sciences公司。
利用0.5 mm直徑毛細玻璃管穿刺小鼠眼眶后靜脈叢,采集外周血到乙二胺四乙酸二鉀抗凝管中,取100 μL外周血到2 mL離心管中,加入1 mL紅細胞裂解液裂解紅細胞,4℃,300×g離心5 min,棄上清,然后重復(fù)1次裂解和離心,并棄上清;然后頸椎脫臼處死小鼠,利用注射器向小鼠腹腔注射5 mL細胞培養(yǎng)用磷酸鹽緩沖液(0.1 mol·L-1PBS,pH 7.4),輕柔推動小鼠腹腔器官,3 min后,在小鼠腹腔中下部,剪開1個小口,讓小鼠腹腔中液體流到5 mL離心管中;再剪開小鼠腹腔,取脾和腹股溝淋巴結(jié),放到40 μm孔徑的尼龍濾網(wǎng)上,一邊滴加10 mL PBS溶液,一邊利用注射器內(nèi)芯研磨脾和淋巴結(jié)組織,制備脾和淋巴結(jié)單細胞懸液;最后剪取小鼠一側(cè)股骨,利用1 mL注射器吸取PBS后刺入股骨膝關(guān)節(jié)端,將骨髓細胞沖洗到2 mL離心管中;在將其他各種細胞懸液吹散后,取1 mL腹腔灌洗液、100 μL脾細胞懸液、2 mL淋巴結(jié)細胞懸液、100 μL骨髓細胞懸液到2 mL離心管中(均為5×105~1×106),加入1 mL紅細胞裂解液裂解紅細胞,4℃,300×g離心5 min,棄上清。從裂解紅細胞步驟開始,每只小鼠的每種細胞樣本均制備3份。
在制備好的外周血細胞、腹膜腔細胞、脾細胞、淋巴結(jié)細胞和骨髓細胞中,加入2 mL流式染色緩沖液(含0.2%牛血清白蛋白的PBS)清洗細胞,然后4℃,300×g離心5 min,棄上清,再加入200 μL流式染色緩沖液重懸細胞;每種細胞樣本中加入抗CD16/CD32抗體0.5 μg封閉IgG抗體受體,冰浴孵育15 min;然后每只小鼠的每種細胞分別進行3種熒光抗體染色方案:①7-AAD、APC-抗-B220、PECy7-抗-CD5和PE-抗-CD11b染色(主要為區(qū)分B1和B2細胞亞群);② 7-AAD、APC-抗-B220、FITC-抗-CD43、PE-抗-CD93、PE-Cy7-抗-CD23和APCCy7-抗-IgM染色(主要為區(qū)分各種不成熟和成熟B細胞亞群);③ 7-AAD、APC-抗-B220、APC-Cy7-抗-CD27和PE-抗-CD138染色(主要為區(qū)分記憶性B細胞和漿細胞亞群);7-AAD按說明書推薦量加入細胞樣本中,各種熒光抗體加入各個樣本的量均為0.2 μg,另外設(shè)置空白染色管、每種熒光抗體的單標管和3種染色方案的同型對照抗體管,將所有樣本與抗體混合均勻后冰浴30 min;最后加入1 mL流式染色緩沖液清洗細胞,4℃,300×g離心5 min,棄去上清,再重復(fù)清洗1次,棄上清,加入400 μL流式染色緩沖液重懸細胞。
在將流式細胞儀調(diào)試到工作狀態(tài)后,利用空白染色樣本、同型對照樣本、每種熒光抗體的單標管樣本設(shè)置3種染色方案的前向和側(cè)向散射光電壓值、7-AAD和各種熒光染色的電壓值,然后設(shè)置好各熒光通道之間的熒光補償;最后收集各樣本細胞的前側(cè)向散射光和7-AAD及各種熒光抗體染色信號;在測定過程中,通過前側(cè)向散射光設(shè)置P1門,以去除細胞碎片和殘存的紅細胞,收集1×104個P1門細胞的檢測信息。
利用Flowjo7分析流式細胞檢測的源文件,分析各種細胞樣本中B細胞在總細胞中的比例,同時也分析各種B細胞亞群在總B細胞中所占的比例,并用流式散點圖和直方圖表示;另外,利用Graph?Pad Prism 5.0分析各種組織細胞中的B細胞及B細胞亞群比例平均值的95%置信區(qū)間。
外周血經(jīng)2次裂解紅細胞和3種熒光抗體染色方案染色后,利用流式細胞術(shù)進行測定,通過7-AAD排除易受到非特異性染色的死細胞后,B220+的B細胞占總細胞的25%~58%,B220+CD5+的B1a細胞、B220+CD5-CD11b+的B1b細胞和B220+CD5-CD11b-的B2細胞分別占總B細胞的比例為3.0%~36%,1.8%~2.5%和60%~98%(圖1A和D)。B220+CD93+CD23-IgM+的未成熟B細胞和B220+CD93-CD23+IgMlow的成熟B細胞分別占總B細胞的比例為11%~22%和39%~49%(圖1B和D)。B220+CD27+CD138-的記憶性B細胞和B220+CD27-CD138+的漿細胞分別占總B細胞的比例為0.2%~8.0%和0.3%~8.8%(圖1C和D)。
腹膜腔細胞經(jīng)離心濃縮、裂解紅細胞和3種熒光抗體染色方案染色后,利用流式細胞術(shù)進行測定,通過7-AAD排除容易受到非特異性染色的死細胞后,B220+的B細胞占總細胞的40%~57%,B220+CD5+的B1a細胞、B220+CD5-CD11b+的B1b細胞和B220+CD5-CD11b-的B2細胞分別占總B細胞的比例為26%~91%,1.1%~27%和7.6%~46%(圖2A和D)。B220+CD27+CD138-記憶性B細胞和B220+CD27-CD138+的漿細胞分別占總B細胞的比例為1.2%~2.8%和1.1%~2.8%(圖2C和D)。
Fig.1 Percentages of B cells and B-cell subgroups in peripheral blood of mice analyzed with flow cytometry.Peripheral blood was collected and red cells were depleted by osmotic lysis.The remaining cells were stained with three combinations of fluores?cent dye and fluorescent-conjugated antibodies.A:7-AAD,APC-anti-B220,PE-Cy7-anti-CD5 and PE-anti-CD11b;B:7-AAD,APC-anti-B220,F(xiàn)ITC-anti-CD43,PE-anti-CD93,PE-Cy7-anti-CD23 and APC-Cy7-anti-IgM;C:7-AAD,APC-anti-B220,APC-Cy7-anti-CD27 and PE-anti-CD138;D:percentages of B cells in total cells and percentages of B-cell subgroups in B cells.PC:plasma cells.
Fig.2 Percentages of B cells and B-cell subgroups in peritoneal cavity of mice analyzed with flow cytometry.Cells in the peritoneal cavity were collected with 5 mL PBS lavage,and red cells were depleted by osmotic lysis.The remaining cells were stained with three combinations of fluorescent dye and fluorescent-conjugated antibodies.A:7-AAD,APC-Anti-B220,PE-Cy7-anti-CD5 and PE-anti-CD11b;B:7-AAD,APC-anti-B220,F(xiàn)ITC-anti-CD43,PE-anti-CD93,PE-Cy7-anti-CD23 and APC-Cy7-anti-IgM;C:7-AAD,APC-anti-B220,APC-Cy7-anti-CD27 and PE-anti-CD138;D:percentages of B cells in total cells and percentages of B-cell subgroups in B cells.
脾經(jīng)研磨制備為單細胞懸液并裂解紅細胞后,通過3種熒光抗體染色方案染色,然后利用流式細胞術(shù)進行測定,通過7-AAD排除易受到非特異性染色的死細胞后,B220+的B細胞占總細胞的52%~61%,B220+CD5+的B1a細胞、B220+CD5-CD11b+的B1b細胞和B220+CD5-CD11b-的B2細胞分別占總B細胞的比例為13%~19%,2.1%~3.1%和79%~85%(圖3A和D)。B220+CD43-CD93+CD23-IgM-的Pre-B細胞、B220+CD43-CD93+CD23-IgM+的T1 B細胞、B220+CD43-CD93+CD23+IgM+的T2 B細胞、B220+CD43-CD93+CD23+IgMlow的T3 B細胞、不成熟B 細胞(T1+T2+T3)、B220+CD43-CD93-CD23+IgMlow的成熟B細胞和B220+CD43-CD93-CD23-IgM+的邊緣區(qū) B細胞(marginal B)等7種B細胞亞群分別占總B細胞的比例為0.19%~0.74%,3.7%~4.0%,1.8%~2.7%,0.38%~0.76%,6.2%~7.1%,54%~59%和6.5%~11%(圖3B和D)。B220+CD27+CD138-的記憶性B細胞和B220+CD27-CD138+的漿細胞分別占總B細胞的比例為2.0%~3.4%和0.9%~1.2%(圖3C和D)。
腹股溝淋巴結(jié)經(jīng)研磨制備為單細胞懸液并裂解紅細胞后,通過3種熒光抗體染色方案染色,然后利用流式細胞術(shù)進行測定,通過7-AAD排除容易受到非特異性染色的死細胞后,B220+的B細胞占總細胞的4.6%~36%,B220+CD5+的B1a細胞、B220+CD5-CD11b+的 B1b 細胞和B220+CD5-CD11b-的B2細胞分別占總B細胞的比例為4.6%~26%,1.3%~2.9%和72%~92%(圖4A和D)。B220+CD43-CD93-CD23+IgMlow的成熟B細胞占總B細胞的比例為61%~71%(圖4B和D)。B220+CD27+CD138-的記憶性B細胞和B220+CD27-CD138+的漿細胞分別占總B細胞的比例為2.6%~3.3%和0.9%~2.6%(圖4C和D)。
Fig.3 Percentages of B cells and B-cell subgroups in spleen analyzed with flow cytometry.The spleen was dissected,homogenized,and passed through a 40 μm mesh to generate single-cell suspension.Red cells were depleted by osmotic lysis.The remaining splenocytes were stained with three combinations of fluorescent dye and fluorescent-conjugated antibodies.A:7-AAD,APC-anti-B220,PE-Cy7-anti-CD5 and PE-anti-CD11b;B:7-AAD,APC-anti-B220,F(xiàn)ITC-anti-CD43,PE-anti-CD93,PE-Cy7-anti-CD23 and APC-Cy7-anti-IgM;C:7-AAD,APC-anti-B220,APC-Cy7-anti-CD27 and PE-anti-CD138;D:percentage of B cells in total cells and percentages of B-cell subgroups in B cells analyzed.
Fig.4 Percentages of B cells and B-cell subgroups in lymph node with flow cytometry.The inguinal lymph node cells were removed,homogenized,and passed through a 40 μm mesh to generate single-cell suspension.Red cells were depleted by osmotic lysis.The remaining cells were stained with three combinations of fluorescent dye and fluorescent-conjugated antibodies.A:7-AAD,APC-anti-B220,PE-Cy7-anti-CD5 and PE-anti-CD11b;B:7-AAD,APC-anti-B220,F(xiàn)ITC-anti-CD43,PE-anti-CD93,PE-Cy7-anti-CD23 and APC-Cy7-anti-IgM;C:7-AAD,APC-anti-B220,APC-Cy7-anti-CD27 and PE-anti-CD138;D:percentage of B cells in total cells and percentages of B-cell subgroups in B cells analyzed.
Fig.5 Percentages of B cells and B-cell subgroups in bone marrow analyzed with flow cytometry.The bone marrow cells were flushed out from bone marrow of femur.Red cells were depleted by osmotic lysis.The remaining cells were stained with three combinations of fluorescent dye and fluorescent-conjugated antibodies.A:7-AAD,APC-anti-B220,PE-Cy7-anti-CD5 and PE-anti-CD11b;B:7-AAD,APC-anti-B220,F(xiàn)ITC-anti-CD43,PE-anti-CD93,PE-Cy7-anti-CD23 and APC-Cy7-anti-IgM;C:7-AAD,APC-anti-B220,APC-Cy7-anti-CD27 and PE-anti-CD138;D:percentage of B cells in total cells and percentages of B-cell subgroups in B cells.
收集股骨骨髓細胞并吹散為單細胞懸液以及裂解紅細胞后,通過3種熒光抗體染色方案染色,然后利用流式細胞術(shù)進行測定,通過7-AAD排除易受到非特異性染色的死細胞后,B220+的B細胞占總細胞的29%~46%,B220+CD5+的B1a細胞、B220+CD5-CD11b+的B1b細胞和B220+CD5-CD11b-的B2細胞分別占總B細胞的比例為0.9%~4.6%,5.5%~12%和82%~92%(圖5A和D)。B220+CD43+CD93+CD23-IgM-的pro-B細胞、B220+CD43-CD93+CD23-IgM-的 pre-B 細胞、B220+CD43-CD93+CD23-IgM+的T1 B細胞、B220+CD43-CD93+CD23+IgM+的 T2 B 細胞、B220+CD43-CD93+CD23+IgMlow的T3 B細胞、不成熟B細胞(T1+T2+T3)和B220+CD43-CD93-CD23+IgMlow的成熟B細胞等7種B細胞亞群分別占總B細胞的比例為0.8%~3.9%,35%~54%,19%~36%,0.1%~2.4%,0.7%~1.3%,20%~40%和5.9%~8.9%(圖5B和D)。B220+CD27+CD138-的記憶性B細胞和B220+CD27-CD138+的漿細胞分別占總B細胞的比例為0.4%~1.6%和0.3%~2.1%(圖5C和D)。
通過多參數(shù)和多種組織中B細胞及其亞群的流式細胞分析,本研究可以很好地觀察到各種B細胞亞群標志物的特異性。對于第①種區(qū)分B1a,B1b和B2細胞的染色方案,CD5主要表達在B1a細胞和T細胞表面,CD11b主要表達在B1細胞、粒細胞、單核細胞和巨噬細胞表面。因此,首先要利用B220準確設(shè)門圈定B細胞,然后再根據(jù)CD5和CD11b確定B1a,B1b和B2細胞。然而,對于腹膜腔B細胞,由于富含B220表達水平低的B1細胞,僅利用B220設(shè)門的直方圖不易將B細胞和非B細胞區(qū)分開,可以通過前側(cè)向散射光去除巨噬細胞群或B220和CD11b二維散點圖去除CD11b強陽性的巨噬細胞,再設(shè)門確定B1a,B1b和B2細胞的比例。
對于第②種主要區(qū)分不成熟和成熟B細胞亞群的染色方案,CD43主要表達于B1細胞、pro-B細胞、中性粒細胞、單核細胞和巨噬細胞上,CD93表達于pro-B、pre-B和各種不成熟B細胞上,CD23表達主要表達于成熟B細胞上,同時也表達于T2和T3期不成熟B細胞上,IgM表達于不成熟和成熟B細胞上,其中T3期B細胞和成熟B細胞表達低水平IgM。在通過B220設(shè)門去除非B細胞后,再利用CD93,CD23和IgM的表達情況可以確定各種原始B細胞、不成熟B細胞、成熟B細胞和邊緣區(qū)B細胞亞群比例。但本研究在這種染色方案中發(fā)現(xiàn)幾個問題。首先,外周血中不成熟B細胞,主要是約占15%的CD43+CD93+CD23-IgM+細胞,這不同于骨髓中不成熟B細胞,骨髓中B細胞是由CD43+CD93+CD23-IgM-的 pro-B 細胞、CD43-CD93+CD23-IgM-的pre-B細胞和CD43-CD93+CD23-/+IgM+的不成熟B細胞逐次發(fā)育而來,外周血中CD43+CD93+CD23-IgM+細胞可能是由骨髓中pro-B細胞進入外周血直接發(fā)育而來,在出現(xiàn)IgM表達后CD43還未消失,或者骨髓不成熟B細胞進入外周血后CD43暫時性的表達。其次,脾和淋巴結(jié)中存在一種B220+CD43+CD93-CD23+IgMlow的細胞亞群,其可能不是pro-B細胞,而是一種特殊的成熟B細胞亞群或漿細胞樣樹突狀細胞,具體類型還需要進一步研究。第三,CD93較特異表達于pro-B、pre-B和不成熟B細胞,但發(fā)現(xiàn)在腹膜腔巨噬細胞上高表達CD93,由于腹膜腔巨噬細胞和B1細胞也同時高表達CD43,因此,第②種染色方案不適合區(qū)分腹膜腔中早期發(fā)育階段的B細胞,但可結(jié)合第①種染色方案區(qū)分B1和B2細胞。最后值得一提的是,在外周血和脾細胞中,有一群特別高表達IgM的成熟B細胞亞群,可能是IgM陽性的記憶性B細胞。
第③種染色方案主要用于區(qū)分記憶性B細胞和漿細胞,其中CD27主要表達于記憶性B細胞和T細胞上,CD138主要表達于漿細胞和上皮細胞上,在利用B220準確設(shè)門圈定B細胞后,該種染色方案可以較特異性地分析各種組織中記憶性B細胞和漿細胞。除此之外,可以結(jié)合第②種染色方案中IgM抗體染色以及IgG抗體染色,進一步對記憶性B細胞進行特異性標記和亞群分類。同時也可以利用更多檢測參數(shù)提高漿細胞檢測的特異性。
綜合3種熒光抗體染色方案,本研究特異準確地揭示了各種B細胞亞群在各種組織中的的定量分布情況:外周血中主要包含成熟B細胞和一種特殊的不成熟B細胞;腹膜腔中主要包含B1a細胞和成熟B細胞;脾中主要包含成熟B細胞、邊緣區(qū)B細胞、T1和T2期不成熟B細胞;淋巴結(jié)中主要包含成熟B細胞;骨髓中包含各種發(fā)育階段B細胞,主要包含pre-B細胞和T1期不成熟B細胞,同時也是唯一含有較多pro-B細胞的組織。記憶性B細胞和漿細胞在各種組織中都只占B細胞的較小比例,均≤3%,在外周血、淋巴結(jié)和脾中含有相對較高的記憶性B細胞(>2%),在腹膜腔中含有相對較高的漿細胞(1.76%)。另外,特別值得關(guān)注的是外周血中CD43+CD93+CD23-IgM+不成熟B細胞和脾及淋巴結(jié)中存在的B220+CD43+CD93-CD23+IgMlow的細胞亞群,其更多的細胞特征和功能還需要進一步研究。本研究共檢測了6只8周齡雄性BALB/c小鼠的B細胞亞群組織分布,實驗個體之間數(shù)據(jù)變異很小,結(jié)果可信度高。當然,如果繼續(xù)增加實驗動物數(shù)量和不同性別、不同年齡及種屬動物的B細胞亞群組織分布分析,將能為B細胞研究提供更多基礎(chǔ)資料。
綜上所述,通過不同組織中B細胞亞群及非B細胞亞群表面多種表面標志物表達,可以根據(jù)需要檢測的具體組織和細胞類型,選擇合適的標志物和設(shè)門方法進行優(yōu)化的B細胞亞群分析。如果設(shè)備、試劑條件許可及實驗需要,也可以利用更多參數(shù)進行一次性流式檢測分析,在準確分析B細胞亞群及其在各種組織中分布的同時,分析各種B細胞亞群的活化、增殖和細胞內(nèi)蛋白表達變化,從而更好地用于免疫調(diào)控藥物活性評價和作用機制研究。