李文協(xié),李學鵬,*,劉慈坤,王金廂,朱文慧,徐永霞,儀淑敏,勵建榮,李婷婷,牟偉麗,郭曉華

(1.渤海大學食品科學與工程學院,生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯(lián)合工程研究中心,國家魚糜及魚糜制品加工技術研發(fā)分中心,遼寧錦州 121013;2.大連民族大學生命科學學院,遼寧大連 116600;3.蓬萊京魯漁業(yè)有限公司,山東煙臺 265600;4.山東美佳集團有限公司,山東日照 276815)

近幾年,我國魚糜制品年產量達到150多萬噸,行業(yè)產值規(guī)模已超過200億元,成為水產品加工業(yè)中發(fā)展最快的行業(yè)門類之一[1]。我國鲅魚的年捕獲量約40多萬噸,是生鮮海水產品中的重要組成部分[1]。目前鲅魚主要以鮮銷和凍品為主,部分鲅魚也會被制成咸干制品如熏鲅魚片、鲅魚罐頭等產品。為了提升鲅魚的經濟價值,常將鲅魚制作成冷凍魚糜,但是由于鲅魚肌肉中的紅肉部分含量較高,導致生產的魚糜色澤較暗,且存在腥味重等問題,嚴重影響其感官品質和銷售范圍。

臭氧不僅是一種可直接接觸食品、公認安全、廣譜高效的殺菌劑,還因本身具有強氧化性,常在水產品加工中作為漂白劑和脫腥劑使用。Zhang等[2]用臭氧水漂洗鳙魚魚糜,發(fā)現(xiàn)其土腥味物質顯著降低。Zhang等[3]發(fā)現(xiàn)白鰱魚糜用8 mg/L的臭氧水漂洗后白度值提高,而凝膠性能不受影響。目前臭氧水在淡水魚糜加工方面的研究較多,而其對海水魚魚糜的影響仍鮮見報道。此外,由于臭氧在水中可發(fā)生氧化還原反應,生成具有較高反應活性的羥自由基、超氧陰離子自由基及氫化臭氧自由基等多種活性氧自由基,這些活性氧自由基可作用于蛋白質引發(fā)氧化效應,最終導致半胱氨酸、色氨酸、酪氨酸等氨基酸側鏈修飾、蛋白質構象變化、蛋白質交聯(lián)或降解等變化[4]。隨著臭氧在食品加工中的應用越來越廣泛,臭氧引起的蛋白質氧化也逐漸被關注[5]。Segat等[6]研究了高濃度臭氧處理對乳清分離蛋白結構和功能性質的影響,發(fā)現(xiàn)臭氧處理導致乳清分離蛋白活性巰基含量減少,α-螺旋顯著增多,起泡性顯著提高,而溶解性和乳化性降低。Zhang等[7]研究發(fā)現(xiàn)適度臭氧處理可以提高鳙魚肌原纖維蛋白羰基含量和凝膠強度。Jiang等[8]發(fā)現(xiàn)輕度臭氧處理后鰱魚肌球蛋白羰基含量、表面疏水性增加,巰基含量減少,α-螺旋顯著減少,蛋白質結構展開并發(fā)生一定的交聯(lián)。但目前臭氧水漂洗引起的鲅魚魚糜肌原纖維蛋白氧化效應尚未見報道。鑒于此,本研究用不同濃度的臭氧水漂洗鲅魚魚糜,通過分析漂洗前后鲅魚魚糜的色澤、風味等感官品質以及肌原纖維蛋白結構性質的變化,探究臭氧處理對鲅魚魚糜品質及其肌原纖維蛋白氧化的影響規(guī)律,以期為臭氧水漂洗在鲅魚魚糜品質改良中的應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

冷凍鲅魚(體重0.5～0.6 kg) 錦州市第一綜合農貿市場;磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鉀、氯化鈉、氫氧化鈉、硫酸銅、鹽酸胍、乙酸乙酯、乙醇、尿素、三氯乙酸(TCA)、酒石酸鉀鈉、5,5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(5,5′-Dithiobis-(2-nitrobenzoic acid),DTNB)、2,4-二硝基苯肼(2,4-dinitrophenylhydrazone,DNPH)、乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA)、8-苯胺基-1-萘磺酸銨(8-Anilino-1-naphthalenesulfonate,ANS)、2(β)-巰基乙醇、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、甘氨酸等 均為分析純,錦州藥業(yè)集團器化玻有限公司;SDS-PAGE凝膠制備試劑盒 北京索萊寶科技有限公司。

Chroma Meter CR 400色差儀 日本Konica-Minolta公司;PEN3便攜式電子鼻系統(tǒng) 德國Airsense公司;固相微萃取裝置、50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭、20 mL頂空鉗口樣品瓶 美國Supelco公司;7890N/5975GC-MS聯(lián)用儀 美國Agilent公司;DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鄭州長城科工貿有限公司;UV-2550紫外可見光分光光度計 島津儀器(蘇州)有限公司;970CRT熒光分光光度計 上海精密科學儀器有限公司;LabRAM HR Evolution共焦拉曼光譜儀 堀場(中國)貿易有限公司;Mini Protran 3凝膠電泳儀 美國Bio-Rad公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 臭氧水的制備 參考劉慈坤[9]的方法,采用TK-DJ-S08型臭氧發(fā)生器制備臭氧水,用碘量法測定臭氧水的濃度,然后將臭氧水的濃度稀釋為0、2、4、6、8和10 mg/L。

1.2.2 鲅魚魚糜的制備 把冷凍的鲅魚流水解凍后去除頭部、尾部和內臟淤血等,用刀沿魚背部將魚分成兩半,然后用采肉機將魚肉與魚骨、魚皮分離;進行第一次漂洗,按照魚肉∶冷蒸餾水=1∶5 (w/v)混合攪拌漂洗15 min,接著將混合液倒入過濾網兜,放入脫水機中脫水2000 r/min,脫水5 min;再用臭氧水進行第二次漂洗,按照魚肉∶臭氧水=1∶5 (w/v)混合攪拌漂洗15 min(先將稱量的魚肉放入容器中,然后將稱量的臭氧水倒入容器中),然后將混合液倒入過濾網兜,放入脫水機中脫水2000 r/min,脫水5 min;最后用含有0.15% NaCl溶液對魚肉進行第三次漂洗,按照魚肉∶NaCl溶液=1∶5 (w/v)混合攪拌漂洗15 min,然后將混合液倒入過濾網兜,放入脫水機中脫水2000 r/min,脫水15 min,使魚糜水分含量在78%左右。將得到的魚糜過精濾機,然后過斬拌機加入4%(w/w)的白砂糖和4%(w/w)山梨糖醇,在0～4 ℃溫度下斬拌1 min,真空包裝放在-80 ℃冰箱備用。在整個實驗過程中,魚肉樣品的溫度保持在10 ℃以下。

1.2.3 鲅魚魚糜色澤的測定 將鲅魚魚糜放到直徑10 cm的培養(yǎng)皿中鋪展平整,利用色差計測定樣品的色澤。首先用標準白板進行校準,在室溫下每個樣品隨機測定4個不同位置的色澤作為平行。L*為亮度值;a*為紅度值(正值表示偏紅,負值表示偏綠);b*為黃度值(正值表示偏黃,負值表示偏藍)。白度值(W)由公式(1)計算得到。

式(1)

1.2.4 電子鼻測定 準確稱取鲅魚魚糜樣品5.0 g,放入50 mL的離心管中,迅速用5層保鮮膜封口,然后置于4 ℃冰箱中靜置30 min,用于電子鼻檢測。檢測條件:電子鼻清洗時間為100 s,測定時間120 s;頂空溫度25 ℃;內部流量300 mL/min;進樣流量300 mL/min。每個樣品重復測定4次。主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)使用PEN3電子鼻的Win Muster軟件處理穩(wěn)定后第105～107 s的數(shù)據(jù)信息。

1.2.5 固相微萃取-氣相色譜-質譜檢測(SPME-GC-MS) 固相微萃取:將2.5 g魚糜樣品放入20 mL頂空瓶中,加入6 mL飽和氯化鈉溶液、2 μL標準品無水乙醇環(huán)己酮(5 mL無水乙醇+5 μL環(huán)己酮),立即加蓋;將頂空瓶放于45 ℃水浴磁力攪拌器中平衡15 min。用已經活化的DVB/CAR/PDMS 50/30 μm萃取針(270 ℃活化60 min)頂空吸附40 min,然后將萃取針插入GC進樣口,解吸5 min。

氣相色譜-質譜分析:參考崔方超等[10]的方法,氣相色譜條件:HP-5MS毛細管柱(40 m×0.25 mm,0.25 μm);進樣口溫度250 ℃;不分流模式進樣;載氣為He;流速1.0 mL/min;程序升溫:柱初溫40 ℃,保持2 min,以4 ℃/min 升至160 ℃,保持1 min再以10 ℃/min升至250 ℃,保持5 min。質譜條件:GC-MS接口溫度280 ℃;離子源溫度230 ℃;四極桿溫度150 ℃;電離方式:EI;電子能量70 eV;質量掃描范圍30～550(m/z)。揮發(fā)性物質的定性分析利用C5～C25正構烷烴的匹配質譜及對計算機譜庫(NIST 11/Wiley 7.0)進行檢索。

1.2.6 肌原纖維蛋白的提取 參考劉慈坤[9]的方法,提取肌原纖維蛋白。采用雙縮脲法測定蛋白濃度。

1.2.7 羰基含量的測定 參考Oliver等[11]的方法進行測定。用10 mmol/L Tris-HCl緩沖液(含0.6 mol/L NaCl,pH7.2)將提取的肌原纖維蛋白配制成5 mg/mL蛋白溶液,取1 mL肌原纖維蛋白溶液放入50 mL塑料離心管并加入1 mL 10 mmol/L DNPH溶液(含2 mol/L HCl),室溫條件下避光靜置1 h(每15 min,振蕩一次),添加3 mL 20%的TCA后10000 r/min離心5 min,棄上清液,用1 mL乙酸乙酯-乙醇(V/V=1∶1)清洗沉淀3次后,加入5 mL 6 mol/L鹽酸胍溶液,37 ℃保溫30 min使沉淀溶解,10000 r/min離心5 min去除不溶物,所得溶液于370 nm波長下測定吸光度。每個處理組測定3次。

1.2.8 總巰基含量的測定 參考Yongsawatdigul等[12]的方法測定總巰基含量。用10 mmol/L Tris-HCl緩沖液(含0.6 mol/L NaCl,pH7.2)將提取的肌原纖維蛋白配制成5 mg/mL蛋白溶液,取0.5 mL蛋白溶液加入含有4.5 mL 50 mmol/L磷酸緩沖液(含8 mol/L尿素、0.6 mol/L KCl、10 mmol/L EDTA,pH7.0)適當混勻后,加入0.5 mL 10 mmol/L DTNB,然后將混合液在25 ℃保溫30 min,在412 nm下測定吸光度。每個處理組測定3次。

1.2.9 內源熒光分析 準確量取5 mg/mL的蛋白液1 mL加入9 mL磷酸鹽緩沖液(50 mmol/L、pH7.0)。采用F96型熒光分光光度計測定光譜。測定條件為:激發(fā)波長290 nm,掃描范圍 300～450 nm,激發(fā)狹縫寬度設置為5 nm,發(fā)射縫寬度設置為10 nm,靈敏度為3。

1.2.10 表面疏水性測定 參考Saeed等[13]的方法并加以修改。將蛋白樣品用20 mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液(含0.6 mol/L KCl,pH7.0)稀釋至0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL,取上述濃度樣品4 mL,再與50 μL 8 mmol/L ANS混合均勻,避光靜置10 min,熒光分光光度計測定條件為:激發(fā)波長374 nm,掃描范圍400～500 nm,激狹縫寬度設置為5 nm,發(fā)射縫寬度設置為10 nm,靈敏度為2。熒光強度對蛋白濃度作圖所得斜率為表面疏水性。每個處理組測定3次。

1.2.11 拉曼光譜分析 參考Shao等[14]的方法,采用LabRAM HR Evolution拉曼光譜儀測量,獲取的拉曼光譜在400～3600 cm-1。測試完成后用軟件Labspec5對光譜進行平滑,根據(jù)苯丙氨酸環(huán)在1003 cm-1附近伸縮振動強度作為內標進行歸一化。根據(jù)酰胺I帶的變化,采用Alix等[15]的方法計算蛋白質二級結構(α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規(guī)則卷曲)含量。并且通過對760、830、850 cm-1附近的拉曼譜帶的頻率和強度的變化來確定三級結構的變化。每個處理組測定3次。

1.2.12 SDS-PAGE分析 參考Xiong等[16]的方法并加以修改,用10 mmol/L Tris-HCl緩沖液(含0.6 mol/L NaCl,pH7.2)將提取的肌原纖維蛋白配制成4 mg/mL蛋白溶液,取樣品溶液與樣品緩沖液按1∶1 (V/V)比例混合,沸水浴15 min。制膠后(其中濃縮膠濃度4%,分離膠濃度12%),上樣10 μL,初始電壓80 V,待樣品進到分離膠時,在120 V恒壓下進行凝膠電泳實驗。電泳完成后用0.25%的考馬斯亮藍染色40 min,脫色至條帶清晰,最后運用Quantity One軟件進行分析和處理。

1.3 數(shù)據(jù)分析

每組實驗重復3次,以平均值±標準誤差的方式表示。采用SPSS statistics 19.0軟件使用ANOVA分析的鄧肯檢驗進行數(shù)據(jù)顯著性差異分析(P<0.05),數(shù)據(jù)繪圖使用Origin 8.5軟件。

2 結果與分析

2.1 臭氧水漂洗對鲅魚魚糜色澤的影響

表1 臭氧水漂洗對鲅魚魚糜色澤的影響Table 1 Effect of ozone water rinsing on the color of Spanish mackerel surimi

Zhang等[3]發(fā)現(xiàn)臭氧水漂洗后的鰱魚魚糜白度明顯增加,劉慈坤[9]發(fā)現(xiàn)草魚魚糜經臭氧水漂洗后白度也有所增加,這與本研究結果較為一致。臭氧水漂洗使魚糜白度增加主要原因是臭氧水自身的強氧化性不僅可去除多數(shù)水溶性色素,而且臭氧與水反應產生的活性氧自由基能夠破壞肌紅蛋白和血紅蛋白的卟啉結構[18],進而去除動物血液和肌肉中的主要色素物質—血紅素。由于6 mg/L臭氧水漂洗的鲅魚魚糜白度值相較對照組顯著提高(P<0.05),且6、8、10 mg/L的實驗組白度值之間差別不大,表明臭氧水在6 mg/L以上濃度時能較好的提高鲅魚魚糜白度值。

2.2 臭氧水漂洗對鲅魚魚糜氣味特征的影響

電子鼻是一種新型電化學傳感器系統(tǒng),可以用于分析、識別和檢測揮發(fā)性成分。PEN3電子鼻系統(tǒng)含有10個不同的金屬氧化半導體傳感器R(1)～R(10),分別對芳香族化合物、氮氧化合物、氨類、氫化物、短鏈烷烴、甲基化合物、無機硫化物、醇類、有機硫化物和長鏈烷烴具有敏感響應。由表2可知,所有傳感器響應值中,對照組(0 mg/L)樣品的R(2)響應值最大,其次是R(6)、R(5)、R(1)、R(3)、R(10)、R(9)、R(8)響應值。隨著臭氧水濃度的增加,R(1)、R(3)、R(5)、R(6)和R(9)響應值均顯著降低,表明魚糜中芳香族化合物、氨類、短鏈烷烴、甲基化合物及有機硫化合物含量顯著降低,而這些物質均對魚腥味有貢獻,這說明臭氧水漂洗能夠有效去除鲅魚魚糜的魚腥味。這一結果主要歸因于臭氧的強氧化性導致許多長鏈有機化合物發(fā)生分解[3]。

表2 不同濃度臭氧水漂洗對鲅魚魚糜的電子鼻傳感器響應值的影響Table 2 Effect of ozone water rinsing on electronic nose sensors response valves of Spanish mackerel surimi

主成分分析(Principal component analysis,PCA)方法可以識別各組成變量的相關性分析及主要貢獻因素。對不同濃度臭氧水漂洗的魚糜電子鼻數(shù)據(jù)進行PCA分析,由圖1可知,第一主成分和第二主成分的貢獻率分別達到94.43%和5.16%,總貢獻為99.59%,大于85%,符合PCA 分析要求。不同濃度臭氧水漂洗的鲅魚魚糜的氣味值分布在不同區(qū)域,沒有相互重疊且距離較遠。這表明電子鼻的主成分分析能夠有效區(qū)分不同濃度臭氧水漂洗的鲅魚魚糜的氣味特征,同時說明不同濃度臭氧水漂洗的鲅魚魚糜氣味特征具有顯著差異。

圖1 不同濃度臭氧水漂洗的鲅魚魚糜的電子鼻PCA圖Fig.1 PCA plot of Spanish mackerel surimi rinsed with different concentrations of ozone water

2.3 臭氧水漂洗對鲅魚魚糜揮發(fā)性物質的影響

為進一步驗證臭氧水漂洗對鲅魚魚糜風味的影響,采用GC-MS對不同濃度臭氧水漂洗的鲅魚魚糜樣品中揮發(fā)性物質的種類及含量進行了檢測。由表3可知,所有魚糜樣品中共鑒定出36種揮發(fā)性化合物,根據(jù)它們的化學性質將其分類,包括5種醛類、1種酮類、5種醇類、3種烯烴類、2種硫醚類、3種酯類、5種芳香族化合物和12種烷烴類物質。經0、2、4、6、8和10 mg/L臭氧水漂洗后的鲅魚魚糜中檢測到的揮發(fā)性化合物的數(shù)量分別為27、12、10、11、18和14。

表3 不同濃度臭氧水漂洗對鲅魚魚糜揮發(fā)性物質的影響Table 3 Effect of ozone water rinsing on the volatile compounds of Spanish mackerel surimi

隨著臭氧水濃度的增加,鲅魚魚糜中醛類物質總含量先減少后增加。與對照組(0 mg/L)相比,2、4、6和8 mg/L臭氧水漂洗的鲅魚魚糜醛類物質總含量分別減少39.85%、49.91%、34.98%和18.21%;10 mg/L臭氧水漂洗的鲅魚魚糜中醛類物質含量比對照組增加1.86%,這可能是較高濃度臭氧水導致脂質氫過氧化物的分解和氨基酸的脫氨所致[19-20]。劉慈坤[9]發(fā)現(xiàn)用7或10 mg/L臭氧水處理草魚魚糜,壬醛和戊醛的峰面積有一定的上升。在醛類物質中己醛含量較多,各樣品組己醛含量占醛類總含量的74%～75%。這一結果和李婷婷等[21]對三文魚揮發(fā)性物質中己醛含量測定結果相似?？荡浯涞萚22]發(fā)現(xiàn)草魚肉中己醛含量很高,其閾值為4.5 μg/g,對草魚肉的風味形成有重要貢獻。

隨著臭氧水濃度的增加,鲅魚魚糜中醇類物質總含量先減少后增加。與對照組相比,2、4和6 mg/L臭氧水漂洗的鲅魚魚糜中醇類物質總含量分別減少43.07%、51.84%和33.65%;8和10 mg/L臭氧水漂洗的鲅魚魚糜中醇類物質比對照組增加0.14%和18.17%。飽和醇閾值高,鲅魚魚糜中含量少,對魚糜氣味的影響較弱;不飽和醇閾值較低,對魚糜氣味有影響。1-辛烯-3-醇的閾值很低,可以產生蘑菇氣味和土腥味[23]。Iglesias等[24]發(fā)現(xiàn)在大西洋竹莢魚肉中檢測到1-辛烯-3-醇、1-戊烯-3-醇的含量與魚肉脂肪的過氧化值、硫代巴比妥酸值呈現(xiàn)高度相關。徐永霞等[25]測定新鮮大菱鲆魚肉中的1-辛烯-3-醇、1-戊烯-3-醇的含量明顯高于腐敗樣品。

經過臭氧水漂洗的鲅魚魚糜中烯烴類和硫醚類物質與對照組相比明顯減少。2、4、6、8和10 mg/L臭氧水漂洗后鲅魚魚糜中烯烴類物質分別由對照組的2.817 μg/g,降為0.252、0.101、0.084、0.257和0.518 μg/g。烯烴類物質經氧化后可能產生醛類和酮類物質。二甲基二硫和二甲基三硫是魚肉中主要含硫化合物。Qian等[26]發(fā)現(xiàn)太平洋鱈魚和阿拉斯加鱈魚魚肉中含有豐富的二甲基三硫。硫醚類物質的減少和電子鼻的檢測中有機硫揮發(fā)物的響應值降低保持一致。

經過臭氧水漂洗的鲅魚魚糜中酯類與對照組相比明顯減少。酯類物質大多具有水果香味,本研究檢測到的酯類物質含量很少,對魚糜氣味影響較小。2 mg/L以上濃度臭氧水漂洗的鲅魚魚糜未檢測到芳香類物質。2、4 mg/L臭氧水漂洗的鲅魚魚糜中烷烴類物質很少;與對照組相比,6、8和10 mg/L臭氧水漂洗的鲅魚魚糜中烷烴物質分別減少70.68%、71.36%和67.42%。烷烴類物質氣味閾值高,對魚糜氣味影響很小。

總體來看,一定濃度的臭氧水漂洗能有效地降低鲅魚魚糜中魚腥味物質的種類和含量,有助于改善魚糜的整體風味,這與電子鼻分析結果基本一致。臭氧水對揮發(fā)性化合物的脫除作用可能歸因于臭氧水對其直接分解作用,也可能與臭氧破壞肌肉蛋白質與揮發(fā)性物質的結合作用有關。魚糜漂洗過程中,臭氧的強氧化作用一定程度上引發(fā)魚糜蛋白質氧化修飾,導致蛋白質的結構性質發(fā)生改變,進一步影響風味物質-蛋白質之間的相互作用。為驗證該假說,接下來對臭氧水漂洗后鲅魚魚糜肌原纖維蛋白的氧化情況進行了分析。

2.4 臭氧水漂洗對鲅魚魚糜肌原纖維蛋白羰基和總巰基含量的影響

氨基酸側鏈基團直接氧化成羰基衍生物是蛋白質氧化的主要途徑[27]。許多氨基酸側鏈基團容易被氧化劑修飾成羰基衍生物,因此,羰基已經被廣泛應用與評估蛋白質氧化修飾程度[28]。由圖2可知,隨著臭氧水濃度的增加,肌原纖維蛋白羰基含量有顯著增加的趨勢。與對照組相比,2和4 mg/L的臭氧水漂洗鲅魚魚糜的肌原纖維蛋白羰基含量增加不顯著(P>0.05);6、8、10 mg/L的臭氧水漂洗鲅魚魚糜的肌原纖維蛋白羰基含量比對照組顯著增加25.63%、54.12%、62.03%(P<0.05)。這說明臭氧水漂洗鲅魚魚糜能導致其肌原纖維蛋白氨基酸側鏈的氧化生成羰基衍生物。Zhang等[7]發(fā)現(xiàn)臭氧水漂洗后鳙魚魚糜的羰基含量顯著增加,與本研究結果一致。

圖2 臭氧水漂洗對鲅魚魚糜肌原纖維蛋白羰基和總巰基含量的影響Fig.2 Effect of ozone water rinsing on the carbonyl content and total sulfhydryl group content of myofibrillar proteins in Spanish mackerel surimi注:不同大寫字母代表各處理組間總巰基含量差異顯著,P<0.05;不同小寫字母代表各處理組間羰基含量差異顯著,P<0.05。

由于半胱氨酸對氧化環(huán)境有較高的靈敏性,因此巰基含量的變化也常被用作蛋白質氧化的標志[28]。由圖2可知,隨著臭氧水濃度的增加,肌原纖維蛋白總巰基含量總體呈降低趨勢。與對照組相比,2、6、8和10 mg/L臭氧水漂洗的鲅魚魚糜肌原纖維蛋白總巰基含量分別降低8.26%、11.69%、21.81%、21.36%(P<0.05)。Zhang等[2]用3.3和5.1 mg/L臭氧水漂洗鳙魚魚糜20 min后,與對照組(0 mg/L漂洗)相比,測定的肌原纖維蛋白總巰基含量沒有顯著變化(P>0.05);然而,用7.6 mg/L臭氧水漂洗鰱魚魚糜20 min后,相較于對照組總巰基含量顯著減少(P<0.05)。李學鵬等[30]研究發(fā)現(xiàn)在4 ℃冷藏的大菱鲆魚肉肌原纖維蛋白總巰基含量呈降低趨勢,并推測與巰基氧化有關。本研究中總巰基含量的減少可能與臭氧和水反應產生的·HO2和·OH有關,這些自由基導致巰基氧化形成了二硫鍵。高濃度臭氧水漂洗的鲅魚魚糜肌原纖維蛋白的總巰基含量顯著下降,羰基含量顯著增加(P<0.05)。

2.5 臭氧水漂洗對鲅魚魚糜肌原纖維蛋白色氨酸內源熒光強度的影響

多肽和蛋白質中的芳香族氨基酸,如酪氨酸、色氨酸、組氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸殘基容易被氧化修飾[5],進而改變蛋白質的內源熒光特性。其中,色氨酸熒光最強,是最容易被·OH、1O2和O3氧化修飾的氨基酸之一,因此內源性色氨酸熒光通常用作檢測蛋白質構象變化的標記物[5,31-32]。由圖3可知,鲅魚魚糜肌原纖維蛋白在335 nm處有最大熒光吸收。與對照組相比,2、4 mg/L臭氧水漂洗的鲅魚魚糜肌原纖維蛋白內源熒光強度有少許降低;6、8和10 mg/L臭氧水處理組內源熒光強度明顯減少。內源熒光強度的降低可能是臭氧的強氧化性破壞了肌原纖維蛋白的構象,導致蛋白質發(fā)生去折疊和展開,色氨酸殘基暴露在極性環(huán)境中,并發(fā)生一定程度的熒光猝滅。李學鵬等[33]發(fā)現(xiàn)羥基自由基氧化的草魚肌原纖維蛋白的內源熒光強度,隨著H2O2濃度的增加而顯著降低。隨著臭氧水濃度的增加,肌原纖維蛋白內源熒光強度呈顯著降低趨勢。

圖3 不同濃度臭氧水漂洗對鲅魚魚糜肌原纖維蛋白色氨酸內源熒光強度的影響Fig.3 Effect of ozone water rinsing on the tryptophan endogenous fluorescence of myofibrillar proteins in Spanish mackerel surimi

2.6 臭氧水漂洗對鲅魚魚糜肌原纖維蛋白表面疏水性的影響

蛋白質的表面疏水性可用來評價蛋白質構象變化[34]。在紫外光照射下,熒光探針ANS和肌原纖維蛋白質疏水性殘基結合后能發(fā)生強熒光效應,利用此原理測定肌原纖維蛋白表面疏水性靈敏度較高。由圖4可知,隨著臭氧水濃度的增加,肌原纖維蛋白表面疏水性指數(shù)先增加后減少。與對照組相比,4、6和8 mg/L臭氧水漂洗的鲅魚魚糜肌原纖維蛋白表面疏水性指數(shù)顯著增加了10.99%、10.06%和10.09%(P<0.05),而10 mg/L臭氧水漂洗樣品表面疏水性指數(shù)又略有下降。這一結果可能是較低濃度臭氧水處理導致鲅魚魚糜肌原纖維蛋白分子內部的疏水性基團暴露,導致疏水性結合位點增加;而過高濃度的臭氧水導致肌原纖維蛋白分子的疏水性基團過度暴露,疏水相互作用增強,疏水性基團相互吸引,從而遮蓋一些疏水性結合位點,使疏水性降低。Duan等[35]發(fā)現(xiàn)溫和氧化導致蛋清蛋白的疏水性基團暴露,而過度氧化導致蛋清蛋白的表面疏水性減低。臭氧水漂洗可能導致鲅魚魚糜肌原纖維蛋白分子內部疏水基團暴露,增強蛋白分子間的疏水相互作用。

圖4 不同濃度臭氧水漂洗對鲅魚魚糜肌原纖維蛋白表面疏水性指數(shù)的影響Fig.4 Effect of different contents of ozone water rinsing on the hydrophobicity of myofibrillar proteins in Spanish mackerel surimi注:不同小寫字母代表各處理組間表面疏水性指數(shù)差異顯著,P<00.05。

2.7 臭氧水漂洗對鲅魚魚糜肌原纖維蛋白二級結構的影響

拉曼光譜是振動光譜,可以反映二硫鍵、氫鍵等重要化學鍵的相關信息,也可以顯示蛋白肽鏈骨架、側鏈所處的微觀環(huán)境等化學信息。蛋白質主鏈中的酰胺Ⅰ(1600～1700 cm-1)和酰胺Ⅲ(1200～1350 cm-1)是重要的拉曼譜帶,常被用來分析和定量蛋白質的二級結構[36]。拉曼光譜圖一般由苯丙氨酸的特征峰1003 cm-1附近的譜帶歸一化得到。不同濃度臭氧水漂洗的鲅魚魚糜肌原纖維蛋白拉曼光譜如圖5 所示,采用Alix公式計算不同處理組的蛋白二級結構含量如表4所示。

圖5 不同濃度臭氧水漂洗的鲅魚魚糜肌原纖維蛋白拉曼光譜圖Fig.5 Raman spectrum of myofibrillar proteins in Spanish mackerel surimi rinsed treated by different concentration of ozone water

由表4可以看出,經過臭氧水漂洗的鲅魚魚糜肌原纖維蛋白二級結構發(fā)生了變化。與對照組(0 mg/L)相比,2、4、6和8 mg/L臭氧水漂洗的鲅魚魚糜肌原纖維蛋白二級結構α-螺旋含量隨臭氧水濃度增加而顯著減少(P<0.05),β-折疊、β-轉角、無規(guī)則卷曲含量則顯著增加(P<0.05);而10 mg/L臭氧水漂洗后鲅魚魚糜肌原纖維蛋白二級結構α-螺旋含量略有增加,β-折疊、β-轉角、無規(guī)則卷曲含量略有減少。這說明臭氧水漂洗引起鲅魚魚糜肌原纖維蛋白構象發(fā)生變化,α-螺旋逐漸轉變?yōu)棣?折疊等,蛋白結構穩(wěn)定性也隨之下降。Jiang等[8]用臭氧氧化肌球蛋白發(fā)現(xiàn)隨著臭氧氧化時間的增加,肌球蛋白α-螺旋含量減少,β-折疊、β-轉角、無規(guī)則卷曲含量增加。

表4 不同濃度臭氧水漂洗對鲅魚魚糜肌原纖維蛋白的二級結構的影響Table 4 Effect of ozone water rinsing on the secondary structures of myofibrillar proteins in Spanish mackerel surimi

在拉曼光譜中760 cm-1附近的條帶,可以表明色氨酸殘基的伸縮振動的變化。色氨酸殘基從蛋白分子內部疏水環(huán)境暴露到極性親水環(huán)境,拉曼光譜中760 cm-1附近的條帶峰值降低[37]。與對照組相比,經過臭氧水漂洗的鲅魚魚糜肌原纖維蛋白的I760/I1003值顯著降低,這表明色氨酸殘基從蛋白分子內部暴露到極性親水環(huán)境,與色氨酸內源熒光的分析結果一致。

酪氨酸雙峰比值(I850/I830)可用于鑒定酪氨酸殘基微環(huán)境的變化,如酪氨酸殘基的暴露或包埋。當酪氨酸殘基暴露時,在850 cm-1處的峰值高于830 cm-1處的峰值;當酪氨酸包埋在蛋白分子內部時,在850 cm-1處的峰值低于830 cm-1處的峰值[38]。與對照組比較,經過臭氧水漂洗的鲅魚魚糜肌原纖維蛋白的I850/I830值明顯增加,表明臭氧水漂洗使鲅魚魚糜肌原纖維蛋白酪氨酸殘基暴露于極性環(huán)境。臭氧水漂洗導致鲅魚魚糜肌原纖維蛋白二級結構α-螺旋降低,β-折疊、β-轉角、無規(guī)則卷曲含量增加,色氨酸殘基和酪氨酸殘基從蛋白分子內部疏水環(huán)境暴露到親水環(huán)境。

2.8 臭氧水漂洗對鲅魚魚糜肌原纖維蛋白交聯(lián)和聚集的影響

凝膠電泳可以分析不同濃度臭氧水漂洗后魚糜肌原纖維蛋白亞基的結構變化。圖6顯示了未還原和β-巰基乙醇還原狀態(tài)下不同處理鲅魚魚糜肌原纖維蛋白的SDS-PAGE圖譜。由6a圖可知,隨著臭氧水濃度的增加,肌球蛋白重鏈(Mysion heavy chain,MHC)條帶減弱,分離膠頂端>200 kDa蛋白聚集體明顯增多。經過β-巰基乙醇還原后蛋白形成的>200 kDa蛋白聚集體消失,肌球蛋白重鏈、肌動蛋白(Actin)的條帶顏色加深(圖6b)。該結果表明臭氧水處理導致鲅魚魚糜肌原纖維蛋白分子之間發(fā)生了一定程度的交聯(lián)和聚集,形成分子質量大的聚集體,這種交聯(lián)和聚集現(xiàn)象主要歸因于蛋白質氧化形成的二硫鍵作用。此外,SDS-PAGE圖中未發(fā)現(xiàn)明顯的蛋白質降解片段,這說明臭氧水漂洗引起的氧化對魚糜肌原纖維蛋白沒有明顯降解作用。Zhang等[2]用臭氧水漂洗鰱魚魚糜,電泳結果表明肌原纖維蛋白也沒有發(fā)生降解。

圖6 不同濃度臭氧水漂洗的鲅魚魚糜肌原纖維蛋白SDS-PAGE圖Fig.6 SDS-PAGE of myofibrillar proteins in Spanish mackerel surimi rinsed with different concentration of ozone water注:a:未加β-巰基乙醇;b:加β-巰基乙醇;M:標準蛋白;MHC:肌球蛋白重鏈;Actin:肌動蛋白。

3 結論

經過臭氧水漂洗后鲅魚魚糜的亮度和白度值增加,色澤得到改善;鲅魚魚糜的揮發(fā)性氣味發(fā)生改變,魚糜中醛類、醇類、烯烴類、硫醚類、烷烴類等揮發(fā)性物質含量減少。鲅魚魚糜因為白度低和腥味重導致其食用價值受限,利用臭氧水漂洗有助于改善鲅魚魚糜的色澤和風味進而提高其食用價值。另外,臭氧水漂洗后的鲅魚魚糜肌原纖維蛋白發(fā)生了一定程度的氧化,并引起蛋白質結構和構象的變化。但是,這種氧化對鲅魚魚糜的凝膠特性和營養(yǎng)價值的影響還未被了解有待深入研究。