孟平平，李媛媛，高蕊，張攀，王娜，黃瑾

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院生化教研室/新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832002)

Neuritin(CPG-15，可塑性相關(guān)候選基因15)作為神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮作用，其能通過(guò)促進(jìn)神經(jīng)突起生長(zhǎng)[1-2]、神經(jīng)元突觸傳遞[3]和調(diào)節(jié)突觸可塑性[4-6]，抑制神經(jīng)元的凋亡[7]。本課題組前期研究結(jié)果證實(shí)，重組Neuritin蛋白能夠促進(jìn)雞胚背根神經(jīng)節(jié)(DRG)和PC12細(xì)胞突起生長(zhǎng)[8]，誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為類神經(jīng)細(xì)胞，并促進(jìn)其遷移[9]。進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，局部給予重組Neuritin蛋白，不僅明顯促進(jìn)外周神經(jīng)(坐骨神經(jīng))損傷后的再生修復(fù)[10]，而且能夠促進(jìn)中樞神經(jīng)(脊髓)損傷的功能恢復(fù)[11]。因而，研制、開(kāi)發(fā)neuritin基因工程類藥物具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。

本課題組前期已獲得具有活性的重組Neuritin蛋白[12]，由于純化需要，以上重組Neuritin蛋白均帶有His標(biāo)簽，不符合重組蛋白藥物的標(biāo)準(zhǔn)，因此尋找合適的方法去除重組蛋白中的標(biāo)簽，至關(guān)重要。

本研究旨在利用基因工程技術(shù)構(gòu)建帶有酶切位點(diǎn)的neuritin重組大腸桿菌pET32a-neuritin表達(dá)系統(tǒng)，并篩選出高表達(dá)的菌株；為后期酶切去除His標(biāo)簽，獲得無(wú)標(biāo)簽的重組 Neuritin 蛋白奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒

大腸桿菌 DH5α：分子克隆的受體菌，購(gòu)自 Invitrogen 公司；大腸桿菌 BL21 (DE3)：分子克隆的表達(dá)菌，新疆農(nóng)墾科學(xué)院畜牧所甘尚權(quán)老師惠贈(zèng)；pET32a質(zhì)粒：分子克隆載體，新疆農(nóng)墾科學(xué)院畜牧所甘尚權(quán)老師惠贈(zèng)；pcDNA3.1-neuritin質(zhì)粒：由本室保存。

1.1.2 儀器與試劑

電泳儀、電轉(zhuǎn)膜儀均購(gòu)自 BIO- RAD 公司；限制性內(nèi)切酶 NcoI、XholI、TaqDNA 聚合酶、T4連接酶購(gòu)自Promega公司；質(zhì)粒提取試劑盒、DNA Ladder購(gòu)自天根公司；膠回收試劑盒、IPTG購(gòu)自TakaRa 公司；酵母提取物和胰蛋白胨購(gòu)自 Oxide 公司；PVDF膜購(gòu)自Solarbio公司；Neuritin 多克隆抗體為本實(shí)驗(yàn)室制備，山羊抗鼠 IgG- HRP 購(gòu)自中衫金橋公司；化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)置 Millipore 公司；蛋白分子量 Marker 購(gòu)自 Thermo 公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù) NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中序列號(hào)為 NM_016588.2 的neuritinORF(無(wú)信號(hào)肽、無(wú) GPI)序列設(shè)計(jì)特異性引物。在pET32a載體自身His標(biāo)簽和腸激酶序列之后克隆插入neuritin基因,限制性內(nèi)切酶分別為 NcoI、XholI。以本實(shí)驗(yàn)室保存質(zhì)粒pcDNA3.1-neuritin為模板，PCR擴(kuò)增neuritin基因。上游引物:CATGCCATGGCTGACGACGAC GACAAGGCGGGCAAGTGCGATGCGGTC；下游引物:CACCTCGAGTTCAGTTGCCGCTGCCGCAGAG。循環(huán)參數(shù)為：95 ℃預(yù)變性 5 min，94 ℃變性 30 s、65 ℃退火 30 s、72 ℃延伸 45 s 進(jìn)行 35 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸 10 min。待反應(yīng)完畢后，1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定 PCR 產(chǎn)物。

1.2.2 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

第一天晚上隨機(jī)挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子搖菌，無(wú)菌牙簽接種至 5 mL 含有 100 μg·mL-1氨芐青霉素的 LB試管中，放置搖床，260 r·min-1，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。次日早上按 1∶100 比例擴(kuò)大培養(yǎng)，轉(zhuǎn)至 20 mL 培養(yǎng)基。37 ℃，260 r·min-1，培養(yǎng)約3 h，使其 OD 值大于 0.6(未誘導(dǎo)取 2 mL 作對(duì)照)。加入誘導(dǎo)劑 IPTG 使其終濃度為0.1 mmol·L-1，37 ℃誘導(dǎo)8 h。收菌后4 ℃，12 000 r·min-1離心 10 min，棄盡上清，用 50 μL 10 mmol·L-1PBS 重懸菌體，再加入等體積的 2× loading buffer，100 ℃煮沸 7 min；待其降至室溫后，4 ℃，12 000 r·min-1，離心10 min，收集菌體，通過(guò)SDS-PAGE和Western blot鑒定Neuritin蛋白。

1.2.3 高表達(dá)菌株的篩選

挑選50個(gè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，IPTG誘導(dǎo)8 h，收菌后超聲破菌，收集上清，SDS-PAGE鑒定蛋白表達(dá)量，通過(guò) ImageJ 軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行灰度掃描，篩選出高表達(dá)的菌株，并保菌。

1.2.4 Neuritin 蛋白的 SDS-PAGE及Western Blot鑒定

收集菌體上清，加入上樣緩沖液，煮沸8 min，進(jìn)行SDS-PAGE(15%)電泳。電泳結(jié)束后考馬斯亮藍(lán)染色、脫色后，ImageLab 拍照，并運(yùn)用ImageJ軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行灰度掃描。Western blot檢測(cè)蛋白，SDS-PAGE電泳結(jié)束后，采用蛋白半干轉(zhuǎn)膜儀將蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。封閉2 h后進(jìn)行抗體孵育，一抗為Neuritin抗體(實(shí)驗(yàn)室制備)1∶500比例稀釋，室溫孵育 2 h，用 1×TBST 洗膜，5 min×1次，15 min×3次。二抗為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG，1∶5000 比例稀釋，室溫孵育 2 h，用 1×TBST洗膜，5 min×1 次，15 min×3 次。用 ECL 發(fā)光試劑盒檢測(cè)蛋白印跡條帶，并曝光顯影。

2 結(jié)果

2.1 pET32a-neuritin重組質(zhì)粒構(gòu)建策略

在pET32a載體自身His標(biāo)簽和腸激酶序列之后克隆插入neuritin基因,限制性內(nèi)切酶分別為 NcoI、XholI。

2.2 目的基因neuritin的PCR產(chǎn)物鑒定

PCR擴(kuò)增neuritin產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示在約300 bp處出現(xiàn)特異性條帶。與預(yù)期結(jié)果一致(圖2)。

2.3 pET32a-neuritin重組質(zhì)粒菌落PCR鑒定

將neuritin的PCR產(chǎn)物和pET32a質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接并轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)后，對(duì)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR鑒定。結(jié)果顯示在 300 bp 處出現(xiàn)特異性條帶(圖3)。

M：DNA Marker；Lane1-10：含重組質(zhì)粒的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。圖3 重組質(zhì)粒pET32a-neuritin菌落PCR鑒定

2.4 pET32a-neuritin重組質(zhì)粒雙酶切鑒定

將菌落PCR鑒定陽(yáng)性的轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，并用NcoI、XholI 酶切重組質(zhì)粒，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)可見(jiàn)約300 bp片段和5 000 bp片段，與預(yù)期結(jié)果一致(圖4)。結(jié)果表明neuritin基因已成功插入到pET32a載體中。

M：DNA Marker；Lane1：pET32a-neuritin；Lane2-3： NcoI/XholI雙酶切pET32a-neuritin。圖4 重組質(zhì)粒pET32a-neuritin雙酶切鑒定

2.5 重組質(zhì)粒pET32a-neuritin測(cè)序鑒定

將菌落PCR和雙酶切鑒定陽(yáng)性的重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至 BL21 感受態(tài)中，挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子搖菌后，送北京華大公司測(cè)序鑒定，測(cè)序結(jié)果顯示插入的目的基因片段264 bp，與 GeneBank 中人源neuritin序列完全一致(圖5)，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖5 重組質(zhì)粒pET32a-neuritin測(cè)序結(jié)果

2.6 重組Neuritin蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定

陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)蛋白后，SDS-PAGE 鑒定顯示，重組質(zhì)粒 pET32a-neuritin在 25kDa左右出現(xiàn)目的條帶(圖6A)，與理論值相符。Western blot 鑒定結(jié)果顯示在 25kDa左右出現(xiàn)目的條帶(圖6B)，證明誘導(dǎo)表達(dá)獲得的蛋白為 Neuritin 重組蛋白。

A：M：Protein Marker；Lane1-3：pET32a未誘導(dǎo)、 誘導(dǎo)、誘導(dǎo)；Lane4-6：pET32a-neuritin未誘導(dǎo)、誘導(dǎo)、誘導(dǎo) B：Lane1-2：pET32a未誘導(dǎo)、誘導(dǎo)； Lane3-4：pET32a-neuritin 未誘導(dǎo)、誘導(dǎo)。圖6 重組質(zhì)粒pET32a-neuritin的誘導(dǎo)表達(dá)鑒定

2.7 高表達(dá)菌株的篩選

將測(cè)序正確的pET32a-neuritin重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至 BL21 感受態(tài)后。共挑取 50 個(gè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子用IPTG 誘導(dǎo) 8 h，收菌后利用超聲破菌，收集上清，SDS-PAGE鑒定蛋白表達(dá)量(圖7A)。經(jīng)對(duì)蛋白表達(dá)條帶的灰度值掃描(圖7B)，6號(hào) lane 的總灰度值最大，即目的蛋白表達(dá)量最高，從而篩選出高表達(dá)菌株為 6號(hào) Lane 對(duì)應(yīng)的 6號(hào)單克隆。

A：M：Protein Marker；Lane1-7:不同單克隆的蛋白表達(dá)量； B：1-7:不同單克隆的蛋白表達(dá)量灰度值掃描結(jié)果。圖7 SDS-PAGE鑒定高表達(dá)菌株

3 討論

本研究旨在獲得帶有腸激酶序列的高表達(dá)的原核表達(dá)系統(tǒng) pET32a-neuritin，為后期酶切去除重組蛋白His標(biāo)簽奠定基礎(chǔ)，同時(shí)，本研究考慮到后期蛋白純化的高效和便捷，在neuritin的5’端引入pET32a 載體自身His標(biāo)簽。其次，利用腸激酶可特異性識(shí)別并水解多肽序列的特點(diǎn)，在neuritin與His之間引入pET32a載體自身的腸激酶序列，便于后期切除His標(biāo)簽。

重組蛋白的生產(chǎn)對(duì)于生物技術(shù)和生物醫(yī)學(xué)至關(guān)重要。為了利于研究，這些蛋白質(zhì)通常需要大量表達(dá)和純化。重組蛋白的純化通常使用的標(biāo)簽包括多組氨酸(His)，谷胱甘肽S -轉(zhuǎn)移酶，麥芽糖結(jié)合蛋白和硫氧還蛋白[13]。其中，His標(biāo)簽在純化重組蛋白中是應(yīng)用最廣泛的方法[14]。本研究在neuritin的5’端引入pET32a 載體自身His標(biāo)簽，目的是利用His 與 Ni 2+ 間的配位親和作用,使得后期重組蛋白得到有效純化[15]，初步獲得高純度重組蛋白。由于His標(biāo)簽僅含有6個(gè)氨基酸，研究者們認(rèn)為其不會(huì)顯著干擾大多數(shù)蛋白質(zhì)的功能和結(jié)構(gòu)[16-17]。然而越來(lái)越多的研究表明His可能會(huì)影響蛋白的結(jié)構(gòu)和功能。Mohanty等人的研究證明了改變His標(biāo)簽的長(zhǎng)度和位置對(duì)膜蛋白的表達(dá)產(chǎn)生影響[18]。His標(biāo)簽可能影響蛋白質(zhì)的低聚狀態(tài)和功能[19]。此外，添加His標(biāo)簽可以改變蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)，可能影響蛋白質(zhì)活性或功能[20]。因此，本研究在利用His標(biāo)簽提高重組蛋白的純化效率后，引入腸激酶將該標(biāo)簽去除。

腸激酶是由小腸粘膜上皮細(xì)胞所分泌出的一種絲氨酸蛋白酶，其主要功能是激活胰蛋白酶原，使之成為有活性的胰蛋白酶，從而引起下游的蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)[21]。由于腸激酶的輕鏈具有非常獨(dú)特的底物選擇能力，它可特異性識(shí)別并水解多肽序列DDDDK (Asp-Asp-Asp-Asp-Lys) 的羧基端肽鍵，不會(huì)在 DDDDK 序列下游蛋白 N-端留下多余氨基酸殘基，從而獲得無(wú)標(biāo)簽的重組蛋白。因此，腸激酶也成為酶切含有標(biāo)簽的重組蛋白的首選生物工具酶[22]。同時(shí)，該酶能在較寬的pH范圍(4.5～9.5)、較寬的溫度范圍(4 ℃～45 ℃)及在多種變性劑和去污劑存在的條件下保持活性[23]，因此腸激酶是一種理想的用于處理融合蛋白的工具酶，廣泛的應(yīng)用于生物技術(shù)領(lǐng)域[24]。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了帶有腸激酶序列的原核表達(dá)系統(tǒng) pET32a-neuritin，并篩選出高表達(dá)Neuritin蛋白的菌株。為后期獲得無(wú)標(biāo)簽的重組Neuritin 蛋白奠定基礎(chǔ)。