根皮素與根皮苷對(duì)酪氨酸酶的抑制機(jī)制

陳健敏，黃子堯，黃瑋玥，李青蓮，冉夢(mèng)楠，阮志鵬，金楠

(1 莆田學(xué)院藥學(xué)與醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，福建 莆田 351100；2 藥物分析與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建 莆田 351100)

酪氨酸酶(EC 1.14.18.1)是一種多功能的金屬酶,廣泛存在于微生物、動(dòng)植物及人體中[1]。近年來(lái)酪氨酸酶抑制劑的研究開發(fā)越來(lái)越受到關(guān)注，它們?cè)谵r(nóng)業(yè)方面(殺蟲劑和果蔬褐變抑制劑)和醫(yī)藥化妝品領(lǐng)域(皮膚美白劑)具有巨大的應(yīng)用潛力。雖然已有大量的研究報(bào)道了從天然植物來(lái)源或人工合成的方法中開發(fā)具有潛在價(jià)值和安全的酪氨酸酶抑制劑[2]，但只有很少一部分具有應(yīng)用價(jià)值且滿足安全需求。因此,開發(fā)高效低毒的酪氨酸酶抑制劑的科研任務(wù)依然繁重，已成為目前的研究熱點(diǎn)之一。

根皮素(phloretin)最早發(fā)現(xiàn)于1835年，是從蘋果樹的根皮、果實(shí)及葉中分離得到的天然二氫查耳酮類化合物[3-4]。從結(jié)構(gòu)上看，根皮素是一種缺乏雜環(huán)C環(huán)和缺少α-β雙鍵的類苯基丙烷化合物。這樣的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)使它成為柔性分子，能夠和許多生物大分子結(jié)合[5]。藥理研究表明，根皮素及其衍生物具有抗病毒、抗菌、抗腫瘤、抗炎和類雌性激素等作用[5-6]。近年來(lái)有人發(fā)現(xiàn)根皮素能夠抑制人類表皮黑素細(xì)胞中酪氨酸酶的活性[7]。最近，科學(xué)家又發(fā)現(xiàn)根皮素及其衍生物能夠在體外有效地抑制酪氨酸酶活性[8-11]。

因此，根皮素在農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥化妝品領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。然而，根皮素在植物中的含量較低，而根皮苷是根皮素的糖基化產(chǎn)物，易于從蘋果、海棠等植物中大量獲取，根皮苷(phlorezin)是根皮素的很好的一種替代品。但是，到目前為止，根皮苷是否具有酪氨酸酶抑制活性，若有抑制活性，與根皮素抑制機(jī)理有何異同，二者抑制酪氨酸酶的分子機(jī)制如何；根皮素中起到抑制作用的基團(tuán)是4-羥基苯基(4-Hydroxyphenyl)還是2,4,6-三羥基苯基(2,4,6-trihydroxyphenyl)；這些問(wèn)題都尚未進(jìn)行研究。為此，本研究擬采用紫外光譜法、熒光光譜法、高效液相色譜法和分子對(duì)接技術(shù)對(duì)比研究根皮素、根皮苷和根皮酚(phloroglucinol，根皮素的酶解產(chǎn)物)的酪氨酸酶抑制活性和抑制機(jī)制，為根皮素和根皮苷的進(jìn)一步開發(fā)和應(yīng)用提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

試劑：根皮素(批號(hào)：D1122 A)、根皮苷(批號(hào)：K176926)和根皮酚(批號(hào)：K177822)純度均為98.5%以上，購(gòu)于開來(lái)生物科技有限公司。酪氨酸酶(來(lái)源于蘑菇，批號(hào)：BDP1041，比活力為500 U/mg)，L-多巴(批號(hào)：J1417049)、L-酪氨酸(H1408317)、曲酸(K1418056)和二甲基亞砜(DMSO，批號(hào)：J66947)均購(gòu)自上海晶純生化科技股份有限公司。本實(shí)驗(yàn)中的其它試劑均為分析純。

儀器：UV2550 紫外可見分光光度計(jì)，日本島津；Spectrofluorometer FS5熒光分光光度計(jì)，英國(guó)愛丁堡；Agilent 1200高效液相色譜儀,美國(guó)安捷倫;Milli-Q-Plus超純水發(fā)生器,德國(guó)賽多利斯;PHS-3C 型酸度計(jì)，上海雷磁。

1.2 方法

1.2.1 酪氨酸酶單雙酚酶活性測(cè)定

參考文獻(xiàn)[12]的方法并做修改。測(cè)定雙酚酶活性時(shí)以0.5 mmol·L-1L-多巴為底物，測(cè)定酪氨酸酶單酚酶活性時(shí)以0.5 mmol·L-1的L-酪氨酸作為底物，均用0.05 mol·L-1的磷酸緩沖液(pH=6.8)配制。取試管A1、A2、A3，分別加入2.8 mL底物溶液，28 ℃預(yù)熱10 min后，A2和A3加入100 μL抑制劑溶液，A1加入等體積溶劑(DMSO)?；靹蚝?，A1，A2加入100 μL酪氨酸酶溶液，A3加入100 μL磷酸緩沖溶液，搖勻，反應(yīng)10 min時(shí)測(cè)定A475，平行測(cè)定3次。

根據(jù)公式酶活性/%=[(A2-A3)/A1]×100% 計(jì)算出相應(yīng)抑制劑下的酶活性。(A1：底物，酪氨酸酶在樣品溶劑存在下反應(yīng)10 min的吸光度值；A2:底物，酪氨酸酶在抑制劑存在下反應(yīng)10 min的吸光度值；A3：底物，抑制劑反應(yīng)10 min的吸光度值)。對(duì)于單酚酶活性測(cè)試，抑制劑若具有雙酚酶活性，僅用上述方法不能測(cè)定單酚酶抑制作用。只能采用以下方法，抑制劑(不同濃度)與酪氨酸酶分別加入預(yù)熱10 min的酪氨酸溶液中，隨著時(shí)間變化記錄吸光度值的變化，前2 min內(nèi)每0.5 min記錄一次，之后每1 min記錄一次，直至30 min，然后繪制以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)的關(guān)系圖，從圖中得到酶反應(yīng)的遲滯時(shí)間和曲線斜率的變化，判斷抑制劑是否具有單酚酶抑制作用。

1.2.2 酪氨酸酶底物識(shí)別

從單雙酚酶活性抑制動(dòng)力學(xué)曲線可以看出，根皮素與根皮苷在低濃度對(duì)酪氨酸酶有激活作用。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是因?yàn)楦に睾透ぼ毡旧砭褪且环N底物。為此，本實(shí)驗(yàn)將探索二者是否為酪氨酸酶底物。

將根皮素(或根皮苷)在存在酶作用或不存在酶作用的情況下，每隔5 min，分別對(duì)其進(jìn)行紫外光譜掃描，掃描范圍為200～800 nm。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，使用包含166.67 μmol·L-1根皮素(或根皮苷)的PBS(50 mmol·L-1，pH=6.8)3 mL作為底物，向其中加入酪氨酸酶，使其終濃度為13.33 U·mL-1。不加酪氨酸酶的溶液作為空白對(duì)照，在相同的條件下每隔5 min進(jìn)行光譜掃描。

1.2.3 高效液相色譜法測(cè)定

為了進(jìn)一步保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，用高效液相色譜法測(cè)試根皮素(或根皮苷)在酶作用下的含量變化。將66.67 μmol·L-1的根皮素(或根皮苷)與酶(33.33 U·mL-1)反應(yīng)10、 20、30、60和120 min后的樣品取出測(cè)試。收集的樣品用0.22 μm的濾膜過(guò)濾后用高效液相色譜法測(cè)試。

檢測(cè)條件如下，色譜柱：Agilent XDB C18 色譜柱(250 mm × 4.6 mm ×5 μm)；柱溫:30 ℃；進(jìn)樣體積：20 μL；流動(dòng)相：乙腈-0.05%磷酸水溶液(40：60，V/V)；流速：1 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng):286 nm。

1.2.4 熒光光譜測(cè)定

熒光光譜采用Spectrofluorometer FS5熒光分光光度計(jì)采集。將2 mL 400 U·mL-1的酪氨酸酶加入到石英比色皿中，掃描酪氨酸酶內(nèi)在熒光光譜，然后每次加入100 μL 0.2 mmol·L-1的根皮素(根皮苷或根皮酚，以DMSO作為溶劑配制)，搖勻后靜置5 min使其平衡后，掃描光譜。采用280 nm激發(fā)，掃描速度與電壓都為默認(rèn)值，分別在298 K和304 K溫度下掃描各樣品在290～500 nm處的發(fā)射光譜。抑制劑的濃度范圍控制在0～66.67 μmol·L-1，磷酸緩沖液作為空白背景扣除，不含抑制劑的溶劑(DMSO)作為陰性對(duì)照。

1.2.5 分子對(duì)接

采用AutoDock (4.2.6)軟件研究根皮素和根皮苷與酪氨酸酶之間的相互作用，參考之前使用的方法[13]。首先從https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/網(wǎng)站上下載蘑菇酪氨酸酶(PDB ID:2Y9X)及配體(根皮素和根皮苷)的3D結(jié)構(gòu)文件，然后用Chem 3D軟件將其轉(zhuǎn)化成PDB格式。

利用AutoDockTools 1.5.4對(duì)酪氨酸酶大分子(受體)進(jìn)行處理(包括去除水，加氫等)，并保存為pdbqt文件；根皮素和根皮苷也使用同樣方法保存為pdbqt文件；設(shè)置x、y、z 軸值為4.827、28.489和92.878，使盒子(Grid box)處于酶催化活性中心，整個(gè)酶催化活性中心均在盒子之內(nèi)，盒子大小為60×60×60，一個(gè)網(wǎng)格的間距是0.375 ?。

利用Autogrid計(jì)算格點(diǎn)的能量分?jǐn)?shù)，采用拉馬克遺傳算法(Lamarckian genetic algorithm)進(jìn)行對(duì)接運(yùn)算，并設(shè)定運(yùn)算次數(shù)為100次。一般結(jié)合能量最低時(shí)的對(duì)接結(jié)果就是大分子與配體結(jié)合最穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，將對(duì)接結(jié)果保存為PDB格式，利用PyMoL軟件查看最佳構(gòu)象并制圖，再用LIGPLOT+(1.4.5) 研究疏水相互作用。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均重復(fù)3次(n=3),采用Microsoft Office Excel 2007數(shù)據(jù)分析工具進(jìn)行處理，并用Duncan多重比較(SSR 法)檢驗(yàn)各處理平均數(shù)之間的差異顯著性(P<0.05)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示，采用Origin Pro 8.5 軟件作圖。

2 結(jié)果

2.1 抑制劑對(duì)酪氨酸酶單酚酶活性的影響

以L-酪氨酸為底物,在不存在和存在不同濃度的抑制劑的情況下，酪氨酸酶催化反應(yīng)的進(jìn)行曲線見圖1。如圖1D所示，曲酸(kojic acid)作為陽(yáng)性對(duì)照，開始時(shí),產(chǎn)物的形成量緩慢地上升，到一定時(shí)間后成直線上升,反應(yīng)體系達(dá)到恒定的斜率,說(shuō)明反應(yīng)達(dá)到穩(wěn)定態(tài)。直線外推得到橫軸截距為抑制劑濃度的增大而延長(zhǎng),穩(wěn)態(tài)的酶活力(直線部分的斜率)也隨著抑制劑濃度的增大而下降,這說(shuō)明曲酸對(duì)酪氨酸酶催化酪氨酸的遲滯時(shí)間和穩(wěn)態(tài)酶活力均有影響。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明曲酸對(duì)酪氨酸酶的單酚酶活性有顯著的抑制作用。然而，從圖1A和1B來(lái)看，從遲滯時(shí)間和穩(wěn)態(tài)酶活力來(lái)看，根皮素和根皮苷表現(xiàn)出在低濃度對(duì)酪氨酸酶是激活的，而高濃度呈現(xiàn)抑制，尤其是根皮苷的表現(xiàn)更為明顯。而圖1C則表明，根皮酚對(duì)單酚酶的遲滯時(shí)間沒(méi)有影響，但是隨著濃度的升高使得穩(wěn)態(tài)酶活力逐漸下降，說(shuō)明根皮酚具有單酚酶抑制活性。

根皮素具有根皮酚結(jié)構(gòu)(2,4,6-三羥基苯基)，因此根皮素本應(yīng)該和根皮酚一樣表現(xiàn)出單酚酶抑制作用，但是卻在低濃度時(shí)產(chǎn)生激活的作用。這可能是因?yàn)楦に氐牧硪粋€(gè)結(jié)構(gòu)(4-羥基苯基)，它是類似酪氨酸的單酚結(jié)構(gòu)，很可能成為酪氨酸酶的底物，而且生成的產(chǎn)物在475 nm也有吸收，從而造成了激活酶活性的假象。根皮素與根皮酚另一個(gè)不同的地方是，根皮素對(duì)單酚酶的遲滯時(shí)間有顯著影響，而根皮酚沒(méi)有影響，這說(shuō)明根皮素影響遲滯時(shí)間的基團(tuán)并不是根皮酚結(jié)構(gòu)。

有報(bào)道根皮素因具有2,6-二羥基苯乙酮結(jié)構(gòu)(2,6-dihydroxyacetophenone)而具有特殊的還原性[14]，具有還原性的物質(zhì)(如抗壞血酸)能夠影響遲滯時(shí)間[15]，因此根皮素對(duì)單酚酶遲滯時(shí)間的影響可能來(lái)自這個(gè)基團(tuán)。根皮苷的結(jié)構(gòu)與根皮素相近，只是在其根皮酚結(jié)構(gòu)上多了個(gè)糖基，應(yīng)該會(huì)因?yàn)榭臻g位阻的原因，影響其單酚酶抑制活性，但對(duì)比圖1 A和1B，發(fā)現(xiàn)其抑制作用似乎比根皮素更強(qiáng)。這個(gè)問(wèn)題與根皮素和根皮酚是否真的是酪氨酸酶底物，二者的氧化產(chǎn)物是否對(duì)酶活性測(cè)試產(chǎn)生干擾有關(guān)，接下來(lái)將會(huì)再設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行探索。

圖1 根皮素、根皮苷和根皮酚對(duì)酪氨酸酶單酚酶抑制作用的進(jìn)程曲線

2.2 抑制劑對(duì)酪氨酸酶雙酚酶活性的影響

以L-多巴為底物,測(cè)定不同濃度的抑制劑對(duì)酪氨酸酶的雙酚酶活性的抑制作用，以曲酸作為陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果如圖2所示,根皮素和根皮苷在低濃度時(shí)，酶的活性大于100%，抑制劑表現(xiàn)出激活的作用；當(dāng)濃度較大時(shí)，這二者有具有較強(qiáng)的雙酚酶抑制作用；根皮酚隨著濃度的增大表現(xiàn)出有一定的激活作用，說(shuō)明其沒(méi)有雙酚酶抑制作用。根皮素和根皮苷在低濃度表現(xiàn)出激活作用，推測(cè)可能的原因是：二者確實(shí)能夠激活酶的活性；二者可能是酪氨酸酶的底物，氧化產(chǎn)物與多巴色素相似，在475 nm有吸收，從而從表觀上看，是激活作用。具體何種原因，接下來(lái)將專門設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行探索。曲酸、根皮素和根皮苷導(dǎo)致雙酚酶活力下降一半所需的抑制劑濃度(IC50)分別為83.11、169.36和707.14 μmol·L-1。這些結(jié)果說(shuō)明根皮素比曲酸抑制能力弱，大約為其的一半，但是其又比根皮苷的更強(qiáng)，大約強(qiáng)4倍。根據(jù)根皮素與根皮苷的結(jié)構(gòu)，根皮素的一個(gè)酚羥基被糖苷基取代便成了根皮苷，這樣的結(jié)構(gòu)差異導(dǎo)致根皮苷的抑制活性大幅度下降，可能是因?yàn)榭臻g位阻的影響使得根皮苷與酪氨酸酶的結(jié)合能力降低了，最終導(dǎo)致抑制活性下降。這一推測(cè)將采用分子對(duì)接技術(shù)進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證。

圖2 根皮素、根皮苷和根皮酚對(duì)酪氨酸酶二酚酶活力的影響

2.3 酪氨酸酶底物識(shí)別

單雙酚酶活性測(cè)試的結(jié)果說(shuō)明根皮素和根皮苷很可能是酪氨酸酶的底物，為了驗(yàn)證這一可能，讓根皮素、根皮苷和根皮酚(166.67 μmol·L-1)分別與酪氨酸酶(13.33 U·mL-1)進(jìn)行反應(yīng)，每隔5 min掃描一次紫外光譜，結(jié)果如圖3 A、3C 和3E所示。從圖3A可以看出，根皮素自身在288 nm有特征的最大吸收峰，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，該吸收峰逐漸下降，而在475 nm處本來(lái)沒(méi)有吸收峰，也隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，顯著增大，這結(jié)果說(shuō)明根皮素確實(shí)可能是一種底物，與酪氨酸酶反應(yīng)后生成了其他物質(zhì)，從而引起了根皮素紫外光譜的變化，另有根皮素自身(沒(méi)有酶參與下)隨時(shí)間變化的光譜圖(各個(gè)時(shí)間點(diǎn)光譜重合，因篇幅原因未能列出)，說(shuō)明光譜變化并不是因?yàn)槠渥陨淼墓饨到庖鸬?。如圖3C所示，根皮苷自身在286 nm 和321 nm有特征的雙峰吸收，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，該雙峰吸收強(qiáng)度逐漸下降，而且其自身(沒(méi)有酶參與下)隨時(shí)間變化的光譜不變，說(shuō)明根皮苷可能也是一種底物，與酪氨酸酶反應(yīng)生成其他物質(zhì)，從而消耗了根皮苷的量，導(dǎo)致其雙峰吸收逐漸下降。圖3E則表明根皮酚并不是酪氨酸酶的底物。

為了進(jìn)一步探明這三者是否酪氨酸酶底物以及作為底物反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)特征，以及是否會(huì)影響單雙酚酶測(cè)試的結(jié)果，設(shè)計(jì)如下實(shí)驗(yàn)。制備不同濃度的抑制劑，分別在酪氨酸酶的作用下，記錄475 nm處的吸光度隨時(shí)間變化情況。從圖3B可以看出，隨著根皮素濃度的增大，根皮素與酪氨酸酶反應(yīng)的穩(wěn)態(tài)速率(圖中所示曲線的線性斜率)逐漸升高，但是當(dāng)根皮素的濃度達(dá)到166.67 μmol·L-1以上時(shí)，穩(wěn)態(tài)速率又開始逐漸下降。這說(shuō)明了根皮素在低濃度時(shí)主要是作為酪氨酸酶的底物，但當(dāng)濃度達(dá)到一定程度就能夠抑制酪氨酸酶的活性。從圖3D中可以看出，根皮苷與根皮素具有同樣的性質(zhì)。而圖3F則進(jìn)一步表明根皮酚確實(shí)不是底物。根皮素和根皮苷在475 nm有吸收，因此在用單雙酚酶活性測(cè)試抑制劑的抑制活性時(shí)便有干擾，當(dāng)濃度較低時(shí)，根皮素和根皮苷作為一種底物起主要作用，所以表現(xiàn)出激活作用，而在高濃度時(shí)表現(xiàn)出抑制作用，這些結(jié)論與單雙酚酶活性測(cè)試結(jié)果一致。同時(shí)對(duì)比圖3B和3D，可以發(fā)現(xiàn)在475 nm的吸光度值，根皮素比根皮苷強(qiáng)得多，因此單酚酶活性測(cè)試的結(jié)果中，根皮素受到干擾的程度更大。圖3G是采用高效液相色譜法，測(cè)試抑制劑與酪氨酸酶反應(yīng)后的損耗率，從定量的角度進(jìn)一步證明它們是否為底物。從圖中可以看出根皮素在10 min之后，在酪氨酸酶的作用下的損耗率已基本達(dá)到100%，而根皮苷則在1 h后才達(dá)到100%，這說(shuō)明二者確實(shí)是底物，而且根皮素與酪氨酸酶的酶促反應(yīng)速率遠(yuǎn)大于根皮苷，或者說(shuō)親和力更強(qiáng)。而根皮酚也進(jìn)一步被證實(shí)其并非酪氨酸酶底物。這些結(jié)果說(shuō)明根皮素和根皮苷是酪氨酸酶的底物，而且其被酪氨酸酶氧化的基團(tuán)為4-羥基苯基，而不是2,4,6-三羥基苯基(根皮酚結(jié)構(gòu))；根皮苷上的糖基影響了其作為底物對(duì)酪氨酸酶的親和力。

圖3 抑制劑對(duì)酪氨酸酶雙酚酶活性的影響及底物識(shí)別試驗(yàn)

2.4 熒光光譜法研究抑制劑與酪氨酸酶的相互作用

2.4.1 抑制劑對(duì)酪氨酸酶的熒光猝滅作用

酪氨酸酶含有色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等氨基酸殘基，具有內(nèi)在熒光特性，所以采用熒光猝滅實(shí)驗(yàn)研究其與小分子之間的相互作用也常見報(bào)道[16]。圖4 A和4B所示為溫度298 K時(shí)，不同濃度抑制劑(分別為根皮素和根皮苷)存在下，酪氨酸酶的熒光發(fā)射光譜。a-h曲線的抑制劑濃度分別為0、9.52、18.18、26.09、33.33、40.00、46.15和51.85 μmol·L-1。隨根皮素和根皮苷濃度的增加，酪氨酸酶的熒光強(qiáng)度呈單調(diào)性降低，表明二者與酪氨酸酶相互作用后，對(duì)其熒光產(chǎn)生猝滅作用[17]。酪氨酸酶的最大發(fā)射波長(zhǎng)為331 nm，加入根皮素后，酪氨酸酶的最大發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)生了藍(lán)移(345 nm)，表明根皮素與酪氨酸酶相互作用時(shí)，改變發(fā)生熒光猝滅的氨基酸殘基(色氨酸等)的疏水性環(huán)境。與此不同的是，加入根皮苷后，并沒(méi)有發(fā)生明顯的紅移或藍(lán)移，表明根皮苷并未改變熒光猝滅的氨基酸殘基(色氨酸等)的疏水性環(huán)境。對(duì)比根皮素和根皮苷對(duì)酪氨酸酶的熒光猝滅作用，可以發(fā)現(xiàn)根皮素的猝滅作用比根皮苷明顯更強(qiáng)，主要原因也可能是根皮苷的糖基的空間位阻影響了其與酶的相互作用。圖4C和4D分別為根皮酚和溶劑(DMSO)逐漸加入酪氨酸酶的熒光發(fā)射光譜，從圖中可以看出二者的光譜并沒(méi)有什么明顯差異，這說(shuō)明根皮酚并不顯著引起熒光猝滅。

圖4 抑制劑對(duì)酪氨酸酶的熒光猝滅作用及機(jī)理

2.4.2 抑制劑對(duì)酪氨酸酶的熒光猝滅機(jī)理

熒光猝滅可分為動(dòng)態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅兩種。蛋白質(zhì)與小分子結(jié)合后其熒光強(qiáng)度的變化可由式(1)的Stern-volmer方程表示：

F0/F=1+Kqτ0[Q]=1+Ksv[Q]

(1)

F0為熒光物質(zhì)的初始熒光強(qiáng)度；F為相互作用后熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度；Kq為雙分子猝滅過(guò)程的速率常數(shù)，L·mol-1·s-1；Ksv為Stern-Volmer方程猝滅常數(shù)，L·mol-1；τ0為猝滅劑不存在時(shí)生物大分子的熒光平均壽命，一般為10-8s；[Q]為熒光淬滅劑的濃度。

分別將根皮素和根皮苷的濃度[Q]對(duì)F0/F-1作圖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)0/F-1與[Q]呈良好的線性關(guān)系。由此計(jì)算的Stern-Volmer方程及其猝滅常數(shù)Ksv見表1。由表1可知，隨著溫度的升高，Ksv減小，可判斷根皮素和根皮苷對(duì)酪氨酸酶的熒光猝滅方式都屬于靜態(tài)猝滅。根據(jù)得到的不同溫度下的抑制劑猝滅常數(shù)Ksv，及其與Kq的關(guān)系，可求得298和304 K下對(duì)應(yīng)的Kq，根皮素的Kq分別為5.02×1012和4.52×1012L·mol-1·s-1，根皮苷的Kq分別為7.06×1011和6.45×1011L·mol-1·s-1，遠(yuǎn)大于生物分子的最大碰撞擴(kuò)散速率常數(shù)(2. 0×1010L·mol-1·s-1)[18]，由此可進(jìn)一步判斷，根皮素和根皮苷對(duì)酪氨酸酶的熒光猝滅是由于其與酪氨酸酶形成了無(wú)熒光或者熒光信號(hào)較弱的復(fù)合物而引起的靜態(tài)猝滅。而且，根皮素的Ksv和Kq值均比根皮苷的大，證明根皮素與酪氨酸酶的親和能力比根皮苷更強(qiáng)，形成的復(fù)合物更穩(wěn)定。這與酪氨酸酶底物識(shí)別的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，原因可能也在于根皮苷的糖基(空間位阻)。

2.4.3 抑制劑與酪氨酸酶的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)

為進(jìn)一步計(jì)算根皮素和根皮苷的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)，靜態(tài)猝滅中，假定它們之間有n 個(gè)獨(dú)立的結(jié)合位點(diǎn)，我們描述結(jié)合常數(shù)與熒光強(qiáng)度、猝滅劑濃度以及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)之間的關(guān)系可用式(2)所示的雙對(duì)數(shù)方程：

(2)

在不同溫度下，以不同濃度的根皮素和根皮苷對(duì)應(yīng)酪氨酸酶熒光光譜的log [Q]值對(duì)log[(F0-F)/F]作雙對(duì)數(shù)圖，并進(jìn)行線性回歸，由所得直線的斜率和截距可計(jì)算得到根皮素和根皮苷與酪氨酸酶的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)和結(jié)合常數(shù)(表1)。由表1可知，根皮素和根皮苷與酪氨酸酶的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)都約為1，表明根皮素和根皮苷與酪氨酸酶的結(jié)合只有一類獨(dú)立的結(jié)合位點(diǎn)[19]。根皮素的結(jié)合常數(shù)均比根皮苷的更大，之所以隨著溫度的升高而減小，是由于根皮素和根皮苷對(duì)酪氨酸酶的猝滅機(jī)理是靜態(tài)猝滅，溫度升高不利于復(fù)合物的穩(wěn)定，因此結(jié)合常數(shù)減小。

2.4.4 抑制劑與酪氨酸酶相互作用力類型

小分子與蛋白質(zhì)的作用力類型主要包括氫鍵、范德華力、靜電作用力和疏水相互作用。通過(guò)研究根皮素和根皮苷與酪氨酸酶相互作用的結(jié)合自由能(ΔG)、焓變(ΔH)、和熵變(ΔS)等熱力學(xué)參數(shù)可探究作用力類型。溫度變化不大時(shí)，結(jié)合作用的焓變和熵變可以近似看做常數(shù)。根據(jù)之前求得的298和304 K下得到的結(jié)合常數(shù)以及公式(3)和(4)求解出各項(xiàng)參數(shù)，結(jié)果見表1。

表1 根皮素和根皮苷與酪氨酸酶在不同溫度下相互作用的熒光猝滅常數(shù)Ksv， 結(jié)合常數(shù)Ka，鍵合位點(diǎn)數(shù)n和相關(guān)的熱動(dòng)力學(xué)參數(shù)

(3)

Go=Ho-TSo,

(4)

式中，K為對(duì)應(yīng)溫度下的結(jié)合常數(shù)(L·mol-1);R為理想氣體常數(shù)(8. 314 J·mol-1·K-1)。結(jié)果顯示，298與304 K下根皮素和根皮苷與酪氨酸酶的結(jié)合自由能分別為-25.03±0.23、-25.33±0.31 kJ·mol-1和-25.06±0.22、-24.90±0.34 kJ·mol-1，自由能均為負(fù)值，說(shuō)明根皮素和根皮苷與酪氨酸酶的相互作用是自發(fā)進(jìn)行。

根皮素與酪氨酸酶相互作用過(guò)程的熵變?chǔ)為49.29 J·mol-1·K-1，ΔS為正值，表明二者相互作用中存在疏水作用。另外，計(jì)算所得體系的焓變(ΔH) 為-10.35 kJ·mol-1，焓變?yōu)樨?fù)值說(shuō)明根皮素與酪氨酸酶相互作用時(shí)有氫鍵作用發(fā)生。由此可說(shuō)明根皮素與酪氨酸酶形成的復(fù)合物中，氫鍵與疏水作用力起著至關(guān)重要的作用。根皮苷與酪氨酸酶相互作用過(guò)程的熵變?chǔ)為-26.49 J·mol-1·K-1，ΔS為負(fù)值，說(shuō)明有范德華力作用[20]。計(jì)算所得體系的焓變(ΔH) 為-32.96 kJ·mol-1，焓變?yōu)樨?fù)值說(shuō)明根皮苷與酪氨酸酶相互作用時(shí)有氫鍵作用發(fā)生。結(jié)果說(shuō)明根皮苷與酪氨酸酶形成的復(fù)合物中，主要是氫鍵和范德華力的作用。

2.5 分子對(duì)接

利用分子對(duì)接軟件Autodock (4.2.6)分別構(gòu)建了根皮素和根皮苷與酪氨酸酶的對(duì)接模型，圖5A(surface)和5B(carton)展示了根皮素與酪氨酸酶的對(duì)接模式和氫鍵相互作用。酪氨酸酶的活性中心由2個(gè)銅離子和6個(gè)與之相連的組氨酸殘基(His-61、His-85、His-94、His-259、His-263和His-296)組成[21]。由圖5 A可見根皮素在酪氨酸酶的活性中心內(nèi)，結(jié)合能為-5.12 kcal·mol-1。圖5B中展示了根皮素與酪氨酸酶結(jié)合的氫鍵作用(黃色虛線)，由圖可見共與6個(gè)氨基酸殘基形成氫鍵作用(共6個(gè))，包括ASN-260 (1)、VAL-283 (1)、GLY-281 (1)、HIS-85 (1)、HIS-94 (1) 和 HIS-259 (1)。圖5C和5D顯示，根皮苷并沒(méi)有整個(gè)分子進(jìn)入活性中心，只有4-羥基苯基在中心內(nèi)，而另外一部分在中心外，最佳構(gòu)象的結(jié)合能為-3.99 kcal·mol-1。圖5D顯示了根皮苷與酪氨酸酶結(jié)合，并與4個(gè)極性氨基酸殘基發(fā)生氫鍵作用(共7個(gè))，包括:HIS-244 (2)、MET280(1)、HIS-85(2)和ASN-81(2)。從圖5E和5F來(lái)看，根皮素和根皮苷與酪氨酸酶有很強(qiáng)的疏水作用，根皮素與酪氨酸酶上的16個(gè)殘基有疏水作用，而根皮苷只與13個(gè)殘基有疏水作用。從結(jié)合能的大小來(lái)看，根皮素比根皮苷更容易與酪氨酸酶結(jié)合，結(jié)合主要通過(guò)氫鍵和疏水作用，因此二者與酪氨酸酶結(jié)合中，疏水作用占主導(dǎo)地位。分子對(duì)接結(jié)果表明根皮素和根皮苷與底物識(shí)別實(shí)驗(yàn)和熒光猝滅實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。從對(duì)接結(jié)果和前面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可推測(cè)，根皮素和根皮苷抑制酪氨酸酶活性存在以下4個(gè)方面的機(jī)制:①根皮素和根皮苷在活性中心部位的存在可能形成空間位阻效應(yīng)，阻礙其他酶底物進(jìn)入酶活性中心;②根皮素和根皮苷與酪氨酸酶之間的相互作用，可能影響酪氨酸酶的活性中心空間構(gòu)象，導(dǎo)致酪氨酸酶活性受到影響；③根皮素和根皮苷作為一種底物，起到競(jìng)爭(zhēng)性抑制；④根皮素和根皮苷具有特殊的2,6-二羥基苯乙酮結(jié)構(gòu)，對(duì)單酚酶的遲滯時(shí)間有影響。

圖5 分子對(duì)接分析抑制劑與酪氨酸酶的相互作用

3 討論

本研究深入探討了根皮素和根皮苷對(duì)酪氨酸酶活性抑制和機(jī)制。單雙酚酶抑制動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，根皮素和根皮苷對(duì)單酚酶活性有抑制作用(延長(zhǎng)遲滯時(shí)間并減小穩(wěn)態(tài)酶活力)，單酚酶活性抑制來(lái)源于2,6-二羥基苯乙酮和2,4,6-三羥基苯基結(jié)構(gòu)；雙酚酶活性抑制(IC50)分別為169.36和707.14 μmol·L-1，說(shuō)明根皮素比根皮苷具有更強(qiáng)的雙酚酶抑制作用(糖基位阻原因);底物識(shí)別實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明根皮素和根皮苷都是酪氨酸酶的底物，而且根皮素比根皮苷(糖基位阻原因)與酪氨酸酶具有更強(qiáng)的親和力；熒光光譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，根皮素和根皮苷對(duì)酪氨酸酶產(chǎn)生靜態(tài)熒光猝滅，并分別通過(guò)氫鍵和疏水相互作用與氫鍵和范德華力作用，與酪氨酸酶形成穩(wěn)定的復(fù)合物，根皮素形成的復(fù)合物更加穩(wěn)定。分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步表明:根皮素與酪氨酸酶殘基(ASN-260，VAL-283，GLY-281，HIS-85，HIS-94和HIS-259) 形成了6個(gè)穩(wěn)定的氫鍵和16個(gè)殘基形成疏水作用(最佳構(gòu)象結(jié)合能為-5.12 kcal·mol-1)，而根皮苷與酪氨酸酶殘基(HIS-244，MET280，HIS-85和ASN-81) 形成了7個(gè)穩(wěn)定的氫鍵和13個(gè)殘基形成疏水作用(最佳構(gòu)象結(jié)合能為-3.99 kcal·mol-1)，根皮苷的糖基影響了其與酶的結(jié)合。綜上，根皮苷的酪氨酸酶抑制活性比根皮素低，主要是因?yàn)樘腔绊懥似渑c酪氨酸酶的結(jié)合，但二者抑制機(jī)制相似。這些研究結(jié)果有助于根皮素和根皮苷的進(jìn)一步開發(fā)和利用。