楊心怡，孫磊，錢峰

(上海交通大學(xué)藥學(xué)院細(xì)胞與治療抗體工程研究中心，上海 200240)

頭頸部鱗狀細(xì)胞癌是全球第六大癌癥，每年確認(rèn)病例超過50萬例，有著較高的復(fù)發(fā)率與轉(zhuǎn)移率；盡管一些治療方法如手術(shù)、放化療等取得了進展，但多年來患者的生存時間并未得到明顯的改善[1]。研究發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是造成頭頸癌生存期短暫的重要因素之一[2]。因此提高對頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC)細(xì)胞轉(zhuǎn)移機制的認(rèn)識，有助于發(fā)現(xiàn)與開發(fā)新的治療策略。

血清淀粉樣蛋白A(serum amyloid A,SAA)是一種急性時相蛋白，主要由肝細(xì)胞分泌合成[3]。SAA也在其他組織和細(xì)胞中表達(dá)和分泌，如腫瘤組織、滑膜組織等[4]。當(dāng)機體發(fā)生炎癥、感染等急性時相反應(yīng)時，SAA在血液中的濃度能夠增加約1000倍[5-7]。目前研究已發(fā)現(xiàn)SAA在人體中主要有四種亞型，分別為SAA1，SAA2，SAA3和SAA4，其中SAA1在眾多疾病中發(fā)揮著重要作用，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)SAA1的升高可能與腫瘤的形成和腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[8]。已有研究表明體內(nèi)SAA的升高與多種類型腫瘤的預(yù)后不良有關(guān)，包括胃癌，乳腺癌和HNSCC等，SAA的升高亦可作為這些腫瘤的生物標(biāo)記物[9-11]。同時也有研究發(fā)現(xiàn)SAA在HNSCC患者組織以及血清中表達(dá)水平顯著升高[12]。這些研究發(fā)現(xiàn)提示SAA1的高表達(dá)在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮著重要的作用。

趨化因子受體3(C-X-C chemokine receptor type 3，CXCR3)是一種CXC趨化因子受體，在多種細(xì)胞中表達(dá)，尤其是單核細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和一些癌細(xì)胞；CXCR3具有三種亞型 CXCR3A,CXCR3B和CXCR3alt。CXCR3的主要配體是三種干擾素誘導(dǎo)的趨化因子：CXCL9，CXCL10和CXCL11，另外還包括CXCL4。CXCR3A和CXCR3B在腫瘤中發(fā)揮著重要作用[13-14]。文獻(xiàn)報道，CXCR3A在透明細(xì)胞卵巢癌中表達(dá)上調(diào)，而CXCR3B的表達(dá)出現(xiàn)下調(diào)[14-15]；在前列腺癌中CXCR3A的mRNA表達(dá)量升高促進了前列腺癌細(xì)胞的增殖與遷移能力[16]。在胃癌細(xì)胞和組織中，CXCR3的表達(dá)明顯升高，并且其高表達(dá)與胃癌患者的腫瘤分期，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及生存期差異相關(guān)，CXCR3的激活能夠促進基質(zhì)金屬蛋白酶 (matrix metalloproteinase,MMP-2) 和MMP-9的表達(dá)，促進胃癌細(xì)胞的侵襲和遷移。因此，CXCR3A的表達(dá)在多種類型腫瘤中升高，并且與腫瘤的轉(zhuǎn)移侵襲機制相關(guān)。同時也有研究發(fā)現(xiàn)，頭頸部鱗狀癌患者外周血單核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中CXCR3A及其配體表達(dá)的上調(diào)能夠促進其增殖和遷移[17]。這提示CXCR3A不僅是腫瘤的轉(zhuǎn)移與侵襲機制中的一個重要分子，也在免疫細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞殺傷作用中產(chǎn)生重要影響。

本研究中我們以SAA1作為刺激物刺激HNSCC細(xì)胞HN4，檢測SAA1對于HN4細(xì)胞增殖和遷移能力的影響，并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 試劑

DMEM培養(yǎng)基，RPMI-1640培養(yǎng)基，胰蛋白酶和100 × 青霉素/鏈霉素購買于美國Thermo Fisher 公司；胎牛血清購自杭州天杭生物科技有限公司；抗體 p-p38 MAPK (4511)，p38 MAPK (8690)，p-Erk (4370)，Erk (4695)，p-Akt (4060)，Akt (4685)，β-actin (4970) 購自美國 Cell Signaling Technology公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量PCR檢測試劑盒購于日本TOYOBO公司。頭頸部鱗狀癌細(xì)胞株HN4，HN30，SCC25，Cal27和HN12購于美國模式菌種保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)。SAA1購買于美國Pepro Tech(派普泰克)公司(純度：通過SDS-PAGE凝膠和HPLC分析，大于98%)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人源頭頸部鱗狀癌細(xì)胞HN4，HN30和HN12所用培養(yǎng)基為含有10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基；SCC25和Cal27細(xì)胞所用培養(yǎng)基為含有10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基。細(xì)胞置于37 ℃，5%二氧化碳培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。觀察細(xì)胞狀態(tài)，在細(xì)胞生長至對數(shù)生長期時，及時進行傳代、接種和凍存。

1.3 MTT實驗

精確稱量50 mg MTT 粉末至10 mL 無菌PBS中溶解,得5 mg·mL-1MTT；-20 ℃保存。收集對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整至1×105個·mL-1，每孔100 μL接種于96孔板中，每組設(shè)三個復(fù)孔，每孔補加100 μL完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜。待細(xì)胞達(dá)到80%的匯合度，加各濃度的人血清淀粉樣蛋白A1孵育24 h后，每孔加20 μL 5 mg·mL-1MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，1 500 r·min-1，5 min 離心后棄掉上清，每孔加100 μL 二甲基亞砜，將孔板置于水平搖床低速震蕩10 min，測定490 nm處的OD值。

1.4 實時熒光定量PCR

Trizol法提取對數(shù)生長期細(xì)胞樣本總RNA，使用Nano-Drop 2 000微量分光光度計進行RNA定量。按照日本TOYOBO公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成模板cDNA。設(shè)置副孔數(shù)3個，取平均值，通過分析ΔΔCt值，進行定量計算。以2-ΔΔCt法測定CXCR3的相對表達(dá)。CXCR3A引物序列：上游引物：5′ CTGCTGTCCAGTGGGTTT 3′，下游引物：5′ GTTGGCTGATAGGTAGATGAA 3′。

1.5 劃痕實驗

將狀態(tài)良好的對數(shù)生長期的HN4細(xì)胞以4×105/孔接種至6孔板，過夜培養(yǎng)。次日更換新的完全培養(yǎng)基，用200 μL移液器吸頭在孔底以無菌直尺為標(biāo)準(zhǔn)劃痕，橫向三道劃痕均分，縱向三道劃痕均分，用PBS清洗3次，將劃下的細(xì)胞吸去，加入無血清培養(yǎng)基，加入不同濃度的SAA1，在37 ℃，5%二氧化碳恒溫箱中培養(yǎng)，分別在0、6、12 h取樣拍照。使用Image J軟件計算圖像的劃痕面積。計算公式為 劃痕愈合率/%=(0 h劃痕面積-12 h劃痕面積)/0 h劃痕面積。

1.6 Western 印跡分析

將狀態(tài)良好的對數(shù)生長期HN4細(xì)胞以1×106/孔接種至6孔板，過夜培養(yǎng)，待細(xì)胞長滿約80%～90%時，在各孔內(nèi)加入10 μmol·L-1人重組蛋白SAA1，刺激不同時間后收樣檢測。將培養(yǎng)有細(xì)胞的孔板從培養(yǎng)箱中取出置于冰上，用預(yù)冷的PBS沿孔板壁輕輕清洗細(xì)胞一次，將PBS吸凈棄去，加入1×loading buffer后、用細(xì)胞刮充分裂解細(xì)胞。根據(jù)SDS-聚丙烯酰胺凝膠的配制方法配制分離膠和濃縮膠。

電泳：取等量裂解液上清加入已配置好的膠孔中，設(shè)置電壓為80 V，電泳時間為30 min，30 min后樣品壓縮至分離膠與濃縮膠交界線，再將電壓設(shè)置為120 V，電泳至所需條帶到達(dá)膠板3/4處。轉(zhuǎn)膜：停止電泳后，采用“濾紙-凝膠-膜-濾紙”夾心法，以110 V電壓，80 min在冰水浴中將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(NC)膜上。封閉：轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，用平頭鑷夾取膜小心放入有5%牛奶的孵育盒中，在搖床上室溫封閉1～2 h。以NC膜上的蛋白為抗原，在4 ℃冰箱中與對應(yīng)的一抗孵育過夜，用1×TNET buffer以5 min·次-1、5次洗膜，再用辣根過氧化物酶HRP連接的二抗室溫孵育結(jié)合2 h，用1×TNET buffer以7 min·次-1、3次洗膜。將膜正面朝上平整地放在保鮮膜上，將配好的ECL底物均勻滴在對應(yīng)的蛋白條帶上，進行顯色并拍照。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

本研究中，實驗數(shù)據(jù)均為至少3次獨立重復(fù)實驗結(jié)果，并用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean ± SEM)來表示，用 GraphPad Prim 5 軟件進行數(shù)據(jù)處理和分析，兩組間比較采用t檢驗，P<0.05 則認(rèn)為結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清淀粉樣蛋白A1對HN4細(xì)胞活力的影響

MTT是一種檢測細(xì)胞存活和生長的方法。如圖1所示，與未給予SAA1組相比，給予SAA1組(5 μmol·L-1和10 μmol·L-1)細(xì)胞活力明顯升高(*P<0.05)。實驗結(jié)果表明SAA1能夠增強HN4細(xì)胞活力。

HN4細(xì)胞經(jīng)SAA1刺激24 h后，以SAA1 0 μmol·L-1組為1， 使用MTT法檢測細(xì)胞活力，*P<0.05，與SAA1 0 μmol·L-1組相比。圖1 血清淀粉樣蛋白A1對HN4細(xì)胞活力的影響

2.2 血清淀粉樣蛋白A1對HNSCC細(xì)胞HN4遷移能力的影響

劃痕實驗又稱為體外傷口愈合實驗，是一種檢測細(xì)胞遷移運動和修復(fù)能力的方法。

根據(jù)結(jié)果2.1，我們發(fā)現(xiàn)高濃度SAA1(5 μmol·L-1和10 μmol·L-1)能夠增強HN4的細(xì)胞活力。為了排除SAA1對細(xì)胞活力的影響，我們選擇了低濃度SAA1(1 μmol·L-1和2.5 μmol·L-1)刺激HN4細(xì)胞進行劃痕實驗。圖2中，與PBS相比，劃痕12 h后，2.5 μmol·L-1SAA1能夠促進HN4 (圖2A，2B) 細(xì)胞劃痕的愈合以及細(xì)胞的遷移運動，而1 μmol·L-1SAA1對HN4細(xì)胞劃痕愈合的作用沒有顯著性差異。

實驗結(jié)果表明2.5 μmol·L-1SAA1對頭頸部鱗狀癌細(xì)胞HN4的遷移運動有促進作用。

A：SAA1(1 μmol·L-1，2.5 μmol·L-1)刺激HN4細(xì)胞12 h后，劃痕實驗檢測SAA對HN4細(xì)胞遷移能力的影響； B：SAA1刺激HN4細(xì)胞劃痕愈合面積比；*P<0.05，**P<0.01，與PBS組相比。圖2 人血清淀粉樣蛋白A1對頭頸部鱗狀癌細(xì)胞HN4遷移能力的影響

2.3 血清淀粉樣蛋白A1對HNSCC各細(xì)胞系中CXCR3A的表達(dá)量的影響

CXCR3A 是一種對腫瘤具有重要影響的趨化因子受體，主要影響腫瘤的遷移侵襲能力等[18]。為了進一步探究SAA1如何調(diào)控HNSCC細(xì)胞增殖與遷移能力，我們進一步檢測SAA1是否通過影響HNSCC細(xì)胞中CXCR3A的表達(dá)調(diào)控細(xì)胞的遷移能力。檢測了10 μmol·L-1SAA1刺激HNSCC各細(xì)胞系12 h后CXCR3A的變化量，與PBS組相比，發(fā)現(xiàn)10 μmol·L-1SAA1刺激12 h后，HN4細(xì)胞中CXCR3A的mRNA水平有明顯的升高(圖3)。

10 μmol·L-1 SAA1 刺激HN4，HN12，SCC25，Cal27，HN30細(xì)胞12 h后， 實時熒光定量PCR檢測CXCR3A的mRNA表達(dá)水平，以各細(xì)胞系PBS 組為1計算CXCR3A相對表達(dá)量。*P<0.05，與PBS組相比。圖3 人血清淀粉樣蛋白A1對人頭頸癌細(xì)胞 各細(xì)胞系表達(dá)CXCR3A的影響

2.4 SAA1能夠激活Erk1/2和p38 MAPK通路

MAPK的活化是調(diào)控CXCR3A的一條重要的信號途徑[19]。因此我們檢測了SAA1刺激HN4細(xì)胞后Erk1/2和p38 MAPK的激活水平。同時，我們也檢測了Akt信號通路的變化，實驗結(jié)果表明SAA1刺激能夠引起HN4細(xì)胞Erk1/2和p38 MAPK磷酸化水平顯著性增加，對Akt的磷酸化無顯著影響(圖4)。

A：10 μmol·L-1 SAA1 刺激HN4細(xì)胞不同時間后，western blot檢測 p-Erk1/2，p-p38 MAPK的磷酸化水平，以及p-Akt 磷酸化水平； B～D：灰度統(tǒng)計分析；*P<0.05，**P<0.01，與0 min組相比。圖4 SAA1能夠激活Erk1/2，p38 MAPK通路

3 討論

血清淀粉樣蛋白A作為一種急性時相蛋白，當(dāng)機體內(nèi)出現(xiàn)急性時相反應(yīng)時，其體內(nèi)濃度會迅速升高[8]。SAA1的分子量為12 kD；與許多蛋白質(zhì)類似，其前體形式包含一段18個氨基酸的信號肽，這段信號肽在分泌過程中會被信號肽酶剪切，得到長度為104個氨基酸的成熟SAA1蛋白[20]。在本研究中主要探索血清淀粉樣蛋白A1在頭頸部鱗狀癌細(xì)胞HN4中的作用。已有研究發(fā)現(xiàn) SAA1的升高與腫瘤如肺鱗癌、食道鱗狀細(xì)胞癌等的發(fā)生率有著較高的相關(guān)性，且其濃度隨著癌癥分期的嚴(yán)重程度增加[9,11,21]；SAA1在HNSCC患者血清中的表達(dá)水平明顯高于正常人，且腫瘤組織中SAA1的表達(dá)量也明顯高于正常粘膜組織[12]。然而，SAA1高水平的表達(dá)對HNSCC腫瘤細(xì)胞的影響及其機制尚不明確。本研究主要探討在多種腫瘤中高水平表達(dá)的SAA1對于頭頸部鱗狀癌細(xì)胞HN4的細(xì)胞活力和遷移能力的影響。

CXCR3A，也被稱為G蛋白偶聯(lián)受體9(GPR9)或CD183，是一種具有7次跨膜結(jié)構(gòu)域的G蛋白偶聯(lián)受體，通過特異性結(jié)合配體而被激活發(fā)揮作用，誘導(dǎo)多種細(xì)胞反應(yīng)。CXCR3A是CXCR3的一個重要的亞型，具有CXCR3的經(jīng)典功能，包括在IFN-g誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)中的趨化性和細(xì)胞增殖等，在腫瘤的形成與發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[13,18]。已有研究發(fā)現(xiàn)，CXCR3A在前列腺腫瘤的表達(dá)量明顯高于正常組織中，且其升高與該腫瘤細(xì)胞的增殖遷移能力呈正相關(guān)[16]。CXCR3A也被認(rèn)為是一類具有良好前景的抗腫瘤靶點。SAA是一種具有與細(xì)胞因子類似的功能與性質(zhì)的急性時相蛋白，它能夠誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子或趨化因子的表達(dá)[7]。本研究中，我們以

SAA1作為刺激劑，發(fā)現(xiàn)SAA1通過誘導(dǎo)HN4細(xì)胞表達(dá)CXCR3A促進HN4細(xì)胞的增殖與遷移。在結(jié)果2.3中，SAA1刺激后HN12細(xì)胞中CXCR3A的mRNA水平亦出現(xiàn)上調(diào)，但HN30細(xì)胞中CXCR3A的表達(dá)沒有明顯升高。HN4/HN12和HN30/HN31細(xì)胞是來自于口腔癌或咽癌的一系列細(xì)胞株，其中原發(fā)性HN4細(xì)胞的轉(zhuǎn)移性衍生細(xì)胞株被命名為HN12，原發(fā)性HN30細(xì)胞的轉(zhuǎn)移性衍生細(xì)胞株被命名為HN31。有研究通過多重?zé)晒庠浑s交(M-FISH)和陣列比較基因組雜交技術(shù)(array CGH)對頭頸部鱗狀癌2種不同細(xì)胞系(HN4-HN12和HN30-HN31)進行分析，發(fā)現(xiàn)HNSCC中基因組的改變，其中HN12和HN30細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了SIX3和MMP家族基因的過表達(dá)，但在HN31和HN4細(xì)胞中SIX3基因的表達(dá)正常；一種新的抑癌基因WWOX的表達(dá)水平在這4種細(xì)胞系中亦不同，HN12，HN30和HN31細(xì)胞中沒有發(fā)現(xiàn)WWOX基因的表達(dá)[22]。因此，我們CXCR3A在HN30細(xì)胞系中的表達(dá)差異可能與細(xì)胞株中腫瘤發(fā)展相關(guān)基因表達(dá)的傾向有關(guān)。

MAPK是一組能夠被多種胞外刺激(如細(xì)胞因子、細(xì)胞應(yīng)激等)激活的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。其中Erk和p38 MAPK的激活參與了細(xì)胞增殖、分化和凋亡等活動。具有趨化活性和類細(xì)胞因子活性的SAA1能夠有效誘導(dǎo)Erk1/2，p38 MAPK的磷酸化[23]。SAA1與TLR2、4的相互作用可激活細(xì)胞內(nèi)信使，如 MyD88 和 MAPKs，以及下游包括 NF-κB在內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子，從而刺激一些腫瘤相關(guān)細(xì)胞因子及其受體的表達(dá)[5-7]。本研究中使用Western印跡法檢測了SAA1刺激不同時間后MAPKs(包括Erk1/2，p38 MAPK)的表達(dá)，結(jié)果表明SAA1 能夠誘導(dǎo)Erk1/2，p38 MAPK的磷酸化，且在刺激時間為30 min時其磷酸化水平達(dá)到峰值。p38 MAPK的激活能夠誘導(dǎo)NF-κB和AP-1兩個轉(zhuǎn)錄因子的活化，這兩個轉(zhuǎn)錄因子是調(diào)控MMP-2和MMP-9基因表達(dá)的重要分子[24]；Erk-MAPK在細(xì)胞的生長分化中具有重要作用，并介導(dǎo)了調(diào)控細(xì)胞遷移運動的信號通路，活化的Erk通過磷酸化肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈激酶 (myosin light chain kinase,MLCK) 調(diào)節(jié)膜突起和粘著斑的轉(zhuǎn)化過程，調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移運動；Erk的活化同時也與多種細(xì)胞基質(zhì)蛋白的表達(dá)密切相關(guān)，如纖連蛋白 (Fibronectin)，波連蛋白 (Vitronetin)等[25]。Akt被認(rèn)為是PI3K信號途徑中的關(guān)鍵信號轉(zhuǎn)導(dǎo)激酶和下游效應(yīng)分子，Girdin是Akt信號通路的重要靶標(biāo)，它能夠被Akt磷酸化后激活，誘導(dǎo)MMPs的表達(dá)水平和活性；Girdin也能夠結(jié)合并激活Gαi3進一步激活A(yù)kt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[26]；RAC1是PI3K/Akt/mTOR通路下游的一個重要的靶標(biāo)分子，調(diào)控E-cadherin和Snail的 產(chǎn)生和激活水平，并與它們協(xié)同作用介導(dǎo)細(xì)胞遷移[27-28]。因此Akt的激活是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和遷移的重要信號，但在本研究中我們發(fā)現(xiàn)SAA1不能激活A(yù)kt信號通路。因此，我們推論SAA1主要通過影響MAPK的活化影響CXCR3A的表達(dá)。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)SAA1能夠誘導(dǎo)CXCR3A的表達(dá)且增強頭頸部鱗狀癌細(xì)胞HN4的細(xì)胞活力與遷移能力，其作用機制可能與誘導(dǎo)Erk1/2和p38 MAPK活化相關(guān)，仍需進一步研究證明。該發(fā)現(xiàn)對于SAA1在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的診斷、預(yù)后以及治療中的應(yīng)用研究提供了新的方向；同時也為尋找頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的新型藥物作用靶點提供理論依據(jù)。