李眾，梁偉華，張貞，王寧，美爾·吐合塔米什，鄒泓，顧文藝，齊妍*

(1石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理系，新疆 石河子 832002； 2澳大利亞昆士蘭大學(xué)生物工程與納米研究所，澳大利亞 布里斯班 4702)

滑膜肉瘤(synovial sarcoma，SS)是軟組織肉瘤中最具上皮分化特征的惡性腫瘤之一，約占所有軟組織肉瘤的10%，SS可發(fā)生在任何年齡和任何部位，但主要好發(fā)于15到35歲的青少年，發(fā)生部位主要為四肢，少數(shù)發(fā)生在頭頸部和軀干[1]。在SS組織學(xué)分型中以單相纖維型(MFSS)和雙相型(BSS)最為常見。目前SS患者治療后整體預(yù)后較差，因此尋求新的靶向藥物提高患者預(yù)后生存率是亟待解決的問題。

POLO樣激酶1(Polo-like kinase1，PLK1)是一種廣泛存在于真核細(xì)胞中的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，并且參與有絲分裂中的中心體復(fù)制、紡錘體形成和染色體分離等多個(gè)過程[2]。目前已證實(shí)PLK1在人類大多數(shù)腫瘤中如胃癌、膀胱癌、肺癌、乳腺癌和胰腺癌等過表達(dá)，通過利用siRNA或特異性激酶抑制劑阻斷PLK1表達(dá)，能有效抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，延緩腫瘤發(fā)展進(jìn)程，繼而改善患者預(yù)后[3-5]，但PLK1在軟組織腫瘤中研究甚少。本研究通過檢測(cè)PLK1蛋白在SS組織中的表達(dá)，分析其與SS患者臨床病理參數(shù)及預(yù)后的相關(guān)性，為SS臨床診治及分子機(jī)制研究提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本情況，患者隨訪情況及相關(guān)試劑

收集1968年至2019年間石河子大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科和新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科46例SS患者的手術(shù)存檔蠟塊，選擇23例非腫瘤樣本作為對(duì)照組(7例腫瘤旁肌組織和16例慢性滑膜炎)，所有患者的組織病理檢查結(jié)果均已明確診斷，組織學(xué)分級(jí)根據(jù)FNCLCC(法國(guó)國(guó)家癌癥控制中心聯(lián)合會(huì))分級(jí)，臨床分期根據(jù)2016版軟組織腫瘤NCCN指南。46例SS患者中隨訪例數(shù)為28例，因聯(lián)系方式或住址更換等原因?qū)е率гL18例，隨訪率為60.87%。主要試劑為兔抗人PLK1 單克隆抗體，購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司，稀釋濃度為 1∶500，采用Envision二步法試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，設(shè)立空白、陽性及陰性對(duì)照。

1.2 免疫組化評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

免疫組化評(píng)分由2名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)師采取雙盲法獨(dú)立閱片，當(dāng)結(jié)果出現(xiàn)差異時(shí)，由上級(jí)醫(yī)師判定最終結(jié)果。顯微鏡下隨機(jī)選取10個(gè)400倍視野，觀察每個(gè)視野下SS組織染色強(qiáng)度并記錄陽性細(xì)胞所占比例。PLK1陽性細(xì)胞以細(xì)胞核呈棕褐色顆粒計(jì)為染色陽性。陽性細(xì)胞所占百分比小于5%，計(jì)0分；6%～25%，計(jì)1分；26%～50%，計(jì)2分；51%～75%，計(jì)3分；76%～100%，計(jì)4分。陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度為無著色，計(jì)0分；淺棕著色，計(jì)1分；棕黃色著色，計(jì)2分；棕褐色著色，計(jì)3分。兩項(xiàng)相乘后得分0～1分為-，2～4分為+，5～8分為++，9～12分為+++。本研究++以上計(jì)為強(qiáng)陽性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，PLK1與SS患者臨床病理參數(shù)之間及PLK1在SS組織中與對(duì)照組織中的差異性檢驗(yàn)選用連續(xù)性校正卡方檢驗(yàn)，通過Kaplan-Meier法分析 PLK1表達(dá)與SS患者預(yù)后的關(guān)系，運(yùn)用Cox回歸模型對(duì)SS患者生存時(shí)間進(jìn)行單因素及多因素分析，P<0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PLK1在不同類型SS組織中的表達(dá)情況

PLK1在SS組織中呈現(xiàn)明顯的胞核著色，PLK1在SS組織均為高表達(dá)，陽性率為78.26%(36/46)，強(qiáng)陽性率為45.65%(21/46)，在BSS中(圖1A)，陽性率76.92%(30/39)，強(qiáng)陽性率43.59%(17/39)，在MFSS中(圖1B)，陽性率85.71%(6/7)，強(qiáng)陽性率57.14%(4/7)。在對(duì)照組中(圖1C,D)，PLK1呈低表達(dá)，陽性率26.09%(6/23)，兩組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=17.524，P<0.001)(表1)。

圖1 PLK1在SS不同組織類型及對(duì)照組中的免疫組化染色結(jié)果圖

2.2 PLK1蛋白表達(dá)與SS患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.2.1 年齡、性別及發(fā)病部位

本組46例SS診斷時(shí)最小年齡10歲，最大年齡70歲，平均年齡 37歲，男性25 例，女性 21例，男女比例接近1∶1，發(fā)病高峰年齡段15～35歲(占42.83%)，本研究年齡分界線為20歲時(shí)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異最顯著，PLK1在大于20歲患者中的表達(dá)明顯高于小于20歲的患者(χ2=4.064，P=0.044)；46例SS中發(fā)生于四肢29例，軀干12例，頭頸部3例，盆腔/腹膜2例，四肢和軀干所占比例較高，為63.04%和26.09%，PLK1的表達(dá)與性別(P=0.963)和發(fā)病部位(P=0.647)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表2)。

2.2.2 組織學(xué)分型、腫瘤大小及是否轉(zhuǎn)移

在本研究收集的46例SS患者中，MFSS占15.22%(7/46)，BSS占84.78%(39/46)，原發(fā)腫瘤直徑大于5 cm患者占67.39%(31/46)，小于5 cm占32.61%(15/46)，發(fā)生轉(zhuǎn)移患者占32.61%(15/46)，未發(fā)生轉(zhuǎn)移占67.39%(31/46)。結(jié)果顯示PLK1表達(dá)與組織學(xué)分型(P=0.983)、腫瘤大小(P=0.855)及是否轉(zhuǎn)移(P=0.562)無顯著相關(guān)性(表2)。

2.2.3 組織學(xué)分級(jí)及臨床分期

本組46例SS中FNCLCC分級(jí)I-II級(jí)患者12例，III級(jí)34例；TNM分級(jí)中I-II級(jí)患者17例，III-IV級(jí)29例；結(jié)果顯示，PLK1在患者FNCLCC分級(jí)III級(jí)中的表達(dá)明顯高于I-II級(jí)(χ2=5.540，P=0.019)，臨床分期III-IV期中的表達(dá)明顯高于I-II期(χ2=4.313，P=0.038)，提示PLK1高表達(dá)有可能促進(jìn)SS發(fā)生發(fā)展(表2)。

表2 PLK1表達(dá)與SS患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3 PLK1表達(dá)水平與SS患者生存時(shí)間的相關(guān)性

通過Cox回歸模型，分別探討性別、年齡、腫瘤直徑、腫瘤部位、組織學(xué)分型、FNCLCC分級(jí)、TNM分期和腫瘤轉(zhuǎn)移等臨床病理參數(shù)以及PLK1表達(dá)水平對(duì)患者生存時(shí)間的影響。

單因素 Cox 回歸分析顯示，TNM分期III-IV期(P=0.019)、PLK1高表達(dá)(P=0.042)和腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移(P=0.002)是影響SS患者生存時(shí)間的危險(xiǎn)因素，多因素Cox回歸分析結(jié)果顯示，腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移是患者生存時(shí)間的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P=0.002)(表3)。

表3 SS患者生存時(shí)間單因素及多因素Cox回歸分析

28例SS患者隨訪時(shí)間為3～69個(gè)月，中位隨訪時(shí)間為37個(gè)月，其中8例存活，20例死亡。PLK1表達(dá)陽性患者生存時(shí)間(3～69個(gè)月，中位時(shí)間為23個(gè)月)明顯少于PLK1表達(dá)陰性患者(25～65個(gè)月，中位時(shí)間為52個(gè)月)，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.571，P=0.033)(圖2)，提示PLK1高表達(dá)患者預(yù)后差。

圖2 PLK1表達(dá)狀態(tài)和SS患者臨床預(yù)后的相關(guān)性

3 討論

SS好發(fā)于青少年，侵襲能力較強(qiáng)且對(duì)放化療藥物不敏感，臨床目前對(duì)于SS治療采用以手術(shù)廣泛切除為主，放療化療輔助治療模式，但根據(jù)美國(guó)國(guó)家癌癥研究所的流行病學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)資料顯示，近30年來 SS患者生存期及臨床治療未得到明顯改善，患者5年生存率僅約60%[6]，且不同年齡段預(yù)后不同。Wang等[7]對(duì)999名SS患者10年的生存情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示在小于15歲SS患者中10年存活率為80%，而在大于15歲SS患者10年整體存活率僅約為40%，且隨著患者年齡增加，預(yù)后越差，同時(shí)顯示轉(zhuǎn)移性SS與局灶性SS相比，患者預(yù)后更差。本研究因病例數(shù)較少，SS患者預(yù)后與年齡之間無明顯相關(guān)性，但PLK1表達(dá)在大于20歲的患者中明顯高于小于20歲患者，且PLK1高表達(dá)提示患者預(yù)后差。SS在2016版WHO仍被歸為組織起源不定的軟組織肉瘤，近年來認(rèn)為SS是干細(xì)胞源性惡性腫瘤[8]，因此，在臨床研究中，樣本對(duì)照的選擇始終存在一定困擾。近期Pazzaglia等[9]檢測(cè)miR-494.3p在42例滑膜肉瘤組織的表達(dá)情況，采用非腫瘤組織作為對(duì)照，結(jié)果顯示miR-494.3p表達(dá)在SS組織中明顯低于對(duì)照組，提示miR-494.3p具有抑癌作用。本研究結(jié)果顯示，PLK1在SS組織中的表達(dá)明顯高于非腫瘤組，提示PLK1具有促癌作用，這些為SS相關(guān)研究帶來一定參考價(jià)值。

PLK1因其在腫瘤細(xì)胞周期中發(fā)揮重要的調(diào)控作用而受到廣泛關(guān)注，研究顯示 PLK1 在腫瘤細(xì)胞分裂周期中主要在G2/M 期發(fā)揮作用[10]，通過參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞G2/M 期轉(zhuǎn)化及 DNA的復(fù)制,激活調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝相關(guān)途徑的腺苷酸活化酶等下游信號(hào)分子，從而發(fā)揮促進(jìn)中心體的成熟、染色體的分離及胞質(zhì)分裂的作用[11-12]。PLK1抑制劑或siRNA可顯著抑制PLK1表達(dá)，引起腫瘤細(xì)胞發(fā)生明顯的G2/M期阻滯，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡，從而延緩腫瘤發(fā)生發(fā)展進(jìn)程，改善患者預(yù)后[13-15]。這引起一些學(xué)者的高度關(guān)注，近年來，陸續(xù)出現(xiàn)不同的PLK1抑制劑，且有些研究小組已經(jīng)將PLK1抑制劑作為抗腫瘤藥物進(jìn)行研究。Stadler等[16]將PLK1抑制劑Volasertib用于50例尿路上皮癌患者的臨床二期研究，注射劑量為300 mg，每三周注射一次，結(jié)果顯示在患者體內(nèi)注射藥物后并未引起明顯的不良反應(yīng)，同時(shí)觀測(cè)到Volasertib對(duì)腫瘤活性產(chǎn)生了一定抑制作用。Olmos[17]和Frost[18]研究小組分別將PLK1抑制劑GSK461364 和BI2536用于臨床一期研究，取得了相似的結(jié)果。由此，我們推測(cè)PLK1抑制劑有望成為SS的靶向治療藥物，為患者臨床治療帶來曙光。

目前對(duì)于PLK1在SS中的研究相對(duì)較少，PLK1在SS發(fā)生發(fā)展中如何發(fā)揮作用尚不清楚。SS分子遺傳學(xué)改變最具特征的是特異性染色體易位t(X；18)(p11.2；q11.2)及其融合基因SS18-SSX的發(fā)現(xiàn)，90%以上的患者中存在SS18-SSX高表達(dá)，且在SS發(fā)生發(fā)展中起到關(guān)鍵致瘤作用[19-21]，這使人們認(rèn)識(shí)到特異性染色體易位可能是滑膜肉瘤發(fā)生的早期事件，SS18-SSX的表達(dá)產(chǎn)物作為異常轉(zhuǎn)錄輔助因子可能參與滑膜肉瘤的分化和發(fā)生發(fā)展，但通過哪些關(guān)鍵因子導(dǎo)致腫瘤發(fā)生，具體機(jī)制不詳。Isfort等[22]發(fā)現(xiàn)在SS細(xì)胞系中SS18-SSX融合基因高表達(dá)可以激活PLK1下游 YAP/TAZ信號(hào)通路，從而促進(jìn)SS細(xì)胞增殖，反之沉默SS18-SSX融合基因表達(dá)則會(huì)使抑制YAP/TAZ通路，導(dǎo)致SS細(xì)胞增殖受到抑制。有趣的是，此研究還顯示PLK1表達(dá)水平會(huì)隨著SS18-SSX融合基因表達(dá)升高而升高，提示PLK1有可能對(duì)SS18-SSX融合基因有一定的調(diào)控作用。Slotkin等[23]發(fā)現(xiàn)在SYO-1細(xì)胞系中沉默SS18-SSX融合基因下游的G1/S期調(diào)控蛋白SHCBP1可以明顯激活PLK1分子下游PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路，從而降低Cyclin D1的表達(dá)，使SS細(xì)胞增殖受到抑制。Setsu等[24]在112例SS患者樣本中發(fā)現(xiàn)PLK1下游Akt/mTOR通路處于激活狀態(tài)，后者可以激活4E結(jié)合蛋白1(4E-BP1)，高表達(dá)的4E-BP1與SS出現(xiàn)異常有絲分裂、壞死以及侵襲密切相關(guān)。本研究結(jié)果同樣顯示，PLK1表達(dá)與異常有絲分裂、壞死、臨床分期密切相關(guān)，其表達(dá)越高，組織學(xué)分級(jí)及臨床分期越高。綜上所述，我們可以看出PLK1可通過激活不同下游信號(hào)通路，在SS發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮重要的作用，具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究初步發(fā)現(xiàn)PLK1表達(dá)與SS患者臨床病理參數(shù)及預(yù)后存在密切關(guān)系，其高表達(dá)提示預(yù)后差，表明PLK1可能參與了SS的發(fā)生發(fā)展，并可能成為SS分子治療的潛在靶點(diǎn)，為后續(xù)的深入探討奠定了研究基礎(chǔ)。