王 玲 王金濤 叢勝波 許 冬 萬 鵬

（農(nóng)業(yè)部華中作物有害生物綜合治理重點實驗室/農(nóng)作物病蟲草害防控湖北省重點實驗室/湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植保土肥研究所武漢 430064）

紅鈴蟲（Pectinophora gossypiella），屬鱗翅目Lepidoptera麥蛾科Gelechiidae，是一種世界性的重要棉花害蟲，以其幼蟲危害棉蕾和花鈴，導(dǎo)致棉鈴內(nèi)部的纖維受損或者造成蕾鈴與棉籽脫落，使棉鈴重量減輕、纖維品質(zhì)下降甚至棉籽破碎［1］。2000年之前，紅鈴蟲在我國長江流域棉區(qū)常年為害成災(zāi)，致使棉花產(chǎn)量損失10%～30%，嚴重影響了該區(qū)域的棉花生產(chǎn)［2］。

蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt），是一種革蘭氏陽性菌，在產(chǎn)孢過程中產(chǎn)生具有殺蟲活性的晶體蛋白［3］。自轉(zhuǎn)Bt基因棉花商業(yè)化種植之后，為紅鈴蟲等鱗翅目害蟲的防治提供了新的有效的手段。隨著Bt棉花的不斷種植，紅鈴蟲的種群數(shù)量得到了有效的控制［4］。然而，由于紅鈴蟲是寡食性害蟲，在棉田面臨著持續(xù)的選擇壓力，對Bt棉花存在抗性演化的風(fēng)險。事實上，世界范圍內(nèi)已發(fā)現(xiàn)一些田間紅鈴蟲種群對Bt棉花產(chǎn)生了實質(zhì)抗性，其抗性問題嚴重威脅著Bt棉花的持續(xù)使用。

1 紅鈴蟲對Bt棉花的抗性現(xiàn)狀

我國長江流域自2000年開始種植轉(zhuǎn)Bt（Cry1Ac）基因棉花，隨著Bt棉花的大面積推廣應(yīng)用，有效的抑制了紅鈴蟲的發(fā)生與危害。然而，該區(qū)域并沒有要求種植一定比例的非Bt棉花作為“庇護所”，隨著Bt棉種植面積的增加，到2006年，非Bt棉花的種植比例首次下降到20%以下［4］。到2008～2009年，非Bt棉花的種植比例降至12%。直至2010年開始，F(xiàn)2代Bt棉花的種植比例大幅度上升，為紅鈴蟲提供了23%的非Bt棉庇護所，此后非Bt棉花的比例常年維持在25%左右［4］。常年的抗性監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，2008～2010年長江流域棉區(qū)紅鈴蟲對Cry1Ac的敏感性相對于2005～2007年有所下降，表現(xiàn)出早期預(yù)警［5］；而2011～2015年該區(qū)域紅鈴蟲對Cry1Ac的敏感性相對于2008～2010又明顯上升。此外，通過檢測7種已知的抗性等位基因，發(fā)現(xiàn)2012～2015年這7種抗性等位基因的基因頻率均處于較低水平，7種等位基因的總頻率從2012年的0.0105（0.0084～0.0132）下 降 到 2015 年 的 0.0046（0.0031～0.0067），下降了2.3倍［6］。這說明“庇護所”對延緩紅鈴蟲對Bt棉花的抗性演化是十分重要的，2006～2009年期間由于非Bt棉的比例極低，導(dǎo)致早期預(yù)警的發(fā)生，但隨著2010年F2代Bt棉的大面積種植，提供了充足的非Bt棉庇護所，反轉(zhuǎn)了紅鈴蟲對Bt棉花的早期抗性，同時還減少了化學(xué)農(nóng)藥的使用［4］。因此，到目前為止，我國長江流域紅鈴蟲對Bt棉花仍然保持著較好的敏感性（表1）。

表1 三個國家Bt棉花的種植及紅鈴蟲田間抗性現(xiàn)狀

美國亞利桑那州在引進Bt棉花之前，紅鈴蟲的種群密度常年較高。自1996年開始種植轉(zhuǎn)Bt（Cry1Ac）基因棉花，該區(qū)域的棉花種植者一直遵循法定的“庇護所”策略，部分田塊用于種植非Bt棉花，使得該區(qū)域非Bt棉花的種植比例每年達25%以上［7］。到2005年，Bt棉花造成了紅鈴蟲種群密度的區(qū)域性下降和廣譜殺蟲劑噴灑量的減少［8］。2003年，美國開始逐漸從單一種植轉(zhuǎn)Bt（Cry1Ac）單價棉轉(zhuǎn)向同時種植單價棉和轉(zhuǎn)Bt（Cry1Ac+Cry2Ab）雙價棉。常年對亞利桑那州田間種群進行室內(nèi)生物測定及抗性等位基因檢測，發(fā)現(xiàn)1997年～2005年，該區(qū)域的田間紅鈴蟲種群對Cry1Ac的敏感性并沒有下降（表1）［7］。從2006年開始，美國開始施行紅鈴蟲根除計劃，通過在田間釋放大量輻射不育的成蟲來延緩紅鈴蟲對 Bt棉花的抗性［7，9］。自此，亞利桑那州的紅鈴蟲種群數(shù)量急劇下降：田間非Bt棉上的紅鈴蟲幼蟲從2005年的15.3%下降到2009年的0.012%，下降了99.92%；而信息素誘集的成蟲數(shù)量從2005年的每周26.7只下降至2009年的0.0054只，下降了99.98%［9］。2010年～2018年，亞利桑那州田間棉鈴上未發(fā)現(xiàn)紅鈴蟲幼蟲；2013年～2018年，田間未發(fā)現(xiàn)野生的紅鈴蟲成蟲［10］。其他州的情況與亞利桑那州類似，最終美國農(nóng)業(yè)部于2018年10月宣布紅鈴蟲已在美國被根除［10］。

印度自2002年開始種植轉(zhuǎn)Bt（Cry1Ac）基因棉，2006年開始引進轉(zhuǎn)Bt（Cry1Ac+Cry2Ab，Bollgard II）雙價棉。雖然印度基因工程批準(zhǔn)委員會（GEAC）要求種植20%非Bt棉花作為庇護所以延緩抗性發(fā)展，但印度農(nóng)戶并沒有嚴格執(zhí)行。2014年，印度轉(zhuǎn)Bt棉花的種植面積已達棉花種植總面積的 95%，而 Bt棉中 96%為轉(zhuǎn) Bt（Cry1Ac+Cry2Ab）雙價棉，而轉(zhuǎn)Bt（Cry1Ac）單價棉僅占4%［11］（Choudhary和Gaur，2015年）。與美國和中國對Bt棉花的持續(xù)敏感性不同，在印度，由于非Bt棉庇護所非常稀少，紅鈴蟲迅速發(fā)展出對Bt棉花的實際抗性［12，13］。2008年，首次記錄了印度古吉拉特邦田間紅鈴蟲種群對Cry1Ac產(chǎn)生抗性（表1）［14］。2014年，來自印度中部的8個田間種群對Cry1Ac和Cry2Ab的平均抗性倍數(shù)分別為310和78，而且轉(zhuǎn)Bt（Cry1Ac+Cry2Ab）雙價棉棉鈴上的幼蟲侵染率（52%）高于非Bt棉上的幼蟲侵染率（27%）［13］。到 2015年，紅鈴蟲對轉(zhuǎn)Bt（Cry1Ac+Cry2Ab）雙價棉產(chǎn)生抗性在印度棉區(qū)已經(jīng)普遍存在［13］。

2 紅鈴蟲對Bt的抗性機制

紅鈴蟲對Bt的抗性機制目前可以歸為兩類，一種是對Cry1Ac的抗性，目前已報道的所有室內(nèi)或者田間紅鈴蟲Cry1Ac抗性品系或者抗性個體均有鈣粘蛋白基因（PgCad1）介導(dǎo)，尚未發(fā)現(xiàn)其他基因介導(dǎo)紅鈴蟲對Cry1Ac的抗性。總共報道了17種不同的PgCad1抗性等位基因［15-22］，這些抗性等位基因全部涉及PgCad1的突變，只有r17還涉及了PgCad1的表達量下調(diào)（表2）。在這17種抗性等位基因中，有9種抗性等位基因（r5、r7-r12、r15、和r17）發(fā)生了可變剪切或錯誤剪切，產(chǎn)生2～4種不同的轉(zhuǎn)錄本［18，21，22］；說明可變剪切或錯誤剪切在紅鈴蟲PgCad1抗性等位基因中是普遍存在的。抗性等位基因r3、r15和r16均發(fā)生了轉(zhuǎn)座子的插入，其中r3等位基因在第21個外顯子插入一個4739 bp的非LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子［23］，r16等位基因在第20個外顯子插入一個1545 bp的退化轉(zhuǎn)座子［20］，r15等位基因最為特殊，在第28個外顯子插入了一個3370 bp的片段，該插入片段是一種MITE轉(zhuǎn)座子，且MITE轉(zhuǎn)座子中包含了另外2次轉(zhuǎn)座子插入事件，插入了SINE與RTE這2種轉(zhuǎn)座子［21］，這說明轉(zhuǎn)座子插入也是導(dǎo)致紅鈴蟲PgCad1突變的重要因素。所有的PgCad1抗性等位基因均編碼產(chǎn)生結(jié)構(gòu)不完整的鈣粘蛋白，涉及除胞內(nèi)區(qū)之外的各個區(qū)域，包括信號肽、鈣粘蛋白重復(fù)區(qū)域、近膜區(qū)以及跨膜區(qū)的變異，以鈣粘蛋白重復(fù)區(qū)域的變異為主，這些結(jié)構(gòu)不完整的鈣粘蛋白與Cry1Ac的結(jié)合能力下降或者定位錯誤，從而導(dǎo)致紅鈴蟲對Cry1Ac產(chǎn)生抗性［19-21］。此外，抗性等位基因r17的轉(zhuǎn)錄水平相對于敏感型PgCad1顯著下調(diào)79～190倍，這也是導(dǎo)致紅鈴蟲對Cry1Ac產(chǎn)生抗性的重要原因［22］。

表2 紅鈴蟲鈣粘蛋白抗性等位基因及其介導(dǎo)Cry1Ac抗性的機制

另一種是對Cry2Ab的抗性，與ABC轉(zhuǎn)運蛋白ABCA2基因（PgABCA2）的變異相關(guān)。美國室內(nèi)篩選的Cry2Ab抗性品系及印度田間的Cry2Ab抗性個體，均有由PgABCA2錯誤剪切導(dǎo)致［24］。完整的內(nèi)含子被保留、5′或3′的剪切位點被替換以及外顯子跳躍是導(dǎo)致PgABCA2發(fā)生錯誤剪切的主要原因，目前以及發(fā)現(xiàn)20種以上不同的剪切形式，主要涉及外顯子4、6、8、14與20，其中錯誤剪切導(dǎo)致外顯子6缺失在室內(nèi)抗性品系與田間抗性個體中均有發(fā)生［24］。值得一提的是，在紅鈴蟲中，Cry1Ac和Cry2Ab之間的交叉抗性是不對稱的，PgCad1突變的Cry1Ac抗性品系對Cry2Ab幾乎沒有交互抗性［19-21］，而Cry2Ab抗性品系卻對Cry1Ac存在交互抗性［25］。

3 展望

在中國、美國和印度，紅鈴蟲對Bt棉花的抗性演化存在驚人的差異，這說明合理有效的抗性治理策略對延緩害蟲的抗性發(fā)展至關(guān)重要。制定合理有效的抗性治理策略，依賴于對Bt與害蟲互作機制的掌握。就紅鈴蟲而言，目前無論是室內(nèi)的抗性品系，還是田間的抗性個體，都由PgCad1的不同突變形式介導(dǎo)Cry1Ac抗性，這說明PgCad1在Cry1Ac對紅鈴蟲的作用過程中是一個極為敏感的步驟，容易發(fā)生變異而導(dǎo)致抗性的發(fā)生。雖然來自三個國家的紅鈴蟲Cry1Ac抗性品系或個體都與PgCad1突變相關(guān)，但PgCad1突變的形式并不完全相同，這可能是由于三個國家Bt棉花的種植模式不同，紅鈴蟲受到的篩選壓力并不相同，從而導(dǎo)致田間種群的抗性演化有所差異。此外，PgCad1與PgABCA2的突變形式如此多樣化，也說明了田間抗性的發(fā)展是極其復(fù)雜的，田間很可能還存在更多的突變形式；也可能存在其他抗性基因介導(dǎo)紅鈴蟲對Cry1Ac或者Cry2Ab的抗性甚至介導(dǎo)二者的不對稱交互抗性，只有進一步深入了解這些抗性基因的類型及其對Bt抗性的貢獻大小與機制，才能有針對性的制定合理的抗性治理策略以繼續(xù)延緩紅鈴蟲對Bt棉花抗性的發(fā)展。