羅毅，范圣此，和飛，李秀鳳，孟兆青

山東宏濟(jì)堂制藥集團(tuán)股份有限公司，山東 濟(jì)南 250103

蟾酥為蟾蜍科動(dòng)物中華大蟾蜍BufobufogargarizansCantor或黑眶蟾蜍B.melanostictusSchneider的耳后腺和皮膚腺的干燥分泌物，是我國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥材。多于夏、秋兩季捕捉蟾蜍，洗凈，擠取耳后腺和皮膚腺的白色漿液，加工，干燥[1]。

目前，蟾酥商品質(zhì)量參差不齊，初加工的不規(guī)范是導(dǎo)致蟾酥藥材質(zhì)量千差萬(wàn)別的主要原因之一。蟾酥初加工方法研究已有一些報(bào)道，如：冷凍干燥、陰干、曬干、鼓風(fēng)干燥等[2-5]。通過實(shí)地調(diào)研發(fā)現(xiàn)，蟾酥的道地主產(chǎn)區(qū)(臨沂)的初加工方法是在17 ℃空調(diào)室內(nèi)利用風(fēng)扇避光干燥?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》(以下簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》)未規(guī)定應(yīng)用何種干燥方法和干燥時(shí)間，但不同的干燥方法，導(dǎo)致蟾酥的樣品外觀色澤(深黃色、黃色、淺黃色、白色)和化學(xué)成分的含量及組成比例存在較大差異，嚴(yán)重影響了蟾酥藥材質(zhì)量和臨床療效?；诖耍狙芯坎捎?種不同的干燥方法(17 ℃風(fēng)干、60 ℃烘干、80 ℃烘干、105 ℃烘干、120 ℃烘干、陰干、曬干、冷凍干燥)處理鮮蟾酥樣品，通過觀察干蟾酥的外觀色澤并利用HPLC對(duì)干蟾酥的沙蟾毒精、遠(yuǎn)華蟾毒精、蟾毒它靈、蟾毒靈、華蟾酥毒基、脂蟾毒配基6種成分進(jìn)行測(cè)定，確定蟾酥適宜的初加工方法，為蟾酥的初加工規(guī)范化提供理論依據(jù)。

1 材料

Agilent 1260高效液相系統(tǒng)；萬(wàn)分之一電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；pH計(jì)(梅特勒-托利多儀器有限公司)。

沙蟾毒精對(duì)照品(批號(hào)：20180945,純度>99.0%)、遠(yuǎn)華蟾毒精對(duì)照品(批號(hào)：20181089,純度>98.0%)、蟾毒它靈對(duì)照品(批號(hào)：20180314,純度>99.0%)、蟾毒靈對(duì)照品(批號(hào)：111981-201501,純度>98.0%)均購(gòu)于天津萬(wàn)象恒遠(yuǎn)科技有限公司；華蟾酥毒基對(duì)照品(批號(hào)：110803-201406,純度>99.6%)、酯蟾毒配基對(duì)照品(批號(hào)：110718-201108,純度>98.0%)均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純；水為超純水；其余試劑為分析純。

鮮蟾酥樣品采于臨沂費(fèi)縣，由山東中醫(yī)藥大學(xué)林桂濤教授鑒定為蟾蜍科動(dòng)物中華大蟾蜍B.bufogargarizansCantor耳后腺和皮膚腺分泌的白色漿液。

2 方法和結(jié)果

2.1 樣品制備

蟾酥鮮漿用60目篩過濾，去除雜質(zhì)，然后用藥勺將鮮漿轉(zhuǎn)移至模具中，按照不同的干燥方法(17 ℃風(fēng)干、60 ℃烘干、80 ℃烘干、105 ℃烘干、120 ℃烘干、陰干、曬干、冷凍干燥)進(jìn)行干燥，每隔一段時(shí)間進(jìn)行稱量，至連續(xù)2次稱量質(zhì)量不再變化為止，制成直徑20 mm，高約7 mm規(guī)格的圓餅狀蟾酥。

2.2 蟾酥外觀色澤

蟾酥鮮漿經(jīng)過不同的干燥方法(17 ℃風(fēng)干、60 ℃烘干、80 ℃烘干、105 ℃烘干、120 ℃烘干、陰干、曬干、冷凍干燥)制成的餅狀蟾酥及其粉碎成細(xì)粉外觀色澤出現(xiàn)明顯的差異(見圖1)。鮮漿未經(jīng)過加工呈現(xiàn)灰白色，膏體狀態(tài)。經(jīng)過冷凍干燥后的蟾酥為灰白色的粉末狀態(tài)，而其他加工后的蟾酥為褐色的塊狀。蟾酥粉粹后，17 ℃風(fēng)干、60 ℃烘干、陰干、曬干及冷凍干燥顏色較淺；80 ℃烘干、105 ℃烘干、120 ℃烘干的蟾酥顏色較深，隨著溫度越高，顏色越深。粉粹后蟾酥的顏色由淺變深變化為：冷凍干燥、曬干、17 ℃風(fēng)干、陰干、60 ℃烘干、80 ℃烘干、105 ℃烘干、120 ℃烘干。

注：A. 鮮漿；B. 60 ℃烘干的餅狀蟾酥；C. 80 ℃烘干的餅狀蟾酥；D. 105 ℃烘干的餅狀蟾酥；E. 120 ℃烘干的餅狀蟾酥；F. 陰干的餅狀蟾酥；G. 曬干的餅狀蟾酥；H. 冷凍干燥的餅狀蟾酥；I. 17 ℃風(fēng)干的餅狀蟾酥；J. 60 ℃烘干的粉碎后細(xì)粉；K. 80 ℃烘干的粉碎后細(xì)粉；L. 105 ℃烘干的粉碎后細(xì)粉；M. 120 ℃烘干的粉碎后細(xì)粉；N. 陰干的粉碎后細(xì)粉；O. 曬干的粉碎后細(xì)粉；P. 冷凍干燥的粉碎后細(xì)粉；Q. 17 ℃風(fēng)干的粉碎后細(xì)粉。圖1 不同干燥方法餅狀蟾酥及粉碎后的細(xì)粉

2.3 不同干燥方法的蟾酥樣品6種蟾酥內(nèi)酯類成分含量測(cè)定

2.3.1方法學(xué)考察

2.3.1.1對(duì)照品溶液的制備 精密稱取沙蟾毒精、遠(yuǎn)華蟾毒精、蟾毒它靈、蟾毒靈、華蟾酥毒基、酯蟾毒配基對(duì)照品10 mg，置于5 mL量瓶中，加入甲醇制得對(duì)照品質(zhì)量濃度為2 mg·mL-1。精密吸取適量上述6種對(duì)照品溶液，加入適量甲醇配置成沙蟾毒精0.045 mg·mL-1、遠(yuǎn)華蟾毒精0.009 mg·mL-1、蟾毒它靈0.03 mg·mL-1、蟾毒靈0.025 mg·mL-1、華蟾酥毒基0.051 mg·mL-1、酯蟾毒配基0.031 mg·mL-1的混合對(duì)照品溶液，備用。

2.3.1.2供試品溶液的制備 精密稱定蟾酥細(xì)粉25 mg，置于具塞錐形瓶中，加入甲醇溶液20 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流提取1 h，放置冷卻至室溫，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)充減失的質(zhì)量，搖勻，0.22 μm濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.1.3色譜條件 采用Alltima C18(250 mm×4.6 mm，5 μm) 色譜柱，流動(dòng)相為乙腈(A)-0.1%甲酸(B)，梯度洗脫(0～20 min，20%A；20～40 min，30%～35%A；40～60 min，35%～60%A；60～75 min，60%A)；流速0.7 mL·min-1；柱溫：25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：296 nm；進(jìn)樣量：10 μL。色譜圖見圖2。

2.3.1.4線性關(guān)系考察 以對(duì)照品質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸處理，得沙蟾毒精、遠(yuǎn)華蟾毒精、蟾毒它靈、蟾毒靈、華蟾酥毒基和酯蟾毒配基回歸方程，分別為：Y=13 748X+236.06(r=0.999 9)，Y=9 980.3X+34.599(r=0.999 8)，Y=8 447.2X+96.422(r=0.999 9)，Y=11 592X+114.78(r=0.999 5)，Y=15 154X+286.40(r=0.999 9)，Y=8 685.8X+103.36(r=0.999 9)。6種化合物分別在0.010～0.557、0.002～0.090、0.005～0.501、0.005～0.478、0.008～0.914、0.005～0.639 mg·mL-1線性關(guān)系良好。

2.3.1.5精密度試驗(yàn) 精密吸取同一混合對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算6個(gè)峰面積的RSD，沙蟾毒精為0.71%、遠(yuǎn)華蟾毒精為0.68%、蟾毒它靈為0.64%、蟾毒靈為0.72%、華蟾酥毒基為0.72%、酯蟾毒配基為0.81%，表明精密度良好。

2.3.1.6重復(fù)性試驗(yàn) 稱取蟾酥粉末約25 mg共6份，精密稱定，按供試品溶液處理方法制備樣品，測(cè)定6個(gè)化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD，沙蟾毒精為2.46%、遠(yuǎn)華蟾毒精為2.15%、蟾毒它靈為2.41%、蟾毒靈為3.22%、華蟾酥毒基為3.10%、酯蟾毒配基為3.09%，表明重復(fù)性良好。

注：A.對(duì)照品；B.供試品。圖2 對(duì)照品和蟾酥供試品HPLC圖

2.3.1.7穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液分別于2、4、6、8、12、24 h進(jìn)行分析，計(jì)算6個(gè)峰面積的RSD，沙蟾毒精為0.46%、遠(yuǎn)華蟾毒精為4.24%、蟾毒它靈為0.41%、蟾毒靈為1.47%、華蟾酥毒基為0.17%、酯蟾毒配基為0.72%，表明穩(wěn)定性良好。

2.3.1.8回收率試驗(yàn) 精密稱取適量蟾酥粉末6份，分別加入一定量的對(duì)照品，按供試品溶液處理方法制備樣品，測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。測(cè)得6個(gè)對(duì)照品加樣回收率分別為98.24%、99.44%、98.41%、98.37%、99.15%、106.79%，RSD分別為3.37%、3.25%、3.48%、3.26%、3.50%、3.14%。

2.3.2水分測(cè)定 按照 《中國(guó)藥典》第三法測(cè)定水分含量，結(jié)果見表1。17 ℃風(fēng)干、60 ℃烘干、陰干、曬干水分為5.99%～6.26%，80 ℃烘干、105 ℃烘干、120 ℃烘干、冷凍干燥水分為5.50%～5.64%。

2.3.3樣品測(cè)定 取17 ℃風(fēng)干、60 ℃烘干、80 ℃烘干、105 ℃烘干、120 ℃烘干、陰干、曬干、冷凍干燥加工樣品制備供試品溶液，計(jì)算沙蟾毒精、遠(yuǎn)華蟾毒精、蟾毒它靈、蟾毒靈、華蟾酥毒基、酯蟾毒配基的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，每個(gè)樣品平行3次，質(zhì)量分?jǐn)?shù)取平均值，結(jié)果見表1。6種成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)是扣除水分得到的實(shí)測(cè)值。經(jīng)過比較，8種不同的干燥方法中遠(yuǎn)華蟾毒精、蟾毒它靈、蟾毒靈、華蟾酥毒基、酯蟾毒配基、蟾酥內(nèi)酯類的質(zhì)量分?jǐn)?shù)沒有顯著變化，沙蟾毒精在17 ℃風(fēng)干、60 ℃烘干、陰干、曬干、冷凍干燥加工方法中質(zhì)量分?jǐn)?shù)沒有顯著變化。但是，沙蟾毒精在60 ℃烘干、80 ℃烘干、105 ℃烘干、120 ℃烘干時(shí)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。

表1 不同蟾酥初加工方法制備品中6種成分質(zhì)量分?jǐn)?shù) %

2.4 加工效率指標(biāo)測(cè)定

實(shí)驗(yàn)過程中記錄每種加工方式從蟾酥鮮漿到恒定質(zhì)量時(shí)的加工時(shí)間，以及干燥前后樣品的質(zhì)量，計(jì)算干燥后質(zhì)量與干燥前質(zhì)量比值，得到樣品的折干率。不同加工方法蟾酥干燥加工時(shí)間和折干率測(cè)定結(jié)果見表2。蟾酥鮮漿在17、60、80、105、120 ℃干燥時(shí)，隨著溫度升高，加工時(shí)間逐漸縮短。冷凍干燥為2 d，17 ℃風(fēng)干、陰干、曬干時(shí)間較長(zhǎng)，分別為15、15、6 d。不同加工方法，蟾酥折干率不同，80 ℃烘干、105 ℃烘干、120 ℃烘干、冷凍干燥折干率在29.64%～31.51%，陰干、曬干、17 ℃風(fēng)干、60 ℃折干率在32.34%～34.36%。

表2 不同蟾酥初加工方法的加工時(shí)間和折干率

3 討論

蟾酥為國(guó)務(wù)院頒布的28種毒性中藥材之一，也是國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)的二級(jí)野生動(dòng)植物藥材品種之一。蟾酥療效確切、應(yīng)用廣泛，目前市場(chǎng)供不應(yīng)求，價(jià)格不斷攀升。但蟾酥的產(chǎn)地加工都是家庭作坊式的，導(dǎo)致蟾酥摻假使雜、漿液種質(zhì)混雜、灰分超標(biāo)，很難保證中成藥需要的蟾酥原料安全、穩(wěn)定、有效、可控。

通過不同的干燥方法，除冷凍干燥外，17 ℃風(fēng)干、60 ℃烘干、80 ℃烘干、105 ℃烘干、120 ℃烘干、陰干、曬干的蟾酥外觀性狀均符合《中國(guó)藥典》要求。而冷凍干燥的蟾酥6種化學(xué)成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)沒有顯著的變化，說明冷凍干燥影響蟾酥的外觀顏色和狀態(tài)可能與蛋白質(zhì)的變性有關(guān)。沙蟾毒精為蟾酥中的活性特征成分，具有強(qiáng)心[6]、抗腫瘤作用[7]。其在60 ℃烘干、80 ℃烘干、105 ℃烘干、120 ℃烘干時(shí)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈現(xiàn)明顯下降的趨勢(shì)，表明沙蟾毒精遇到高溫高熱易受到破壞。蟾酥粉粹，過篩成細(xì)粉，17 ℃風(fēng)干、60 ℃烘干、陰干、曬干、冷凍干燥蟾酥顏色較淺，80 ℃烘干、105 ℃烘干、120 ℃烘干的蟾酥顏色逐漸加深，因此把蟾酥細(xì)粉的顏色作為衡量蟾酥質(zhì)量好壞的依據(jù)值得探討。

蟾酥不同加工方法折干率為29.64%～34.36%，說明蟾酥鮮漿含水量約70%，這對(duì)于蟾酥的加工較為不利。17 ℃風(fēng)干、陰干、曬干時(shí)間較長(zhǎng)，會(huì)導(dǎo)致微生物的繁殖，造成蟾酥菌檢不合格，影響蟾酥的臨床應(yīng)用。本研究中沙蟾毒精的含量較低，對(duì)蟾酥中蟾酥內(nèi)酯類含量貢獻(xiàn)較低。然而，有些蟾酥樣品中沙蟾毒精質(zhì)量分?jǐn)?shù)遠(yuǎn)高于其他蟾毒配基類成分[8]，因此有必要把沙蟾毒精作為蟾酥初加工方法質(zhì)量控制指標(biāo)。綜合來看，60 ℃熱風(fēng)干燥是蟾酥適宜的加工條件，該加工方法制備的蟾酥質(zhì)量較佳，蟾酥加工效率較高。本研究結(jié)果與曲婷等[2]報(bào)道和《山東省中藥飲片炮制規(guī)范》2012年版中規(guī)定60 ℃烘干基本一致[9]。