不同飼養(yǎng)方式對(duì)牦牛瘤胃微生物區(qū)系及肌肉品質(zhì)的影響

譚子璇,柏 雪,3,,羅 璠,郭 瓊,劉欣宇,冉 黎,高彥華,3

（1.青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川 成都 610041；2.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,四川 成都 610041；3.西南民族大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)國家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川 成都 610041）

牦牛是中國青藏高原地區(qū)特有的畜種,也是該地區(qū)優(yōu)勢(shì)畜種之一[1-2],對(duì)于高寒、低氧及牧草匱乏的環(huán)境具有良好的適應(yīng)性。隨著人們生活水平的提高,牛肉的消費(fèi)量不斷提高,牛肉的品質(zhì)及安全就顯得尤為重要,而以天然放牧為主的牦牛肉質(zhì)鮮美,蛋白含量高,具有獨(dú)特的風(fēng)味,以其“綠色食品”的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)引起市場的廣泛關(guān)注,具有很大的開發(fā)潛力[3-4]。

青藏高原地區(qū)的植物受寒冷天氣的影響,生長周期非常短且枯萎期很長,加之草場缺乏管理,鼠害蔓延,導(dǎo)致草場退化嚴(yán)重,牧草質(zhì)量急劇下降[5-7]。青藏高原地區(qū)牦牛飼養(yǎng)方式仍以放牧為主,因此與其他優(yōu)質(zhì)牛品種相比,牦牛的出欄率和生產(chǎn)性能較低,肉品質(zhì)較差,使得牦牛肉制品在市場的占有量不高[8]。近年來為了改變這種狀況,在牧區(qū)開始不斷推廣由傳統(tǒng)放牧向舍飼飼養(yǎng)轉(zhuǎn)變。目前針對(duì)舍飼育肥牦牛肉品質(zhì)相關(guān)研究還較少,尤其是有關(guān)肌肉微觀結(jié)構(gòu)的差異研究更為鮮見,大部分的研究集中于通過補(bǔ)飼改變牦牛肉品質(zhì)。王莉[9]、孔祥穎[10]等的研究表明,補(bǔ)飼能夠提高牦牛肉肌內(nèi)脂肪含量,同時(shí)改善牦牛肉的剪切力,使其肉質(zhì)更嫩。Mamani-Linares等[11]研究發(fā)現(xiàn),補(bǔ)飼3 個(gè)月后的美洲駝,肌內(nèi)脂肪含量顯著提高,肌纖維密度明顯增大。補(bǔ)飼或者舍飼育肥之所以能提高動(dòng)物肌內(nèi)脂肪含量,可能是由于日糧組成的改變影響了瘤胃微生物組成,提高了飼料消化率,Carberry等[12]提出,瘤胃中普雷沃氏菌可以作為進(jìn)一步研究瘤胃微生物的候選菌,并闡明了它們與飼料消化率的關(guān)系,同時(shí)也指出瘤胃微生物區(qū)系對(duì)宿主的飼糧利用率有影響,據(jù)此可以進(jìn)一步研究是否可以通過調(diào)節(jié)瘤胃微生物來提高肉牛對(duì)飼料的消化率。而肌肉脂肪酸組成與肌內(nèi)脂肪含量息息相關(guān),同時(shí)肌肉脂肪酸組成又對(duì)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生影響,例如己醛就是亞油酸氧化后的基本產(chǎn)物[13]。但目前還鮮有對(duì)不同飼養(yǎng)條件下牦牛肌肉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的研究。

因此,本實(shí)驗(yàn)對(duì)舍飼與放牧條件下牦牛的瘤胃微生物多樣性、肉品質(zhì)及肌纖維微觀特性及揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行比較研究,以探究不同飼養(yǎng)方式影響牦牛肌肉品質(zhì)、營養(yǎng)成分及揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的可能機(jī)制,以期在牦牛快速育肥的基礎(chǔ)上,改善牦牛肉品質(zhì),保留其特有風(fēng)味,為進(jìn)一步提高牦牛肉品質(zhì)的研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牦牛：2017年6～8月分別在四川省阿壩羌族藏族自治州金川縣（海拔2 156 m）牦牛養(yǎng)殖場和小金縣選擇年齡4 歲左右、體質(zhì)量257 kg左右的舍飼育肥與放牧飼養(yǎng)條件下的公牦牛各8 頭。

濃縮料購自成都新通達(dá)公司。

E.Z.N.A.DNA試劑盒 美國Omega Biotek公司；AxyPrep DNA凝膠提取試劑盒 美國Axygen Biosciences公司。

1.2 儀器與設(shè)備

2200 凱氏定氮儀 丹麥FOSS公司；BSA124SCW分析天平 德國賽多利斯公司；7890A氣相色譜儀美國安捷倫公司；Trace DSQ氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS）儀（配置Triplus自動(dòng)進(jìn)樣器） 美國Thermo公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭 美國Supelco公司；L-8900全自動(dòng)氨基酸分析儀 日本日立公司；HP-C210色差儀中國漢譜科儀有限公司；pH-Star胴體肉質(zhì)pH計(jì) 德國Matthaus公司；TA-XT Plus質(zhì)構(gòu)儀 英國Stable Micro Systems公司；定量流變儀 美國Promega公司。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

對(duì)牦牛采用放牧和舍飼育肥兩種飼養(yǎng)方式。對(duì)放牧牦牛組進(jìn)行全放牧飼養(yǎng),自由采食；對(duì)舍飼育肥牦牛組,其日糧參考NY/T 815—2004《肉牛飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》中牛體質(zhì)量為225 kg時(shí)所需的營養(yǎng)量,平均日增質(zhì)量為0.8 kg/d,精料組成為玉米24%（質(zhì)量分?jǐn)?shù),下同）、豆粕4.23%、發(fā)酵酒糟10.56%、食鹽0.48%、碳酸鈣0.32%、小蘇打0.32%、氯化膽堿0.08%、預(yù)混料0.01%（可為每千克日糧提供鐵20 mg、碘0.5 mg、鈷0.2 mg、錳40 mg、硒0.3 mg、鋅30 mg、VA 1 500 IU、VD 550 IU、VE 10 IU）；粗料組成為鮮玉米酒糟16%、燕麥干草13%和青貯玉米秸稈31%,日糧中精料與粗料質(zhì)量之比為4∶6,正飼期100 d,喂料時(shí)間分別為每天早上8∶00與下午17∶00,自由采食,自由飲水。舍飼牦牛日糧營養(yǎng)成分含量（以干質(zhì)量計(jì)）為干物質(zhì)58.5 g/100 g、粗蛋白14.67 g/100 g、酸性洗滌纖維21.6 g/100 g、中性洗滌纖維40.15 g/100 g、鈣0.53 g/100 g、磷0.45 g/100 g、增重凈能4.28 mJ/kg,除增重凈能為計(jì)算值外,其余均為實(shí)測(cè)值。

1.3.2 樣品采集與處理

飼養(yǎng)期結(jié)束后禁食禁水12 h,屠宰后每頭牛取瘤胃內(nèi)容物用4 層紗布過濾出瘤胃液,分別裝入2 支5 mL凍存管中；同時(shí)每頭牛取倒數(shù)第一與第二肋骨之間背最長肌2 份（去除筋膜、血污及表面脂肪）,每份約500 g,其中一份沿肌纖維方向進(jìn)行分割處理,平均修整為大小2 cm×5 cm×2 cm肉塊6 塊,每塊質(zhì)量約為20 g,用于肉品質(zhì)測(cè)定,同時(shí)取1 cm2肉樣2 塊,放置于體積分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛固定液中進(jìn)行固定備用,進(jìn)行肌纖維特性的測(cè)定。另一份肉樣低溫運(yùn)送回實(shí)驗(yàn)室后立即-20 ℃保藏,用于后續(xù)脂肪酸、揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)測(cè)定。

1.3.3 指標(biāo)測(cè)定

1.3.3.1 瘤胃微生物區(qū)系測(cè)定

分別采集每頭牦牛瘤胃液5 mL,置于凍存管中冷凍保存,隨后委托廣州基迪奧生物科技有限公司,利用16S rRNA技術(shù)測(cè)定瘤胃微生物區(qū)系多樣性。使用E.Z.N.A.DNA試劑盒從瘤胃液中提取微生物DNA,利用引物341F：5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3'；806R：5'-GGACTACHVGGGTATCTAAT-3',聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction,PCR）16S rRNA V3～V4區(qū)（95 ℃保持2 min,隨后98 ℃保持10 s,62 ℃保持30 s,68 ℃保持30 s,最后68 ℃保持10 min）,PCR反應(yīng)在含有5 μL 10×KOD緩沖液、5 μL 2.5 mmol/L dNTPs、1.5 μL引物、1 μL KOD聚合酶和100 ng模板DNA的3 份50 μL混合物中進(jìn)行。從質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%瓊脂糖凝膠中提取擴(kuò)增子,并用AxyPrep DNA凝膠提取試劑盒純化,根據(jù)使用說明書用定量流變儀進(jìn)行定量檢測(cè),根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案,在Illumina平臺(tái)上以等摩爾和成對(duì)末端測(cè)序（2×250）合并純化的擴(kuò)增子。

用Uparse軟件對(duì)所有樣品的全部有效序列（effective tags）進(jìn)行聚類分析,默認(rèn)提供以97%的一致性（identity）將序列聚類成為操作分類單元（operational taxonomic units,OTUs）結(jié)果；使用QIIME軟件計(jì)算Alpha多樣性指數(shù)；UPARSE軟件在構(gòu)建OTUs的過程中會(huì)選取代表性序列（OTUs中豐度最高的Tag序列）,將這些代表性序列集合用RDP Classifier的Na?ve Bayesian assignment算法,與Silva數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種注釋（設(shè)定置信度的閾值為0.8～1.0）,統(tǒng)計(jì)各個(gè)層級(jí)分類水平上的各樣品物種組成情況,然后用堆疊圖的形式,直觀展示不同樣品在各個(gè)分類層級(jí)水平上的物種豐度的變化情況,只展示至少在一個(gè)樣本中的表達(dá)豐度達(dá)到2%的前10 個(gè)物種,其余物種統(tǒng)一歸類到其他（Other）類別,無法注釋到該水平的序列則被歸類到未分類（Unclassified）的類別。

1.3.3.2 肌肉常規(guī)營養(yǎng)成分、肌內(nèi)脂肪含量測(cè)定

取肉樣約200 g,在65 ℃烘箱中烘干,回潮后粉碎,制成風(fēng)干樣,進(jìn)行常規(guī)營養(yǎng)成分的測(cè)定。水分含量的測(cè)定參考GB 5009.3—2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測(cè)定》中的直接干燥法；粗蛋白含量的測(cè)定參考GB 5009.5—2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》中的凱氏定氮法；粗灰分含量的測(cè)定參考GB 5009.4—2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中灰分的測(cè)定》中的灼燒法；肌內(nèi)脂肪含量的測(cè)定采用GB 5009.6—2003《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪的測(cè)定》中的索氏抽提法方法。所有指標(biāo)平行測(cè)定3 次。

1.3.3.3 肉色及pH值測(cè)定

采用HP-C210色差儀測(cè)定肉樣的L*值（亮度）、a*值（紅度）、b*值（黃度）。測(cè)定前對(duì)儀器進(jìn)行校正,將肉樣放置于平面,置于現(xiàn)場自然光線充足處,垂直將色差儀鏡頭置于肌肉橫斷面,鏡口緊扣肉面（不漏光）,平行測(cè)定3 次,測(cè)定位置均勻分布于肌肉橫切面,計(jì)算平均數(shù)作為色差讀數(shù)。

胴體肉質(zhì)pH計(jì)經(jīng)pH 4和pH 7的校準(zhǔn)液校準(zhǔn)后,分別在宰后45 min和24 h,插入胴體背最長肌進(jìn)行測(cè)定,每塊樣品重復(fù)測(cè)定3 次,計(jì)算平均值作為pH值讀數(shù)。

1.3.3.4 滴水損失率及蒸煮損失率的測(cè)定

滴水損失率及蒸煮損失率的測(cè)定參考?？颂m等[14]的方法并稍作修改。首先將修整好的待測(cè)肉樣稱質(zhì)量（m1/g）,再用鐵絲鉤住肉樣一端,使肌纖維垂直向下,裝入塑料袋中,用洗耳球向塑料袋吹氣,使之處于膨脹狀態(tài),并使肉樣不與塑料袋壁接觸,封口后,吊掛在4 ℃的冰箱中,24 h后再稱肉塊質(zhì)量（m2/g）,并按公式（1）計(jì)算滴水損失率。

取修整好的肉樣,稱質(zhì)量,記為'/g,用自封袋真空密封,于80 ℃水浴于中加熱30 min,當(dāng)肉的中心溫度達(dá)到75 ℃時(shí),恒溫5 min后取出,冷卻至室溫后再次稱質(zhì)量,記為/g,并按公式（2）計(jì)算蒸煮損失率。

1.3.3.5 剪切力測(cè)定

取修整好的生肉樣及熟肉樣（85 ℃恒溫水浴鍋中加熱30 min）,采用TA-XT Plus質(zhì)構(gòu)儀按照NY/T 1180—2006《肉嫩度的測(cè)定 剪切力測(cè)定法》進(jìn)行測(cè)定。沿肌纖維垂直方向測(cè)量每個(gè)肉柱的剪切力,每個(gè)樣品測(cè)定3 次。測(cè)試速率為1 mm/s。

1.3.3.6 脂肪酸含量測(cè)定

取肉樣約150 g,參照GB/T 9695.2—2008《肉與肉品質(zhì) 脂肪酸測(cè)定》的方法采用7890A氣相色譜儀測(cè)定脂肪酸含量,每個(gè)處理組做8 個(gè)平行（8 頭牛）,每個(gè)平行取兩個(gè)樣測(cè)定。脂肪酸含量結(jié)果以干質(zhì)量計(jì)。

1.3.3.7 肌纖維特性測(cè)定

肌纖維特性參考文獻(xiàn)[15]中的石蠟切片法進(jìn)行測(cè)定。將樣品從體積分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛中取出,經(jīng)全自動(dòng)脫水機(jī)脫水,包埋、切片后,經(jīng)伊紅-蘇木精染色后進(jìn)行封片,進(jìn)行鏡檢。用數(shù)碼三目攝像顯微鏡觀察切片,利用Motic Images Advanced 3.2軟件,選擇切片中較好的區(qū)域照相,調(diào)整物鏡的倍數(shù)（20×）及測(cè)量數(shù)據(jù)的單位（μm）,將采集到的圖片導(dǎo)入Motic Images Advanced軟件進(jìn)行肌纖維直徑、面積及密度測(cè)量,每個(gè)樣本采集3 張圖片。

1.3.3.8 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)測(cè)定

采用頂空固相微萃取（headspace solid-phase microextraction,HS-SPME）-GC-MS法測(cè)定,取肉樣5 g用組織勻漿機(jī)搗碎成肉糜,置于20 mL頂空瓶中,將蓋子蓋緊后,放置于4 ℃冷藏備用。萃取頭使用前在GC進(jìn)樣口220 ℃老化30 min,將完成老化的萃取頭插入頂空瓶中于60 ℃萃取10 min后,再于GC進(jìn)樣口解吸5 min。

GC條件：TR-FFAP色譜柱（30 m×0.25 mm,0.25 μm）；載氣為高純度He,流速1 mL/min；采用程序升溫：初溫40 ℃,保持5 min,以4 ℃/min升溫至120 ℃,保持10 min,再以13 ℃/min升溫至220 ℃,保持5 min；進(jìn)樣口溫度220 ℃,分流進(jìn)樣,分流比為20∶1。

MS條件：傳輸線溫度220 ℃；離子源溫度200 ℃；電離方式：電子轟擊離子,電離電壓70 eV；掃描方式為全掃描,掃描范圍m/z35～500。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)采用Excel 2010軟件進(jìn)行整理,用SPSS 18.0軟件中GLM模型進(jìn)行單因素方差分析,Duncan氏法進(jìn)行多重比較,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,P＜0.05表示差異顯著。揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)僅選擇正相似指數(shù)與反相似指數(shù)均不小于750的物質(zhì)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同飼養(yǎng)方式對(duì)牦牛瘤胃微生物區(qū)系的影響

2.1.1 不同飼養(yǎng)方式對(duì)牦牛瘤胃微生物OTUs數(shù)目和Alpha多樣性的影響

舍飼牦牛與放牧牦牛OTUs數(shù)目和Alpha多樣性指數(shù)見表1,放牧牦牛瘤胃微生物中表示微生物豐富度的OTUs數(shù)目顯著高于舍飼牦牛瘤胃微生物（P＜0.05）,分別為2 543.40和1 742.00；同時(shí)放牧牦牛組中與樣本的物種豐富度信息相關(guān)指標(biāo)ACE、Chao1指數(shù)以及體現(xiàn)物種的豐富度和均勻度的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)分別為2 925.87、3 002.86、9.56、0.99,前3 項(xiàng)均顯著高于舍飼牦牛組（P＜0.05）。舍飼牦牛與放牧牦牛樣品的覆蓋率（coverage）均為0.99,表明本實(shí)驗(yàn)低豐度OTUs覆蓋率及測(cè)序深度合理。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,放牧牦牛的瘤胃微生物多樣性高于舍飼牦牛,而曹連賓等[16]選擇了青海全放牧和舍飼牦牛各3 頭進(jìn)行研究,結(jié)果表明舍飼牦牛的瘤胃微生物多樣性高于放牧牦牛,與本研究結(jié)果相反。出現(xiàn)上述結(jié)果可能是動(dòng)物品種不同、飼糧精粗比及成分不同等原因所造成。有大量的研究結(jié)果表明,日糧的組成不同,瘤胃微生物的組成會(huì)發(fā)生改變,許多瘤胃微生物菌群能夠被擴(kuò)大,或成為優(yōu)勢(shì)菌群[12,17-18]。

表1 飼養(yǎng)方式對(duì)牦牛瘤胃微生物OTUs數(shù)量和Alpha多樣性的影響Table 1 Effect of feeding systems on number of OTUs and alpha diversity of rumen microbial floral in yaks

2.1.2 不同飼養(yǎng)方式對(duì)牦牛瘤胃微生物組成的影響

圖1 飼養(yǎng)方式對(duì)牦牛瘤胃微生物組成在門水平上的影響Fig.1 Effect of feeding systems on rumen microbial floral composition of yaks at the phylum level

由圖1可知,舍飼牦牛與放牧牦牛瘤胃微生物均由擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）和黏膠球形菌門（Lentisphaerae）4 個(gè)優(yōu)勢(shì)菌門主導(dǎo)。各優(yōu)勢(shì)菌門在兩處理組樣品豐度也有所不同,擬桿菌門作為第一優(yōu)勢(shì)菌門在舍飼牦牛樣本中的相對(duì)豐度為55.75%,明顯高于放牧牦牛組中41.20%；而作為第二優(yōu)勢(shì)菌門的厚壁菌門在舍飼牦牛樣本中為19.76%,明顯低于放牧牦牛組。上述結(jié)果與曹連賓[16]、de Oliverira[19]等的研究結(jié)果一致,健康牛瘤胃微生物菌群在門水平上大部分都屬于擬桿菌門和厚壁菌門。放牧牦牛瘤胃液中的黏膠球形菌門含量明顯高于舍飼牦牛,高出5.77%。

圖2 飼養(yǎng)方式對(duì)牦牛瘤胃微生物組成在屬水平上的影響Fig.2 Effect of feeding systems on rumen microbial floral composition at the genus level

由圖2可知,舍飼牦牛和放牧牦牛樣本中,豐度最高的前3 個(gè)屬均源于擬桿菌門,分別為普雷沃氏菌_1（Prevotella1）、擬桿菌門理研菌科RC9腸道菌體屬（RikenellaceaeRC9 gut group）、普雷沃氏菌科UCG-003（PrevotellaceaeUCG-003）,其中舍飼牦牛樣本中普雷沃氏菌_1占比達(dá)到16.49%,而在放牧牦牛樣本中僅占8.84%。Fernando等[20]對(duì)肉牛研究發(fā)現(xiàn),與飼喂干草的相比,高精料飼喂的牛瘤胃內(nèi)擬桿菌門的數(shù)量更多,并且在擬桿菌門中檢測(cè)到的大部分細(xì)菌屬都是普雷沃氏菌,該結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

產(chǎn)生上述結(jié)果的原因可能是由于舍飼牦牛日糧中添加了精料,而精料中的蛋白質(zhì)和淀粉的含量高于放牧牦牛的粗料,從而導(dǎo)致瘤胃內(nèi)的蛋白降解菌和淀粉降解菌的含量增加[21],有研究表明可分離培養(yǎng)的普雷沃氏菌中,一部分具有降解蛋白質(zhì)和淀粉等營養(yǎng)物質(zhì)的功能；另一部分具有發(fā)酵纖維二糖、果糖、葡萄糖等的能力[22-23]。因此可以進(jìn)一步研究是否可以通過調(diào)節(jié)瘤胃微生物來提高肉牛對(duì)飼料的消化率。肌肉中脂肪酸和風(fēng)味物質(zhì)變化與瘤胃微生物區(qū)系的改變密不可分,楊蕾等[24]指出瘤胃微生物菌群豐度對(duì)其儲(chǔ)存能量及沉積脂肪的能力有重要影響,尤其是厚壁菌門與擬桿菌門的相對(duì)豐度對(duì)肌內(nèi)脂肪沉積的影響較大。肌內(nèi)脂肪的沉積與肌肉中脂肪酸組成有著密切的聯(lián)系,本研究結(jié)果中舍飼牦牛瘤胃中擬桿菌門與厚壁菌門豐度均增加。

2.2 不同飼養(yǎng)方式對(duì)牦牛肉品質(zhì)的影響

不同飼養(yǎng)條件下牦牛肌肉品質(zhì)分析結(jié)果見表2,本實(shí)驗(yàn)條件下,舍飼牦牛與放牧牦牛肌肉肉色、pH值及水分、粗蛋白、粗灰分含量無顯著差異（P＞0.05）,舍飼與放牧牦牛肌肉中粗蛋白含量均高于牛肉的平均蛋白質(zhì)含量（20 g/100 g）,該結(jié)果與王莉等[9]的研究結(jié)果一致,說明牦牛肉蛋白含量高。有研究表明,放牧飼養(yǎng)的動(dòng)物肌肉比谷物飼養(yǎng)的動(dòng)物肌肉具有更深的顏色[25-26],但是本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中,兩種飼養(yǎng)方式對(duì)牦牛肌肉的肉色及pH值并無顯著影響,可能是飼養(yǎng)時(shí)間不夠的原因造成。

滴水損失率是反映肌肉持水力的重要指標(biāo)之一,蒸煮損失率是衡量肌肉在加工過程中失去水分的量的重要指標(biāo),關(guān)系到產(chǎn)品的加工成本[27-28],水分流失率低能使肌肉保持較好的嫩度和營養(yǎng)。舍飼牦牛肉的滴水損失率與蒸煮損失率分別為1.35%和21.28%,均顯著低于放牧牦牛肉（P＜0.05）,說明舍飼牦牛肉在宰后及加工過程中,能表現(xiàn)出比放牧牦牛肉更高的系水力,其嫩度可能也會(huì)因此得到改善。

肌內(nèi)脂肪通常稱為大理石花紋脂肪,有研究表明消費(fèi)者在購買牛肉時(shí),更青睞肌內(nèi)脂肪含量高的牛肉。肌內(nèi)脂肪含量與熟肉的嫩度和多汁性有關(guān),肌內(nèi)脂肪含量的增加對(duì)肌肉的多汁性有明顯的改善作用,使得肌肉在烹飪過程中保留更多的水分[29]。肌內(nèi)脂肪對(duì)于嫩度的改善可能是因?yàn)榧?nèi)脂肪位于肌纖維束之間的肌束膜結(jié)締組織中,能夠使肌纖維的密度變小,在咀嚼時(shí)更容易破碎[30]。舍飼牦牛的肌內(nèi)脂肪含量（1.14 g/100 g）顯著高于放牧牦牛（0.73 g/100 g）（P＜0.05）；舍飼牦牛肉與放牧牦牛肉生肉剪切力差異不顯著（P＞0.05）,但煮熟后,舍飼牦牛熟肉剪切力為69.74 N,顯著低于放牧牦牛熟肉（P＜0.05）,可能正是由于舍飼牦牛肌內(nèi)脂肪含量更高,使牦牛肌肉在烹煮過程中保留了更多的水分。因此,舍飼牦牛肉品質(zhì)在嫩度與多汁性方面的表現(xiàn)優(yōu)于放牧牦牛。

表2 不同飼養(yǎng)方式對(duì)牦牛肉品質(zhì)的影響Table 2 Effects of different feeding systems on meat quality of yaks

2.3 不同飼養(yǎng)方式對(duì)牦牛肌肉脂肪酸組成的影響

有研究報(bào)道,牛肉中較高的飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸含量與其較高的肌內(nèi)脂肪含量相關(guān)[25],且豬、牛、羊的肌肉和肌肉組織中的脂肪酸組成取決于該動(dòng)物胴體和肌肉中的脂肪含量[29],由表3可知,舍飼牦牛肌肉中飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸相對(duì)含量顯著高于放牧牦牛（P＜0.05）,可能是由于舍飼牦牛肌內(nèi)脂肪相對(duì)含量更高,導(dǎo)致脂肪細(xì)胞中甘油三酯的沉積更多[31]。Enser等[32]的研究結(jié)果也表明,脂肪組織中的脂肪酸含量遠(yuǎn)高于肌肉中的含量,但是其組成大致相似。飽和脂肪酸中,舍飼牦牛肌肉中棕櫚酸及硬脂酸相對(duì)含量分別為25.11%、18.98%,均顯著高于放牧牦牛肌肉（P＜0.05）,而更高的飽和脂肪酸相對(duì)含量并不能夠說明舍飼牦牛肉的脂肪酸組成不及放牧牦牛的好,不同的飽和脂肪酸具有不同的功能,例如硬脂酸在降低部分膽固醇溶解速率的同時(shí),還可以對(duì)膽酸進(jìn)行調(diào)節(jié),從而達(dá)到降低血清和肝臟中膽固醇含量的目的[33]；膳食中棕櫚酸可以降低血清中膽固醇的含量[34]。雖然舍飼牦牛肌肉中飽和脂肪酸相對(duì)含量顯著高于放牧牦牛,但從飽和脂肪酸種類來看,舍飼牦牛肌肉的中功能性脂肪酸相對(duì)含量更高。

不飽和脂肪酸中,舍飼牦牛肌肉中油酸相對(duì)含量為40.21%,顯著高于放牧牦牛（P＜0.05）,放牧牦牛肌肉中亞油酸、亞麻酸、二十碳五烯酸相對(duì)含量分別為9.61%、2.79%、1.80%,均顯著高于舍飼牦牛肌肉（P＜0.05）；其他脂肪酸相對(duì)含量差異均不顯著（P＞0.05）。放牧牦牛肌肉中多不飽和脂肪酸相對(duì)含量顯著高于舍飼牦牛（P＜0.05）,也高于馬聘等[35]的研究結(jié)果中2～3 歲的牦牛肌肉中多不飽和脂肪酸的相對(duì)含量（7.15%）,Raes等[25]的研究發(fā)現(xiàn)不同種類、不同飼養(yǎng)方式的牛肉之間多不飽和脂肪酸含量差異均不顯著。與上述文獻(xiàn)結(jié)果不一致的原因：一方面是因?yàn)榉拍陵笈ｉL期以植物為食,可能是由于其中往往含有較高的植物源性抗氧化劑等活性成分,能夠有效保護(hù)多不飽和脂肪酸[36]；另一方面可能是動(dòng)物的品種、年齡、日糧組成等不同造成的。

舍飼牦牛肉和放牧牦牛肉中多不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸含量的比值（P∶S）均未達(dá)到世界衛(wèi)生組織推薦的0.4,并且放牧牦牛肌肉P∶S為0.33,顯著高于舍飼牦牛肌肉（0.15）（P＜0.05）,這主要是由于反芻動(dòng)物的瘤胃具有氫化作用,所以P∶S通常在0.1左右[37-39]。舍飼牦牛肌肉與放牧牦牛肌肉中n-6/n-3脂肪酸的比值分別為4.55和1.86,舍飼牦牛肌肉顯著高于放牧牦牛肉（P＜0.05）,可能是由于舍飼飼糧中谷物相對(duì)含量更高,而谷物飼料具有更多的n-6脂肪酸,放牧牦牛的飼糧僅為草料,含有更多的C18:3n-3[25]。

Moloney等[40]發(fā)現(xiàn)富含不飽和脂肪酸的飲食會(huì)影響與肉類色澤穩(wěn)定性密切相關(guān)的牛肉中的脂肪酸組成,如青貯飼料。由此,可推測(cè)舍飼牦牛日糧組成的改變使得肌內(nèi)脂肪相對(duì)含量增加,改變了其脂肪酸相對(duì)含量。已有研究表明,瘤胃微生物具有氫化作用,通過對(duì)日糧的調(diào)控可以改變肌肉中脂肪酸的組成[37]。因此在進(jìn)一步研究中,可以考慮通過在飼糧中加入微生態(tài)制劑調(diào)節(jié)瘤胃微生物的多樣性,從而改變牦牛對(duì)飼料的消化吸收,在提高肌內(nèi)脂肪相對(duì)含量的同時(shí),使脂肪酸維持穩(wěn)定。

表3 不同飼養(yǎng)方式對(duì)牦牛肌肉脂肪酸組成的影響Table 3 Effects of different feeding systems on fatty acid composition of muscle lipids in yaks

2.4 不同飼養(yǎng)方式對(duì)牦牛肌纖維特性的影響

表4 不同飼養(yǎng)方式對(duì)牦牛肌纖維特性的影響Table 4 Effects of different feeding systems on yak muscle fiber characteristics

動(dòng)物出生后,肌纖維的數(shù)量不再變化,但隨著時(shí)間的推移,肌纖維類型可能會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)化。由表4可知,舍飼牦牛肉與放牧牦牛肉的肌纖維面積、肌纖維直徑差異均不顯著（P＞0.05）,但舍飼牦牛肉的肌纖維密度（6.67 N/mm2）顯著低于放牧牦牛肉（10.64 N/mm2）（P＜0.05）,可能是由于舍飼牦牛肌內(nèi)脂肪含量更高,使得肌纖維之間結(jié)締組織的聯(lián)結(jié)作用降低。有研究表明,肌纖維橫截面積與嫩度呈負(fù)相關(guān)（-0.11＜r＜-0.53）[41-42]。Ishii等[43]對(duì)體質(zhì)量200～600 kg肉牛（日本黑?！梁伤固古＃┘∪獾募±w維橫截面積進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)它們的肌纖維橫截面積均未超過1 200 μm2,低于本實(shí)驗(yàn)兩種牛肉結(jié)果,可見牦牛肉的嫩度不及肉牛高；因此在進(jìn)一步的研究中,可以通過不斷改善飼養(yǎng)管理方式來改善牦牛肉的嫩度。

2.5 不同飼養(yǎng)方式對(duì)牦牛肌肉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響

兩種飼養(yǎng)方式對(duì)牦牛肌肉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響結(jié)果見表5,舍飼與放牧飼養(yǎng)條件下的牦牛肉中分別檢測(cè)出27 種和34 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì),其中包括醛類11 種、酮類5 種、醇類9 種、酯類2 種、烷烴類3 種、烯烴類2 種及雜環(huán)化合物7 種。

表5 不同飼養(yǎng)方式對(duì)牦牛肌肉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響Table 5 Effects of different feeding systems on volatile flavor compounds in yak meat

舍飼與放牧牦牛肌肉中各共有的醛類化合物相對(duì)含量差異均不顯著（P＞0.05）,醛類化合物總相對(duì)含量較高,是牦牛肉中主要的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì),這與原琦等[44]的研究結(jié)果相同,說明醛類化合物是牛肉風(fēng)味物質(zhì)的主要構(gòu)成部分,對(duì)牛肉香味的貢獻(xiàn)不可替代。舍飼牦牛與放牧牦牛中的醛類化合物均以己醛相對(duì)含量最高,分別為14.96%和15.30%,己醛具有青草味,是亞油酸氧化后的基本產(chǎn)物[13],放牧牦牛肌肉中己醛相對(duì)含量稍高于舍飼牦牛,可能與其肌肉中亞油酸相對(duì)含量顯著高于舍飼牦牛有關(guān)；庚醛和辛醛具有油脂氧化的氣味[45],在舍飼牦牛肌肉中庚醛和辛醛相對(duì)含量分別為2.51%和1.81%,稍高于放牧牦牛,這可能是由于舍飼牦牛肌內(nèi)脂肪含量高于放牧牦牛,牛肉風(fēng)味與這些高相對(duì)含量低分子質(zhì)量的醛類物質(zhì)有很大關(guān)系[46]。

酮類化合物是脂質(zhì)氧化后產(chǎn)生的另一種產(chǎn)物,具有特殊香氣,肉中酮類化合物的存在可使腥味增強(qiáng)或改變[47]。放牧牦牛肌肉中酮類化合物含量高于舍飼牦牛,可能是由于放牧牦牛肌肉中多不飽和脂肪酸含量更高。放牧牦牛肌肉中3-羥基-2-丁酮相對(duì)含量為21.69%,顯著高于舍飼牦牛肉的5.96%,這可能導(dǎo)致放牧牦牛肉中的腥味高于舍飼牦牛。舍飼牦牛肌肉種2-庚酮相對(duì)含量為1.11%,顯著高于放牧牦牛中的相對(duì)含量（P＜0.05）；6-甲基-5-庚烯-2-酮只在放牧牦牛肌肉中檢出,相對(duì)含量為0.83%,上述兩種酮類化合物對(duì)肌肉風(fēng)味影響極小。

醇類化合物的來源也是脂肪的氧化降解,舍飼牦牛肌肉中醇類化合物含量高于放牧牦牛,舍飼牦牛肌肉中1-戊醇、1-辛烯-3-醇、(E)-2-辛烯-1-醇的相對(duì)含量均顯著高于放牧牦牛肌肉（P＜0.05）,尤其是1-辛烯-3-醇的相對(duì)含量達(dá)到17.87%,在放牧牦牛肌肉中僅為6.54%,徐永霞等[47]的研究表明,1-辛烯-3-醇是重要的香味活性物質(zhì)。Lorenz等[48]研究了飼養(yǎng)方式對(duì)牛肉的脂肪酸組成及熟制后牛肉的風(fēng)味成分影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)舍飼組中的1-辛烯-3-醇含量高于放牧組,與本研究結(jié)果一致。1-戊烯-3-醇與1-庚醇均只在舍飼牦牛肌肉中檢出,相對(duì)含量分別為0.70%和2.16%；3-甲基-1-丁醇僅在放牧牦牛肌肉中檢出,相對(duì)含量為1.50%,這兩種物質(zhì)均因?yàn)橄鄬?duì)含量極低,對(duì)牦牛肌肉風(fēng)味總體影響極小。

Mottram等[49]的研究表明,脂質(zhì)是肉品風(fēng)味物質(zhì)的重要前體物,尤其是磷脂,其富含不飽和脂肪酸,例如花生四烯酸、亞油酸等的產(chǎn)物可能直接影響揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的組成,從而改變?nèi)馄凤L(fēng)味。酯類化合物的形成通常是通過一個(gè)復(fù)雜的反應(yīng)鏈,有可能是通過微生物作用后,醇類與羧酸類的酯化反應(yīng)而形成[50],舍飼和放牧牦牛肌肉中N-己酸乙烯酯檢出的相對(duì)含量分別為9.65%和4.73%,二者差異顯著（P＜0.05）。

在舍飼牦牛肌肉中并未檢測(cè)到烯烴類化合物,在放牧牦牛肌肉中檢測(cè)出2-丙烯基環(huán)丁烯和苯乙烯2 種烯烴類化合物。含氮含硫及雜環(huán)化合物中,舍飼牦牛肌肉中2-戊基呋喃的相對(duì)含量為2.34%,顯著高于放牧牦牛肌肉中的相對(duì)含量,但放牧牦牛肌肉中雜環(huán)化合物種類多于舍飼牦牛。某些烷烴類化合物有可能是某些雜化化合物形成過程中的中間體,對(duì)形成肉香也有一定作用[45]；因此,可能正是由于放牧牦牛肌肉中烷烴類化合物種類較多,所以產(chǎn)生的雜環(huán)化合物種類也較多。僅在舍飼牦牛肌肉中檢出4-羥基丁酸,其相對(duì)含量僅為0.72%,因此對(duì)牦牛肉香氣貢獻(xiàn)并不大。

3 結(jié) 論

在牦牛瘤胃微生物方面,放牧牦牛瘤胃微生物多樣性顯著高于舍飼牦牛,與放牧牦牛相比,舍飼牦牛瘤胃中的擬桿菌門相對(duì)豐度明顯提高,而厚壁菌門相對(duì)豐度明顯降低。在牦牛肉品質(zhì)方面,與放牧牦牛肉相比,舍飼牦牛肌肉中肌內(nèi)脂肪含量顯著提高,滴水損失率、蒸煮損失率、熟肉剪切力、肌纖維密度均顯著降低,飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸相對(duì)含量顯著提高,多不飽和脂肪酸相對(duì)顯著降低；而放牧飼牦牛肌肉中檢測(cè)出更多種類的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。

綜上所述,舍飼育肥對(duì)牦牛肉品質(zhì)具有改善作用,但日糧組成改變對(duì)其瘤胃微生物區(qū)系、肌肉脂肪酸組成及肌肉中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類產(chǎn)生影響；因此在進(jìn)一步研究中,可以通過調(diào)整牦牛日糧組成,改善瘤胃微生物區(qū)系組成,進(jìn)而達(dá)到既提高牦牛肉品質(zhì),又保證牦牛肉營養(yǎng)成分和風(fēng)味物質(zhì)組成的目的。