2-羥丙基-β-環(huán)糊精/葡萄籽提取物包合物對(duì)羊肚腐敗菌的抑制作用及保鮮效果

鐘媛媛,李文慧,盧士玲,王慶玲,冉麗丹,董 娟

（石河子大學(xué)食品學(xué)院,新疆 石河子 832000）

羊肚即羊胃,是羊的副產(chǎn)品之一,含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分。據(jù)《本草綱目》記載,羊肚性味甘平、口感柔脆、易于消化,具有健脾補(bǔ)虛等功效,是一種健康食品。但在貯藏過(guò)程中,易受到內(nèi)源性微生物和外界環(huán)境的影響,從而發(fā)生腐敗變質(zhì)。有研究表明,不適當(dāng)?shù)耐涝?、分割和貯藏會(huì)導(dǎo)致肉中微生物繁殖和交叉污染,包括沙門氏菌和引起食源性疾病的李斯特氏菌,造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1]。因此,尋找控制肉與肉制品在加工貯藏中微生物污染的有效方法是非常必要的。

近年來(lái),天然抗氧化劑植物多酚抑菌機(jī)理的探究成為了熱點(diǎn)。Bukvi?ki等[2]將精油加入豬肉后針對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)精油處理成功地抑制了豬肉中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的增殖,使豬肉的顏色和風(fēng)味得到明顯改善。董璐[3]、錢麗紅[4]、王慧敏[5]等研究發(fā)現(xiàn),茶多酚能增加大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌、腐敗希瓦氏菌的細(xì)胞膜通透性,影響膜流動(dòng)性,阻礙細(xì)菌蛋白質(zhì)的正常表達(dá),產(chǎn)生良好的抑菌活性。因此,植物多酚取代合成抗氧化劑和抑菌劑已是大勢(shì)所趨[6]。釀酒后的副產(chǎn)物葡萄籽提取物（grape seed extract,GSE）是豐富且廉價(jià)的多酚來(lái)源,主要單體是黃烷-3-醇和低聚葡萄籽原花色素（grape seed proanthocyanidins,GSP）,其中GSP可有效清除超氧化物和羥基自由基[7]。GSE的抗氧化活性受聚合度的影響,聚合程度越高,抗氧化活性越高[8]。實(shí)驗(yàn)證明GSE的抗氧化活性是VE的20 倍,是VC的50 倍；同時(shí),對(duì)人類健康具有有益的作用。另外,GSE也被證明具有很強(qiáng)的抗菌活性,特別是對(duì)人類致病微生物如金黃色葡萄球菌、凝固葡萄球菌、弗氏檸檬酸桿菌、大腸桿菌和植物致病真菌[9]。

GSE廣泛應(yīng)用于肉制品貯藏加工中,但其自身特性在食品工業(yè)中的應(yīng)用已受到限制,因?yàn)镚SE在水中的溶解度、生物利用度有限,見(jiàn)光易分解、吸潮,具有不穩(wěn)定性。環(huán)糊精是由α-1,4-葡萄糖苷鍵連接的無(wú)毒環(huán)狀低聚糖,因?yàn)榫哂兄锌請(qǐng)A錐形的特殊結(jié)構(gòu),使得形狀和大小合適的疏水性客體分子或官能團(tuán)能嵌入其空穴中,形成包合物[10]。而水溶性環(huán)糊精衍生物,如2-羥丙基-β-環(huán)糊精（(2-hydroxypropyl)-β-cyclodextrin,HP-β-CD）,因具有親水外表面和親脂內(nèi)腔的結(jié)構(gòu),且客體分子被封裝到腔中可以不改變宿主的化學(xué)結(jié)構(gòu)而被廣泛應(yīng)用在食品或醫(yī)藥領(lǐng)域[11-12]。已發(fā)現(xiàn)客體分子的許多化學(xué)和物理性質(zhì)在包合物形成過(guò)程中被優(yōu)化,例如客體分子的抗氧化、抗光誘導(dǎo)變化和熱穩(wěn)定性增強(qiáng),客體分子的溶解度增加、揮發(fā)性降低,有利于保持食品品質(zhì)[13]。Abarca等[14]研究發(fā)現(xiàn),通過(guò)共沉積法制備了精油與β-環(huán)糊精的包合物,可有效降低其揮發(fā)性,在微生物分析中,可以觀察到包合物對(duì)暴露于體外的絲狀真菌Botrytis cinerea的徑向生長(zhǎng)有抑制的作用,證明了包合物對(duì)Botrytis cinerea的抑菌行為。巫春寧等[15]采用單因素正交試驗(yàn)制備了GSE與環(huán)糊精的包合物,發(fā)現(xiàn)GSE通過(guò)包合,其穩(wěn)定性明顯提高,同時(shí)在水中的溶解度增加了3 倍。Lucas-Abellán等[16]研究指出白藜蘆醇中酚羥基與CD羥基形成氫鍵后其自由基清除能力提高。然而,有關(guān)GSE與HP-β-CD的包合物在肉制品中防腐抑菌方面的應(yīng)用鮮有報(bào)道。因此,本實(shí)驗(yàn)針對(duì)HP-β-CD/GSE包合物對(duì)羊肚腐敗菌的抑制作用及保鮮效果進(jìn)行了研究,以期為肉類食品防腐保鮮提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮綿羊（8 月齡）羊肚由新疆西部牧業(yè)股份有限公司提供,購(gòu)買后將其裝入含有冰袋的保溫箱中快速運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室,去除羊肚表面的污物及油脂后清洗干凈。

葡萄籽提取物（純度95%） 上海麥克林生化科技有限公司；HP-β-CD、蛋白酶K 北京索萊寶科技有限公司；酵母浸粉、瓊脂粉 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；蛋白胨 天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠；DNA提取試劑盒 天根生化科技北京有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Beta 2-8 LD plus冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Christ公司；Seamus Nicolet IS10傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy,FTIR）儀 美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司；DSC200F3差示掃描量熱（differential scanning calorimetry,DSC）儀 德國(guó)耐馳儀器公司；JSM-6490LV掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope,SEM） 日本電子公司；TC-512聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction,PCR）儀英國(guó)Techne公司；pHS-3C標(biāo)準(zhǔn)型pH計(jì) 上海精密儀器有限公司；Mini-protein Ⅲ凝膠成像儀 美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 包合物的制備

采用共沉積法制備包合物[17-18],并以不同物質(zhì)的量之比（1∶0.5、1∶1、1∶2）進(jìn)行HP-β-CD/GSE包合物的制備。將0.16 g GSE完全溶解在用鋁箔紙包裹的錐形瓶中,加入40 mL、體積分?jǐn)?shù)30%乙醇溶液,再加入不同量的HP-β-CD以得到不同物的質(zhì)量之比的二者混合溶液。將溶液置于搖床中恒溫（40 ℃）攪拌72 h后,于4 ℃的冰箱中過(guò)夜。通過(guò)抽濾獲得沉淀物并用體積分?jǐn)?shù)30%乙醇洗滌后于-80 ℃下預(yù)冷24 h后,通過(guò)冷凍干燥機(jī)冷凍干燥而獲得固體HP-β-CD/GSE包合物。物理混合物是將HP-β-CD與GSE以物質(zhì)的量之比1∶1在研缽中完全混合研磨制備。

1.3.2 HP-β-CD/GSE包合物的表征

1.3.2.1 FTIR光譜的測(cè)定

采用溴化鉀壓片法測(cè)定HP-β-CD/GSE包合物以及物理混合物的紅外光譜吸收曲線。使用FTIR儀以2 cm-1的分辨率在4 000～500 cm-1的范圍內(nèi)掃描樣品。

1.3.2.2 熱特性的測(cè)定

將5 mg HP-β-CD/GSE包合物以及物理混合物均勻分散在坩堝中,使用DSC儀測(cè)量樣品的熱特性。樣品在30～400 ℃的范圍內(nèi)掃描,升溫速率為10 ℃/min,干燥氮?dú)饬魉贋?5 mL/min。

1.3.2.3 微觀結(jié)構(gòu)的測(cè)定

將適量HP-β-CD/GSE包合物以及物理混合物依照SEM儀操作要求制片,并進(jìn)行噴金處理后,置于顯微鏡下觀察（加速電壓10 kV）。

1.3.3 羊肚中菌落總數(shù)及腐敗菌的分離、鑒定

1.3.3.1 菌落總數(shù)的測(cè)定

菌落總數(shù)的測(cè)定參照GB 4789.2—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》[19]。將羊肚放置在4 ℃貯藏7 d（羊肚有明顯的腐敗變質(zhì)現(xiàn)象）,在此期間每天進(jìn)行菌落總數(shù)的測(cè)定。在無(wú)菌操作臺(tái)上取5 g羊肚放入無(wú)菌操作袋中,加入45 mL、質(zhì)量分?jǐn)?shù)85%的生理鹽水,在勻漿器上拍打2 min,制成1∶10的樣品勻液。再用無(wú)菌鹽水進(jìn)行10 倍梯度稀釋,取200 μL稀釋4、5、6 倍的3 個(gè)梯度稀釋樣液加入PCA培養(yǎng)基中,進(jìn)行涂布后,放置在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,平板中菌落總數(shù)在30～300之間作為有效平板。

1.3.3.2 腐敗菌的分離純化

在1.3.3.1節(jié)測(cè)定菌落總數(shù)后的平板中挑選菌落形態(tài)好的菌落在LB固體平板上進(jìn)行反復(fù)劃線分離,挑取純化后的單菌落進(jìn)一步在LB液體培養(yǎng)基中富集,取適量菌液接入體積分?jǐn)?shù)30%的甘油管中,并在-80 ℃中保藏。

1.3.3.3 DNA提取與測(cè)序

使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行提取。將提取到的DNA進(jìn)行16S rDNA PCR擴(kuò)增,體系為：2×Planta Max MasterMix 12.5 μL、ddH2O 9.5 μL、上游引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）1 μL,下游引物1492R（5'-GGTTACCTTACGACTTGGT-3'）1 μL,DNA模板1 μL,反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s,54 ℃退火30 s,72 ℃延伸1.5 min,30 個(gè)循環(huán)重復(fù)；72 ℃徹底延伸5 min。

瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物的純度,反應(yīng)條件為：20 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.8%的瓊脂糖凝膠、2 μL核酸染料、樣品量（1 μL PCR產(chǎn)物+5 μL loading buffer）、電泳緩沖液1×TAE、電壓110 V、電流200 mA。電泳條帶在凝膠成像儀下進(jìn)行觀察,并將凝膠條帶送至上海生工生物工程公司測(cè)序。

1.3.3.4 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

在NCBI網(wǎng)站輸入堿基序列,搜索BLAST進(jìn)行分析比對(duì)。將同源性在98%以上的目的序列復(fù)制到文本上,用MEGA 7.0軟件構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。

1.3.4 HP-β-CD/GSE包合物對(duì)腐敗菌的抑菌實(shí)驗(yàn)

參照文獻(xiàn)[20]的方法,采用濾紙片法做抑菌圈直徑實(shí)驗(yàn)。將分離純化得到的腐敗菌挑取單菌落到營(yíng)養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中,37 ℃恒溫培養(yǎng)活化18 h后,將得到的菌液稀釋至108CFU/mL。取100 μL稀釋后菌液均勻涂布在營(yíng)養(yǎng)肉湯固體培養(yǎng)基上,放入滅菌的濾紙片,加入5 μL 5 g/L HP-β-CD/GSE包合物（1∶2,物質(zhì)的量之比,后同）溶液在濾紙片上,于37 ℃培養(yǎng)24 h后,測(cè)定抑菌圈直徑。

1.3.5 HP-β-CD/GSE包合物對(duì)羊肚保鮮效果的測(cè)定

1.3.5.1 原料處理

將羊肚切分成長(zhǎng)7～10 cm左右,隨機(jī)分成4 組,每組3 個(gè)平行。其中第一組不做任何處理（空白組）,第2～4組分別在5 g/L的HP-β-CD/GSE包合物（1∶0.5、1∶1、1∶2）溶液中浸泡20 min后取出晾干,裝入自封袋,4 ℃下貯藏9 d,期間每天對(duì)樣品進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定。

1.3.5.2 pH值測(cè)定

在無(wú)菌操作臺(tái)上取5 g羊肚,并用滅菌后的剪刀剪碎于燒杯中,加入50 mL滅菌后的蒸餾水浸泡30 min,用pH計(jì)測(cè)定浸泡羊肚后的蒸餾水pH值,待pH計(jì)穩(wěn)定后進(jìn)行計(jì)數(shù),每個(gè)樣品重復(fù)3 次。

1.3.5.3 總揮發(fā)性鹽基氮含量測(cè)定

總揮發(fā)性鹽基氮（total volatile basic nitrogen,TVB-N）含量根據(jù)GB 5009.228—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定》[21]進(jìn)行測(cè)定。

1.3.5.4 感官評(píng)價(jià)

由20 位具有感官評(píng)定知識(shí)且自身健康的食品專業(yè)的老師與同學(xué)組成感官評(píng)定小組,要求小組全體成員在同一時(shí)間分別對(duì)樣品進(jìn)行感官評(píng)價(jià),且保證相互之間無(wú)任何交流。感官評(píng)分取值在0～9 分,最終取各感官項(xiàng)目的平均值,具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

表1 羊肚的感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Criteria for sensory evaluation of lamb tripe

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)測(cè)定3 次,結(jié)果采用SPSS Statistics 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,使用Origin Pro 8.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 HP-β-CD/GSE包合物結(jié)構(gòu)與特性的表征

2.1.1 FTIR分析結(jié)果

圖1 不同主客體比包合物的FTIR圖Fig.1 FTIR spectra of inclusion complexes with different host/guest ratios

FTIR能夠?yàn)榉治龉腆w中環(huán)糊精和客體分子間的相互作用提供有效信息[22]。共沉積法制備的不同物質(zhì)的量之比的HP-β-CD/GSE包合物、HP-β-CD/GSE物理混合物、HP-β-CD及GSE的FTIR圖如圖1所示。GSE在3 431 cm-1處顯示出特征吸收峰,這可能是由于酚羥基中的O—H鍵的伸縮振動(dòng),特征骨架振動(dòng)主要集中在1 000～1 650 cm-1和700～850 cm-1區(qū)域。HP-β-CD在3 416.08 cm-1處有明顯的—OH伸縮振動(dòng)吸收帶,在2 928.33 cm-1處存在—CH伸縮振動(dòng)峰,在1 159 cm-1處和1 032 cm-1處為C—O—C的對(duì)稱和不對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰[23]。在形成HP-β-CD/GSE包合物后,GSE特征峰逐漸減少（主要呈現(xiàn)HP-β-CD的峰）,移位或丟失。GSE中對(duì)應(yīng)的苯骨架在3 431 cm-1處的吸收峰輕微移動(dòng)至3 410 cm-1,1 000～500 cm-1處的C—O拉伸振動(dòng)被HP-β-CD的特征性吸收峰被遮蔽,這可能是HP-β-CD/GSE包合物的形成所致[24],表明GSE可能已完全嵌入HP-β-CD的空腔中。物理混合物是HP-β-CD和GSE單一組分之間的FTIR光譜的簡(jiǎn)單疊加。FTIR的結(jié)果證實(shí)了HP-β-CD/GSE包合物的形成,結(jié)果與Pu Hongyu等[25]用HP-β-CD包合特丁基對(duì)苯二酚的研究結(jié)果一致。

2.1.2 熱特性分析結(jié)果

圖2 不同主客體比包合物的DSC圖Fig.2 DSC patterns of inclusion complexes with different host/guest ratios

由圖2可知,GSE在238.21 ℃處出現(xiàn)了急劇的吸熱熔融峰。對(duì)于HP-β-CD,在82.56 ℃處顯示出較寬的吸熱熔融峰,這與HP-β-CD水分損失有關(guān)；在349.38 ℃處觀察到第二吸熱熔融峰,這可能是熱分解所致。物理混合物的DSC曲線是HP-β-CD和GSE曲線的簡(jiǎn)單疊加,該結(jié)果表明這兩種物質(zhì)僅物理混合但彼此不相互作用。

在具有不同物質(zhì)的量之比的HP-β-CD/GSE包合物中,除了在283 ℃處GSE熔融峰的消失外,HP-β-CD/GSE（1∶0.5）包合物的DSC曲線中其特征吸收峰僅在71.15 ℃處很明顯。在HP-β-CD/GSE（1∶1）包合物的DSC曲線中,在74.99 ℃和341.70 ℃處有兩個(gè)吸熱熔融峰。在HP-β-CD/GSE（1∶2）包合物的DSC曲線中,在73.65 ℃和323.35 ℃處存在兩個(gè)吸熱熔融峰,這可能是由于在包合物形成過(guò)程中HP-β-CD和GSE之間形成新的分子間或分子內(nèi)鍵,使GSE的熔點(diǎn)消失,并且在GSE和HP-β-CD之間形成包合物HP-β-CD后,熱性質(zhì)發(fā)生改變,導(dǎo)致熔融峰的移動(dòng)[26]。DSC分析可用于確定固體包合物的形成,且包合物中客體分子的熱峰消失進(jìn)一步表明包合物的成功制備[27]。

2.1.3 微觀結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果

SEM可用于觀察物質(zhì)和電子之間相互作用后的表面形態(tài),是一種檢測(cè)包合物形成的輔助方法[28]。如圖3所示,GSE呈現(xiàn)針狀菱形晶體形態(tài),而HP-β-CD呈球形。在HP-β-CD和GSE的物理混合物中兩種形態(tài)都能被觀察到,為不規(guī)則的嵌段結(jié)構(gòu)和片段化的球形結(jié)構(gòu),其中宿主（HP-β-CD）和客體（GSE）的形式未改變。包合物的形狀與物理混合物的形狀完全不同,其呈現(xiàn)出具有球形腔或腔體碎片結(jié)構(gòu)表面的多層塊結(jié)構(gòu)。不同物質(zhì)的量之比的HP-β-CD/GSE包合物的表面形態(tài)不同；HP-β-CD/GSE（1∶0.5）的包合物呈圓球形嵌段結(jié)構(gòu),而1∶1和1∶2比例的包合物呈現(xiàn)不規(guī)則的層狀結(jié)構(gòu)。研究表明,當(dāng)客體分子包含在β-CD中時(shí),包合物的表面由于客體分子結(jié)晶度的降低而發(fā)生很大變化[29]。在HP-β-CD/GSE包合物中,兩種組分的原始形態(tài)完全喪失,并被不規(guī)則尺寸的小聚集體取代。因此,FTIR、DSC和SEM的結(jié)果表明HP-β-CD/GSE包合物制備成功。

圖3 不同主客體比包合物的SEM圖Fig.3 SEM of inclusion complexes with different host/guest ratios

2.2 羊肚中的菌落總數(shù)及腐敗菌的分離、鑒定結(jié)果

2.2.1 貯藏過(guò)程中羊肚的菌落總數(shù)變化

圖4 4 ℃貯藏過(guò)程中羊肚的菌落總數(shù)Fig.4 Total number of colonies in lamb tripe stored at 4 ℃

如圖4所示,新鮮羊肚的菌落總數(shù)為3.91（lg（CFU/g））,在貯藏的前4 d,菌落總數(shù)呈現(xiàn)快速上升的趨勢(shì),可能是由于在此期間羊肚中的微生物處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,微生物利用羊肚中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)后進(jìn)行大量繁殖。隨后,微生物的繁殖與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)達(dá)到平衡狀態(tài),在貯藏第5天菌落總數(shù)為7.52（lg（CFU/g））。一般來(lái)說(shuō),生鮮肉定菌落總數(shù)高于6（lg（CFU/g））時(shí)表示肉品質(zhì)已經(jīng)腐敗變質(zhì)[30],而羊肚在貯藏第2天時(shí)的菌落總數(shù)已高于6（lg（CFU/g））,說(shuō)明已腐敗變質(zhì)。

2.2.2 腐敗菌的鑒定及進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建結(jié)果

圖5 分離腐敗菌株的16S rDNA PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.5 Electrophoresis pattern of 16S rDNA polymerase chain reaction amplification products of isolated spoilage strains

對(duì)羊肚中微生物進(jìn)行分離純化后,共篩選出7 株腐敗菌,對(duì)7 株腐敗菌進(jìn)行DNA提取和PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增后的條帶如圖5所示,特異性擴(kuò)增條帶均出現(xiàn)在1 250 bp左右,且條帶清晰、無(wú)雜帶。

對(duì)條帶進(jìn)行測(cè)序后,在BLAST上比較測(cè)序結(jié)果,選擇了98%以上的相似菌株,并使用MEGA 7.0構(gòu)建了腐敗菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖6）,得到分離純化出的7 株腐敗菌菌株分別為表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）、吉氏庫(kù)特菌（Kurthia gibsonii）、腸溶沙門氏菌亞種（Salmonella entericasubsp.）、大腸桿菌（Escherichia coli）、棕色類香味菌（Myroiddes phaeus）。

圖6 基于16S rRNA序列的同源性菌株系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.6 Phylogenetic tree of homologous strain based on 16S rRNA sequence

2.3 HP-β-CD/GSE包合物（1∶2）對(duì)腐敗菌的抑制作用

實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)物質(zhì)的量比為1∶2時(shí)包合物的抗氧化效果最好,且物質(zhì)的量比為1∶0.5和1∶1對(duì)腐敗菌的抑制效果沒(méi)有1∶2時(shí)好（未列出相應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果）,所以只對(duì)1∶2的最優(yōu)效果進(jìn)行討論。從表2可以看出,HP-β-CD/GSE包合物（1∶2）對(duì)分離的7 種菌均具有一定的抑菌效果,其中對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌抑菌活性效果最強(qiáng),其次是表皮葡萄球菌。圖7為抑菌實(shí)驗(yàn)中包合物對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌結(jié)果。

表2 包合物（1∶2）對(duì)7 株腐敗菌的抑制作用結(jié)果Table 2 Inhibitory effect of inclusion complex (1:2) on seven strains of spoilage bacteria

圖7 包合物（1∶2）對(duì)金黃色葡萄球菌（A）及大腸桿菌（B）的抑菌效果Fig.7 Antibacterial effect of inclusion complex (1:2) against Staphylococcus aureus (A) and Escherichia coli (B)

2.4 HP-β-CD/GSE包合物對(duì)羊肚的保鮮效果

2.4.1 pH值的變化

圖8 貯藏期間羊肚的pH值變化Fig.8 Changes in pH of lamb tripe during storage

pH值影響肉的品質(zhì)（如持水性、風(fēng)味）和貨架期,可以作為評(píng)價(jià)肉的新鮮度的指標(biāo)之一[31]。如圖8所示,空白組中的羊肚在第0天時(shí)pH值為6.62,而處理組的pH值在第0天時(shí)為6.53,處理組的pH值低于空白組可能是因?yàn)榕cHP-β-CD/GSE包合物溶液本身的pH值有關(guān)。在貯藏期間羊肚的pH值均呈現(xiàn)緩慢上升趨勢(shì),可能是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)在組織蛋白酶類和腐敗微生物作用下逐漸分解產(chǎn)生氨基酸,隨后繼續(xù)分解為氨和三甲胺等堿性物質(zhì)[32]。不同物質(zhì)的量之比的HP-β-CD/GSE包合物（1∶0.5、1∶1、1∶2）處理的羊肚在貯藏期間的pH值始終低于空白組,說(shuō)明在使用HP-β-CD/GSE包合物溶液浸泡后,GSE進(jìn)入羊肚的組織中,抑制了羊肚中的蛋白降解,減緩了羊肚腐敗變質(zhì)的過(guò)程。相比較下,1∶2 HP-β-CD/GSE包合物處理組的羊肚pH值在貯藏的前6 d保持在較小的范圍波動(dòng),這對(duì)羊肚品質(zhì)保持十分有利。

2.4.2 TVB-N含量的變化

圖9 貯藏期間羊肚TVB-N含量的變化Fig.9 Changes in TVB-N content of lamb tripe during storage

TVB-N指在酶和微生物的作用下,肉制品中的蛋白質(zhì)腐敗分解產(chǎn)生氨及胺類等具有揮發(fā)性堿性含氮類物質(zhì)[33]。TVB-N含量越高,表明肉制品中蛋白質(zhì)破壞分解得越多,因此TVB-N含量在很大程度上能反映肉制品的新鮮度[34]。如圖9所示,在第0天時(shí),新鮮的羊肚中TVB-N含量為8 mg/100 g左右。在后期貯藏過(guò)程中,各處理組的TVB-N含量均呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)?？瞻捉M中TVB-N含量上升趨勢(shì)較快,貯藏期在第2天時(shí)已超過(guò)GB 9961—2008《鮮、凍胴體羊肉》中對(duì)鮮肉TVB-N的限量15 mg/100 g。而不同物質(zhì)的量之比的HP-β-CD/GSE包合物（1∶0.5、1∶1、1∶2）處理的羊肚在貯藏期間的TVB-N含量始終低于空白組,說(shuō)明HP-β-CD/GSE包合物能有效抑制由微生物引起的TVB-N含量增加。其中,物質(zhì)的量比為1∶2的HP-β-CD/GSE包合物TVB-N含量增長(zhǎng)較緩慢,在貯藏的前6 d均低于15 mg/100 g,保鮮效果較好,這一結(jié)果與pH值的變化趨勢(shì)相似。

2.4.3 感官品質(zhì)的變化

圖10 貯藏期間羊肚的感官評(píng)分Fig.10 Sensory evaluation of sheep tripe during storage

感官評(píng)分是品評(píng)人員對(duì)羊肚在貯藏過(guò)程中直觀判定的結(jié)果,根據(jù)羊肚的顏色、質(zhì)地、氣味進(jìn)行打分,該得分可以用于輔助理化指標(biāo)判定羊肚在冷藏過(guò)程中的品質(zhì)變化。在貯藏開(kāi)始時(shí),羊肚的顏色色澤均勻,富有光澤,有彈性,質(zhì)地堅(jiān)實(shí),具有羊肚固有濃郁氣味,無(wú)異味。貯藏2 d后,空白組的感官評(píng)分明顯低于用HP-β-CD/GSE包合物處理組。貯藏時(shí)間超過(guò)4 d后,空白組色澤極度不均勻,羊肚表面水分過(guò)多,無(wú)彈性,質(zhì)地非常柔軟,固有氣味消失,有明顯異味,感官評(píng)分小于6 分,并呈現(xiàn)急速下降趨勢(shì)；包合物處理組（除1∶0.5）在6 d內(nèi)感官評(píng)分大于6,保持在可接受范圍。結(jié)果表明,HP-β-CD/GSE包合物處理組可有效延長(zhǎng)羊肚的貨架期3～4 d,與理化指標(biāo)研究結(jié)果一致。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)以HP-β-CD為主體成功制備了不同物質(zhì)的量之比（1∶0.5、1∶1、1∶2）的HP-β-CD/GSE包合物,利用FTIR、DSC和SEM表征手段證明了包合物的形成。另外,對(duì)羊肚腐敗菌進(jìn)行分離后,鑒定出了表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）、吉氏庫(kù)特菌（Kurthia gibsonii）、腸溶沙門氏菌亞種（Salmonella entericasubsp.）、大腸桿菌（Escherichia coli）、棕色類香味菌（Myroiddes phaeus）7 株主要腐敗菌,且HP-β-CD/GSE包合物（1∶2）對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌具有明顯的抑制作用。將HP-β-CD/GSE包合物應(yīng)用于羊肚的保鮮（4 ℃）中,發(fā)現(xiàn)其對(duì)羊肚的品質(zhì)起到一定的保持作用,且物質(zhì)的量之比為1∶2的HP-β-CD/GSE包合物對(duì)羊肚的抑菌保鮮效果較好。