柑橘大實蠅NPC2基因的序列分析和組織表達(dá)模式

陳劍　王兆祥　楊嶺　葉海霞　毛麗　桂連友　張國輝

摘要 柑橘大實蠅是柑橘上的重要害蟲，主要為害柑橘果實。NPC2是一種小分子蛋白，參與了脊椎動物的脂質(zhì)代謝，最近有研究表明，NPC2有著類似于昆蟲氣味結(jié)合蛋白的功能，參與了昆蟲的化學(xué)通訊。為了明確NPC2基因在柑橘大實蠅成蟲組織中的分布，本研究從柑橘大實蠅轉(zhuǎn)錄組中，鑒定了NPC2基因，命名為BminNPC2。通過生物信息學(xué)方法分析了該基因序列特征并構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹，采用實時熒光定量PCR技術(shù)研究了BminNPC2基因在柑橘大實蠅成蟲組織中的表達(dá)模式。結(jié)果表明：BminNPC2基因開放閱讀框為456 bp，編碼151個氨基酸，等電點為6.10，分子量大小為16.66 kD，含有6個半胱氨酸。BminNPC2基因在柑橘大實蠅頭部（去掉觸角）和腹部表達(dá)量最高。據(jù)此結(jié)果我們在文中對BminNPC2基因功能進(jìn)行了簡要討論。

關(guān)鍵詞 柑橘大實蠅; NPC2基因; 序列分析; 組織表達(dá)模式

中圖分類號： Q 966， S 436.66

文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019235

Sequence analysis and tissue expression pattern of Niemann-Pick type C2 gene in Bactrocera minax

CHEN Jian， WANG Zhaoxiang， YANG Ling， YE Haixia， MAO Li， GUI Lianyou， ZHANG Guohui*

（Institute of Entomology， College of Agriculture， Yangtze University， Jingzhou 434025， China）

Abstract

Bactrocera minax， a major citrus pest， mainly damages citrus fruits. NPC2 is a type of small protein involved in lipid metabolism in vertebrates. Recent studies showed that NPC2s had the similar function to odorant binding proteins and participated in chemical communication of insects. In order to clarify the distribution of NPC2 gene in adult citrus flies， the NPC2 gene was obtained from B.minax through transcriptome analysis， which was named BminNPC2. The sequence characteristics of the NPC2 gene were analyzed using bioinformatics tools and a phylogenetic tree was generated to characterize the NPC2 gene. The tissue expression pattern of NPC2 gene was determined by the real-time PCR. The results showed that the open reading frame （ORF） of BminNPC2 was 456 bp in length， encoding 151 amino acid residues， with a deduced molecular weight （MW） of 16.66 kD and an isoelectric point （pI） of 6.10. It had six cysteines. The expression level of BminNPC2 gene in the head without antennae and abdomen was high. Based on these results， we briefly discussed the functions of BminNPC2 gene.

Key words

Bactrocera minax; Niemann-Pick type C2 gene; sequence analysis; tissue expression pattern

柑橘大實蠅Bactrocera minax俗稱“柑蛆”，屬雙翅目，實蠅科，大實蠅亞屬[1]，是柑橘生產(chǎn)上的主要害蟲[2]。該蟲廣泛分布于中國、尼泊爾、印度和不丹的柑橘產(chǎn)區(qū)[1，3-4]，嚴(yán)重影響了柑橘果實的產(chǎn)量與品質(zhì)[5]。在柑橘大實蠅大暴發(fā)的年份給果農(nóng)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前在柑橘大實蠅防治的實踐中，化學(xué)殺蟲劑起著主導(dǎo)作用。然而，殺蟲劑的頻繁使用導(dǎo)致了柑橘大實蠅抗藥性的出現(xiàn)，并對人類和其他生物產(chǎn)生了不可預(yù)見的副作用[6-7]。利用嗅覺誘捕成蟲，是高效控制柑橘大實蠅種群的綠色環(huán)保手段[8-9]。在近些年的研究中，發(fā)現(xiàn)某些昆蟲NPC2蛋白參與了嗅覺通訊[10-11]。NPC2蛋白（niemann-pick type C2 proteins）又稱為HE1，屬于ML（MD-2-related lipid-recognition）家族，是人類附睪的一種主要分泌蛋白，可與膽固醇結(jié)合，在隨后的研究中，發(fā)現(xiàn)NPC2也存在于牛奶、膽汁、精液中[12-14]。

在脊椎動物的不同物種中，NPC2序列一致性達(dá)到55%以上，具有高度保守性，這說明在脊椎動物中，NPC2可能有著相同的生理功能：主要用于結(jié)合膽固醇和脂質(zhì)。在節(jié)肢動物的不同物種中，NPC2行使著不同的功能，如日本弓背蟻CjapNPC2結(jié)合部分疏水化合物：長鏈脂肪酸、芳樟醇等[11];家蠶NPC2參與了抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)甘油三酯在BmN4細(xì)胞中的積累過程[15]。目前有關(guān)果蠅NPC2的研究有兩個方面：Huang等在果蠅中鑒定了8個NPC2基因（NPC2a-h），同時對其進(jìn)行了功能研究，發(fā)現(xiàn)NPC2a與NPC2b在調(diào)節(jié)甾醇穩(wěn)態(tài)和蛻皮激素生物合成方面存在冗余作用[16]。隨后，Shi等研究表明NPC2e和NPC2a可能在免疫缺陷（Imd）通路中發(fā)揮作用[17]。前人的研究證明NPC2在動物中起著重要的生理作用，但是目前對柑橘大實蠅NPC2功能還一無所知，因此本文開展了柑橘大實蠅NPC2基因研究。

本研究首次從柑橘大實蠅轉(zhuǎn)錄組中鑒定了NPC2基因，并對其進(jìn)行了序列分析。同時采用熒光定量PCR技術(shù)研究了NPC2基因的組織表達(dá)模式，豐富了NPC2基因家族成員，也為后續(xù)的分子克隆和體外表達(dá)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試?yán)ハx：本研究所用的柑橘大實蠅成蟲為長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院昆蟲化學(xué)生態(tài)實驗室人工飼養(yǎng)種群[18]。收集1～3日齡雌雄成蟲的觸角、頭（去掉觸角）、胸、腹、足、翅等組織，每個組織樣本收集自30頭成蟲（不同日齡成蟲各10頭），3次生物學(xué)重復(fù)。最后，收集好的樣品保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

試劑：MiniBEST Universal RNA Extractin Kit、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、SYBR Premix Ex Taq II （Tli RNaseH Plus），均購自寶生物工程（大連）有限公司。定量和內(nèi)參引物由武漢華大基因公司合成。

儀器：Bio-Rad CFX connect Real-Time System，美國Applied Biosystems公司。

1.2 方法

1.2.1 NPC2基因的鑒定與系統(tǒng)發(fā)育分析

利用關(guān)鍵字（NPC2）搜索轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，利用BLAST對NPC2基因進(jìn)行鑒定?；贐LASTX對基因數(shù)據(jù)庫的搜索，確定了NPC2候選基因。使用DNAstar軟件（5.01版）進(jìn)行開放閱讀框（ORF）預(yù)測。信號肽采用SignalP5.0服務(wù)器進(jìn)行預(yù)測（http：∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）。氨基酸序列的多重比對由Clustal X軟件（版本1.83）完成。利用MEGA 7.0軟件中鄰接法（NJ樹）建立系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap為1 000，分析不同目昆蟲之間的進(jìn)化關(guān)系。

1.2.2 利用實時定量PCR技術(shù)對NPC2基因進(jìn)行組織表達(dá)分析

各組織的總RNA用MiniBEST Universal RNA Extraction Kit提取;使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser合成第一鏈cDNA;每個組織的RNA/cDNA提取/合成重復(fù)3次。表1為實時定量PCR中使用的基因特異性引物，以GAPDH作為內(nèi)參。采用BioRad CFX connect Real-Time System和試劑SYBR Premix Ex Taq II （Tli RNaseH Plus）檢測NPC2的組織表達(dá)水平。實時PCR采用25 μL的反應(yīng)體系，包含12.5 μL SYBR Premix Ex Taq II （Tli RnaseH Plus）， 上下游引物各1 μL（10 μmol/L）， 2 μL cDNA樣品， 8.5 μL ddH2O。PCR條件為95℃，30 s;95℃ 5 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，40個循環(huán)。用熔解曲線分析擴增產(chǎn)物，所有試驗樣品均進(jìn)行了3次技術(shù)重復(fù)。采用2-△△CT法進(jìn)行相對定量分析[19]。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

采用單因素方差分析（ANOVA）和Tukeys HSD檢驗分析不同組織間的差異，顯著性水平為0.05。所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析（SPSS Inc，Chicago，IL，USA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 柑橘大實蠅NPC2基因的序列分析

通過對柑橘大實蠅頭部轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到了1個NPC2基因，命名為BminNPC2。BminNPC2開放閱讀框為456 bp，編碼151個氨基酸，N端有一個21個氨基酸殘基組成的信號肽，成熟肽由130個氨基酸殘基組成，含有6個半胱氨酸（圖1，圖2）。BminNPC2等電點為6.10，分子量大小為16.66 kD。

2.2 BminNPC2系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用BLAST對BminNPC2的同源蛋白進(jìn)行搜索，搜索結(jié)果進(jìn)行氨基酸序列的多重比對（圖2），同時構(gòu)建了NPC2s系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖3），結(jié)果表明，柑橘大實蠅NPC2蛋白氨基酸與黑腹果蠅Drosophila melanogaster NPC-2a蛋白氨基酸序列一致性最高（71.97%），與其他的NPC2蛋白氨基酸序列一致性為（22%～57%）。

2.3 BminNPC2 組織表達(dá)模式

使用2-△△Ct相對定量法，以柑橘大實蠅雄蟲足中NPC2基因的表達(dá)量為基準(zhǔn)，采用實時熒光定量PCR法測定了NPC2基因的組織表達(dá)譜（圖4）。結(jié)果顯示，BminNPC2在所有組織中都有表達(dá)，在頭部（去掉觸角）和腹部表達(dá)量最高，在翅中表達(dá)量次之，在觸角、胸、足3個部位表達(dá)量最低，且BminNPC2在雌雄成蟲組織中的表達(dá)量基本一致，無差異性。

3 討論

柑橘大實蠅BminNPC2基因序列分析顯示，BminNPC2具有NPC2基因家族的典型特征：開放閱讀框為456 bp，編碼151個氨基酸，其N端具有21個氨基酸殘基組成的信號肽，成熟肽由130個氨基酸殘基組成，含有6個半胱氨酸（圖1）[11，20]。說明柑橘大實蠅BminNPC2屬于NPC2基因家族。

在節(jié)肢動物中，NPC2基因在同一物種和不同物種中高度分化，根據(jù)構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析可知，柑橘大實蠅NPC2氨基酸與黑腹果蠅D.melanogaster NPC-2a氨基酸序列一致性最高（71.97%），與其他的NPC2氨基酸序列一致性為22%～57%，這可能是為了適應(yīng)外在的環(huán)境壓力而產(chǎn)生的復(fù)制或分化的結(jié)果[21]。節(jié)肢動物NPC2基因的組織表達(dá)模式的不同可能與其對應(yīng)的生理功能有關(guān)，例如，日本弓背蟻CjapNPC2在觸角中相對高表達(dá)[11]，中紅側(cè)溝繭蜂的MmedNPC-2a同樣在觸角中相對高表達(dá)[10]，這兩者都能結(jié)合揮發(fā)性的氣味分子。對黑腹果蠅的NPC2研究中，發(fā)現(xiàn)DmeNPC-2e和DmeNPC-2a可能在免疫缺陷（Imd）通路中發(fā)揮作用[17]，以及DmeNPC-2a和DmeNPC-2b參與了調(diào)節(jié)甾醇類物質(zhì)穩(wěn)態(tài)和蛻皮激素生物合成[16]。柑橘大實蠅BminNPC2基因在所有的組織中都有表達(dá)，這與中紅側(cè)溝繭蜂的MmedNPC-2a表達(dá)模式一致，但是BminNPC2基因并沒在觸角中高表達(dá)，而BminNPC2和DmelNPC-2a序列一致性較高，我們推測BminNPC2可能不參與嗅覺通訊功能，而是具有和DmelNPC-2a相似的功能。

NPC2在脊椎動物體內(nèi)的生理功能已較為熟悉（如膽固醇脂質(zhì)結(jié)合和轉(zhuǎn)運）[22-23]，但是NPC2在非脊椎動物中的生理功能我們所知甚少，因此NPC2在無脊椎動物中的生理功能值得我們?nèi)ド钊胙芯?。近年來，隨著我們對NPC2基因的研究，越來越多的NPC2基因在無脊椎動物中相繼被發(fā)現(xiàn)，在螯肢動物中，美洲鈍眼蜱Amblyomma americanum、蓖子硬蜱Ixodes ricinus、蜈蚣Strigamia maritima等都發(fā)現(xiàn)了NPC2基因[24-26];在昆蟲綱中，棉鈴蟲Helicoverpa armigera、佛羅里達(dá)弓背蟻Camponotus floridanus等昆蟲中都含有NPC2基因[27-28]。在本研究中，我們首次在柑橘大實蠅的頭部轉(zhuǎn)錄組中鑒定了一個NPC2基因，并對其作了序列和組織表達(dá)分析，這為昆蟲NPC2家族增加了新的成員，將有助于進(jìn)一步研究BminNPC2在相關(guān)類群中的功能和進(jìn)化關(guān)系。

參考文獻(xiàn)

[1] 汪興鑒， 羅祿怡. 桔大實蠅的研究進(jìn)展[J]. 應(yīng)用昆蟲學(xué)報， 1995， 32（5）： 310-315.

[2] 陳世驤， 謝蘊貞. 關(guān)于桔大實蠅的學(xué)名及其種征[J]. 昆蟲學(xué)報， 1955， 5（1）： 123-126.

[3] DORJI C， CLARKE A R， DREW R A I， et al. Seasonal phenology of Bactrocera minax （Diptera： Tephritidae） in western Bhutan [J]. Bulletin of Entomological Research， 2006， 96（5）： 531-538.

[4] DREW R A I， DORJI C， ROMIG M C， et al. Attractiveness of various combinations of colors and shapes to females and males of Bactrocera minax （Diptera： Tephritidae） in a commercial mandarin grove in Bhutan [J]. Journal of Economic Entomology， 2006， 99（5）： 1651-1656.

[5] 王小蕾， 張潤杰. 桔大實蠅生物學(xué)、生態(tài)學(xué)及其防治研究概述[J]. 環(huán)境昆蟲學(xué)報， 2009， 31（1）： 73-79.

[6] MARGARITOPOULOS J T， SKAVDIS G， KALOGIANNIS N， et al. Efficacy of the pyrethroid alpha-cypermethrin against Bactrocera oleae populations from Greece， and improved diagnostic for an iAChE mutation [J]. Pest Management Science， 2010， 64（9）： 900-908.

[7] DESNEUX N， DECOURTYE A， DELPUECH J M. The sublethal effects of pesticides on beneficial arthropods [J]. Annual Review of Entomology， 2007， 52（1）： 81-106.

[8] DONG Yongcheng， WAN Lun， PEREIRA R， et al. Feeding and mating behaviour of Chinese citrus fly Bactrocera minax （Diptera， Tephritidae） in the field [J]. Journal of Pest Science， 2014， 87（4）： 647-657.

[9] LIU Lu， ZHOU Qiong. Olfactory response of female Bactrocera minax to chemical components of the preference host citrus volatile oils [J]. Journal of Asia-Pacific Entomology， 2016， 19（3）： 637-642.

[10]ZHENG Yao， WANG Shanning， PENG Yong， et al. Functional characterization of a Niemann-pick type C2 protein in the parasitoid wasp Microplitis mediator [J]. Insect Science， 2018， 25（5）： 765-777.

[11]ISHIDA Y， TSUCHIYA W， FUJII T， et al. Niemann-pick type C2 protein mediating chemical communication in the worker ant [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences， 2014， 111（10）： 3847-3852.

[12]KIRCHHOFF C， OSTERHOFF C， YOUNG L. Molecular cloning and characterization of HE1， a major secretory protein of the human epididymis [J]. Biology of Reproduction， 1996， 54（4）： 847-856.

[13]NAURECKIENE S. Identification of HE1 as the second gene of Niemann-pick C disease [J]. Science， 2000， 290（5500）： 2298-2301.

[14]KLEIN A， AMIGO LRETAMAL M J， MORALES M G， et al. NPC2 is expressed in human and murine liver and secreted into bile： potential implications for body cholesterol homeostasis [J]. Hepatology， 2010， 43（1）： 126-133.

[15]ADACHI T， ISHII K， MATSUMOTO Y， et al. Niemann-pick disease type C2 protein induces triglyceride accumulation in silkworm and mammalian cell lines [J]. Biochemical Journal， 2014， 459（1）： 137-147.

[16]HUANG Xun， WARREN J T， BUCHANAN J， et al. Drosophila Niemann-pick type C-2 genes control sterol homeostasis and steroid biosynthesis： a model of human neurodegenerative disease [J]. Development， 2007， 134（20）： 3733-3742.

[17]SHI Xiuzhen， ZHONG Xue， YU Xiaoqiang. Drosophila melanogaster NPC2 proteins bind bacterial cell wall components and may function in immune signal pathways [J]. Insect Biochemistry and Molecular Biology， 2012， 42（8）： 545-556.

[18]杜田華， 華登科， 何章章， 等. 柑橘大實蠅成蟲對板栗揮發(fā)物的行為反應(yīng)[J]. 環(huán)境昆蟲學(xué)報， 2018， 40（2）： 247-257.

[19]LIVAK K J， SCHMITTGEN T D. Analysis of relative gene expression data using realtime quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method [J]. Methods， 2001， 25（4）： 402-408.

[20]INOHARA N， NUEZ G. ML—a conserved domain involved in innate immunity and lipid metabolism [J]. Trends in Biochemical Sciences， 2002， 27（5）： 219-221.

[21]ZHU Jiao， WANG Guirong， PELOSI P. Plant transcriptomes reveal hidden guests [J]. Biochemical and Biophysical Research Communications， 2016， 474（3）： 497-502.

[22]STORCH J， XU Zhi. Niemann-pick C2 （NPC2）and intracellular cholesterol trafficking [J]. Biochimica et Biophysica Acta， 2009， 1791（7）： 671-678.

[23]PELOSI P， IOVINELLA I， FELICIOLI A， et al. Soluble proteins of chemical communication： an overview across arthropods [J/OL]. Frontiers in Physiology， 2014， 5： 320. DOI： 10.3389/fphys.2014.00320.

[24]RENTHAL R， MAGHNANI L， BERNAL S， et al. The chemosensory appendage proteome of Amblyomma americanum （Acari： Ixodidae） reveals putative odorant-binding and other chemoreception-related proteins [J]. Insect Science， 2017， 5（24）： 730-742.

[25]IOVINELLA I， BAN Liping， SONG Limei， et al. Proteomic analysis of castor bean tick Ixodes ricinus： a focus on chemosensory organs [J]. Insect Biochemistry and Molecular Biology， 2016， 78： 58-68.

[26]CHIPMAN A D， FERRIER D E K， BRENA C， et al. The first myriapod genome sequence reveals conservative arthropod gene content and genome organisation in the centipede Strigamia maritime [J/OL]. PLoS Biology， 2014， 12（11）： e1002005. DOI： 10.1371/journal.pbio.1002005.

[27]ZHU Jiao， GUO Mengbuo， BAN Liping， et al. Niemann-pick C2 proteins： A new function for an old family [J/OL]. Frontiers in Physiology， 2018， 9： 52. DOI： 10.3389/fphys.2018.00052.

[28]BONASIO R， ZHANG Guojie， YE Chaoyang， et al. Genomic comparison of the ants Camponotus floridanus and Harpegnathos saltator [J]. Science， 2010， 329（5995）： 1068-1071.

（責(zé)任編輯：田 喆）