徐 強(qiáng)，高藝書，侯志濤，李東東，韓玉生

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱 150040)

益肝膠囊是在臨床治療肝損傷經(jīng)驗方的基礎(chǔ)上，經(jīng)過現(xiàn)代工藝制備而成，在改善肝功能和臨床癥狀方面療效確切。前期實驗研究結(jié)果表明，益肝膠囊具有抗脂質(zhì)過氧化、抗炎和抑制HMGB1蛋白表達(dá)的藥理作用[1-2]。本文研究了益肝膠囊對ConA所致小鼠肝損傷JAK2/STAT3 信號通路的影響，并進(jìn)一步探討其對肝保護(hù)作用的藥理機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級昆明種雄性小鼠50只，體質(zhì)量(20±2) g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供(實驗動物生產(chǎn)許可合格證號SCXK黑2013-004)。小鼠經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d后開始正式實驗，在實驗期內(nèi)小鼠均自由飲水及喂食。

1.2 藥品與試劑

益肝膠囊由丹參、五味子和苦參按照3∶3∶1比例組成，經(jīng)過水煎醇提等工藝，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗中心制備成膠囊劑型，0.4 g/粒，成人口服每次3粒，每日3次；ConA由美國sigma公司生產(chǎn)；ALT、AST測定試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司)；小鼠IL-6、TNF-а和IFN-γ酶聯(lián)免疫試劑盒(武漢博士德生物工程公司)；兔抗SOCS-3、p-JAK2 和p-STAT3多克隆抗體(美國CST公司)；BlueRanger 預(yù)染蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(美國 MBI公司)；PVDF 膜(美國Millipore 公司)；ECL Western blot 檢測試劑盒、SDS-PAGE 膠電泳試劑(美國 Amresco 公司)；其余試劑為國產(chǎn)分析純試劑。

1.3 實驗儀器

2135型全自動石蠟組織切片機(jī)(德國菜卡)；A-6半自動生化分析儀(北京松下技術(shù)有限公司)；Moticam3000顯微攝影成像系統(tǒng)(美國Motic)； ThermoForma725(美國Forma公司)；DNM-9602型酶標(biāo)儀(北京普朗新技術(shù)有限公司)；凝膠成像系統(tǒng)(以色列MiniLumi公司)；DYY-6C 型電泳儀(北京六一儀器廠)；高速離心機(jī)(科大創(chuàng)新)。

注：A.正常組；B.模型組；C.低劑量組；D.中劑量組；E.高劑量組圖1 各組小鼠肝組織病理變化及HE染色結(jié)果(×400)

1.4 動物分組與給藥

50只雄性小鼠隨機(jī)分成5組，每組10只，即正常組、模型組、益肝膠囊高劑量組、中劑量組和低劑量組。實驗開始后，益肝膠囊高、中和低劑量組分別按1.872 g/kg、0.936 g/kg和0.468 g/kg濃度每日灌胃給予益肝膠囊1次，連續(xù)給藥14 d。正常組和模型組小鼠同時灌胃給予等體積生理鹽水。

1.5 模型制備[3]

在末次給藥結(jié)束1 h后，除正常組外余下各組小鼠采用一次性尾靜脈注射ConA(20 mg/kg/只)，制備小鼠急性肝損傷模型。ConA在臨用前用無菌PBS溶液稀釋成2 mg/ml，正常組小鼠尾靜脈注射等體積PBS溶液。各組小鼠在注射ConA后禁食不禁水8 h，然后取材檢測相關(guān)指標(biāo)。

1.6 肝功能和細(xì)胞因子檢測

制備肝損傷模型后8 h麻醉小鼠取外周血，靜置1 h后3000 r/min離心15 min分離血清，采用半自動生化儀檢測各組小鼠血清中ALT、AST水平。采用ELISA法檢測血清中TNF-а、IL-6和I FN-γ水平，操作嚴(yán)格按試劑盒說明書要求進(jìn)行。

1.7 病理染色

制備肝損傷模型后8 h，麻醉小鼠并取相同部位肝組織，放入10%中性福爾馬林固定液固定24 h，再經(jīng)過脫水、透明、浸臘、包埋和切片，HE染色后顯微鏡下觀察肝組織病理變化。

1.8 Western blot檢測

制備肝損傷模型后8 h，麻醉小鼠并取相同部位肝組織，生理鹽水漂洗后迅速放入液氮中，然后再放入-80 ℃冰箱中長期保存?zhèn)溆?。采用Western-blot法檢測肝組織中SOCS-3、p-JAK2 和p-STAT3 蛋白表達(dá)。DEPC處理并經(jīng)高壓滅菌后的瓷研缽中加入少許液氮，放入0.5 g肝組織充分研磨成極細(xì)粉末，然后加入蛋白抽提試劑提取蛋白。采用BCA法進(jìn)行蛋白定量，調(diào)整蛋白濃度，每孔的加樣量為20ug，一抗?jié)舛染鶠?∶4000，二抗?jié)舛?∶10000。掃描底片后采用 Quantity one 軟件進(jìn)行光密度分析, 以目的蛋白條帶與內(nèi)參蛋白條帶的光密度白比值來表示目的蛋白的相對含量。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠肝臟病理病理學(xué)變化

圖1示，正常組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞板以中央靜脈為中心呈放射狀排列，細(xì)胞染色均勻，無炎細(xì)胞浸潤和充血等改變。模型組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)紊亂，匯管區(qū)或肝血竇間可見大量炎細(xì)胞浸潤，局部可見肝細(xì)胞腫脹、脂肪樣變或散在點狀壞死。益肝膠囊各劑量組小鼠的肝組織結(jié)構(gòu)較清晰，炎細(xì)胞數(shù)目明顯減少，肝細(xì)胞腫脹或脂肪樣變明顯減輕。

2.2 各組小鼠血清ALT、AST和炎性細(xì)胞因子水平變化

表1示，與正常組比較，模型組ALT、AST、IL-6、TNF-а和IFN-γ水平均明顯增高(P<0.01)；與模型組比較，益肝膠囊給藥組ALT、AST、IL-6、和IFN-γ水平均有不同程度降低，高劑量組TNF-а水平均有不同程度降低(P<0.01)，中、低劑量組TNF-а水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 各組小鼠血清ALT、AST與炎性細(xì)胞因子水平比較

2.3 各組小鼠肝組織SOCS-3、p-JAK2 和p-STAT3 蛋白表達(dá)

表2圖2示，與正常組比較，模型組p-JAK2 和p-STAT3 蛋白表達(dá)明顯增高，SOCS-3蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，益肝膠囊給藥組p-JAK2 和p-STAT3 蛋白表達(dá)明顯降低，SOCS-3蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.01)。

表2 各組小鼠肝組織SOCS-3、p-JAK2與p-STAT3 蛋白表達(dá)比較

注：1.正常組；2.模型組；3.低劑量組；4.中劑量組；5.高劑量組圖2 各組小鼠肝組織SOCS-3、p-JAK2和p-STAT3蛋白表達(dá)

4 討論

肝損傷是臨床上肝炎、肝纖維化和肝癌等多種肝病發(fā)生發(fā)展的共同病理基礎(chǔ)，是由于機(jī)體內(nèi)外多種生物或化學(xué)因素作用下，引起的肝細(xì)胞病理性損傷。目前，損傷后的肝細(xì)胞修復(fù)及機(jī)制是肝病研究的重點和熱點。近年來的研究表明, STAT3信號通路的激活在肝損傷修復(fù)過程中發(fā)揮著重要作用，能夠促進(jìn)肝細(xì)胞增殖，調(diào)節(jié)糖類及脂質(zhì)代謝和激活肝保護(hù)性急性期蛋白表達(dá)[4]。

在JAK/STAT信號通路中，JAK2/STAT3信號通路能通過介導(dǎo)多種炎癥因子的信號傳導(dǎo)，廣泛參與肝損傷后的細(xì)胞增殖、分化、凋亡等病理過程[5]。在炎癥因子的刺激下，JAK2受體發(fā)生磷酸化，使JAK2活化并進(jìn)一步激活STAT3，再通過調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的方式，介導(dǎo)IFN-γ、TNF-α、IL-1β和IL-6 等炎癥因子的表達(dá)；同時，過表達(dá)的炎癥因子又能夠促使JAK2/STAT3的磷酸化進(jìn)程加快，從而引起炎癥級聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生與擴(kuò)大[6]。研究表明，JAK/STAT信號通路的傳導(dǎo)過程受到SOCS蛋白家族的抑制，其中SOCS-3蛋白對JAK/STAT信號通路的抑制作用最強(qiáng)[7]，能夠通過抑制JAK2 /STAT3的信號通路來實現(xiàn)抗炎作用[8-9]。

目前，研究人體自身免疫性肝損傷模型中，Con-A所誘導(dǎo)的急性肝損傷模型是比較典型且穩(wěn)定的動物模型[10]。Con-A 作為一種植物凝集素，能夠促進(jìn)肝組織中T細(xì)胞快速增殖、活化，分泌TNF-α、IFN-γ、IL-6等多種免疫細(xì)胞因子，同時使血清轉(zhuǎn)氨酶水平快速增高，引起肝細(xì)胞大量壞死或凋亡，導(dǎo)致免疫性肝損傷[11-12]。

益肝膠囊對病毒性肝炎、酒精肝、脂肪肝等急慢性肝病有很好的治療效果，由丹參、五味子和苦參3味中藥組成。藥理學(xué)研究表明，丹參多酚酸鹽能夠減少炎癥細(xì)胞因子TNF-α和IL-6的釋放，從而對Con A所誘導(dǎo)的小鼠免疫性肝損傷起到保護(hù)作用[13]。丹參多糖可以顯著降低肝損傷小鼠血清中ALT、AST、NO的活性，減少肝組織勻漿中TNF-α和IL-1β的含量[14]。五味子藤莖木脂素和多糖成分能夠通過抗氧化作用，對急性酒精性肝損傷起到保護(hù)作用[15]。五味子乙素可通過誘導(dǎo)小鼠肝臟組織中HSP27和HSP70蛋白的表達(dá)，對Con A所致的小鼠免疫性肝損傷起到保護(hù)作用[16]。氧化苦參堿對ConA 誘導(dǎo)小鼠免疫性肝損傷的保護(hù)作用，可能與抑制CD4+IL-17 A 的表達(dá)、上調(diào)CD4+CD25+FoxP3+Treg 比例、增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化活性有關(guān)[17-18]。

本研究通過Con-A一次性尾靜脈注射的方法，建立小鼠急性免疫性肝損傷模型，成功模擬臨床免疫性肝病的病理過程，進(jìn)一步探討益肝膠囊對免疫性肝損傷小鼠JAK2/ STAT3 信號通路的影響及可能的作用機(jī)制。實驗結(jié)果顯示，與模型組比較，益肝膠囊能明顯降低小鼠血清中ALT、AST、TNF-α、IFN-γ和IL-6水平，顯著減少肝組織中p-JAK2 和p-STAT3 蛋白表達(dá)，顯著升高肝組織中SOCS-3蛋白表達(dá)，明顯改善肝組織的病理學(xué)損傷。綜上所述，益肝膠囊對Con-A所致小鼠免疫性肝損傷的保護(hù)作用與抗炎有關(guān)，其機(jī)制可能通過上調(diào)SOCS-3蛋白表達(dá)，調(diào)控JAK2 /STAT3 信號通路傳導(dǎo)，從而抑制炎癥級聯(lián)反應(yīng)來實現(xiàn)。