宣守松，羅志榮，李涵，趙恬田，牟芳芳，邵水金，國(guó)海東

淫羊藿苷聯(lián)合白藜蘆醇促進(jìn)誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的作用及機(jī)制研究

宣守松，羅志榮，李涵，趙恬田，牟芳芳，邵水金，國(guó)海東

上海中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖教研室，上海 201203

研究淫羊藿苷和白藜蘆醇聯(lián)合應(yīng)用是否可進(jìn)一步提高誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（iPS）向心肌細(xì)胞分化的作用，探討其可能的機(jī)制。CCK8法檢測(cè)淫羊藿苷和白藜蘆醇對(duì)iPS增殖的影響；分別加入不同濃度淫羊藿苷和白藜蘆醇誘導(dǎo)iPS向心肌細(xì)胞分化，RT-qPCR檢測(cè)TNNI3、Cx43、α-actinin心肌細(xì)胞標(biāo)志物和Oct4干細(xì)胞標(biāo)志物；在常規(guī)誘導(dǎo)基礎(chǔ)上，加入0.05 μmol/L淫羊藿苷和0.1 μmol/L白藜蘆醇聯(lián)合誘導(dǎo)iPS，Western blot檢測(cè)心肌肌鈣蛋白T（cTnT）的表達(dá)，RT-qPCR檢測(cè)miR-1和miR-133的表達(dá)。0.05 μmol/L淫羊藿苷對(duì)iPS增殖無(wú)明顯影響，0.1、1、10 μmol/L淫羊藿苷均能促進(jìn)iPS增殖，各濃度白藜蘆醇均可抑制iPS增殖；不同濃度淫羊藿苷均可下調(diào)Oct4的表達(dá)，上調(diào)TNNI3、α-actinin和Cx43的表達(dá)；白藜蘆醇可下調(diào)Oct4的表達(dá)，上調(diào)TNNI3、α-actinin和Cx43的表達(dá)。與常規(guī)誘導(dǎo)方法比較，添加淫羊藿苷和白藜蘆醇聯(lián)合處理可明顯上調(diào)α-actinin mRNA、cTnT蛋白和miR-1的表達(dá)，顯著下調(diào)miR-133的表達(dá)。淫羊藿苷和白藜蘆醇聯(lián)合誘導(dǎo)可進(jìn)一步促進(jìn)iPS向心肌細(xì)胞的分化，其機(jī)制可能與調(diào)控miR-1和miR-133的表達(dá)有關(guān)。

淫羊藿苷；白藜蘆醇；誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞；分化；miRNA

近年來，應(yīng)用干細(xì)胞替代傳統(tǒng)手段治療心肌梗死逐漸受到重視。干細(xì)胞是具有多向分化潛能的原始細(xì)胞，在一定條件下可分化為多種功能細(xì)胞或組織器官。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和初期臨床試驗(yàn)已證實(shí)干細(xì)胞移植是一種安全可行的治療方法，干細(xì)胞在一定程度上可修復(fù)壞死心肌，減少梗死面積，改善受損心臟功能[1-4]。誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cell，iPS）是利用病毒載體將4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子（Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc）的組合轉(zhuǎn)入分化的體細(xì)胞中，使其重編程為類似胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell，ESC）的一種干細(xì)胞類型。iPS具有與ESC類似的自我更新和多向分化潛能。因其取材容易、避免倫理問題、同體移植免疫排斥反應(yīng)弱等諸多優(yōu)點(diǎn)逐漸成為心臟再生治療中備受關(guān)注的細(xì)胞來源。iPS在體外可被誘導(dǎo)為心肌細(xì)胞，移植iPS來源的心肌細(xì)胞（iPS derived cardiomyocytes，iPS-CMs）可改善心肌梗死后心功能，縮小梗死面積[5-6]。淫羊藿苷是淫羊藿的主要活性成分，不僅對(duì)心肌缺血具有保護(hù)作用[7]，還可促進(jìn)ESC向心肌細(xì)胞分化[8-9]。近年研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿苷能提高成纖維細(xì)胞重編程為心肌樣細(xì)胞的效率[10]。白藜蘆醇作為一種天然的多酚物質(zhì)，可抑制心肌細(xì)胞凋亡并改善心肌梗死后心功能[11]。此外，白藜蘆醇還能促進(jìn)干細(xì)胞向心肌細(xì)胞的分化[12]。因此，本研究主要觀察淫羊藿苷和白藜蘆醇聯(lián)合應(yīng)用是否可進(jìn)一步提高iPS向心肌分化的作用，探討其可能的機(jī)制，為解決iPS-CMs移植面臨的關(guān)鍵問題提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥物

淫羊藿苷和白藜蘆醇，批號(hào)17061221，購(gòu)自上海同田生物技術(shù)公司，純度≥98%。

1.2 細(xì)胞

人iPS，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。

1.3 主要試劑與儀器

iPS培養(yǎng)基（貨號(hào)CA1014500）、iPS消化液（貨號(hào)CA3001500）和人心肌細(xì)胞分化培養(yǎng)基（貨號(hào)CA2004500），北京賽貝生物技術(shù)有限公司；心肌肌鈣蛋白T（cTnT，貨號(hào)ab8295），美國(guó)Abcam公司；qPCR Master Mix（貨號(hào)M3003S），美國(guó)NEB公司；miRcute miRNA提取分離試劑盒（貨號(hào)DP501）和miRcute增強(qiáng)型miRNA熒光定量檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)FP411），天根生化科技（北京）有限公司；彩色預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)（貨號(hào)P0068）、CCK8（貨號(hào)C0038）和BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（貨號(hào)P0012），上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Trizol Reagent（貨號(hào)15596018），美國(guó)Invitrogen公司；ECL化學(xué)發(fā)光底物試劑盒（貨號(hào)32106），美國(guó)Pierce公司?；瘜W(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)（Tanon 520，上海天能），多功能酶標(biāo)儀（Synergy 2，BioTeck公司），電泳儀（Mini Gel Tank，美國(guó)Life Technologies公司），轉(zhuǎn)膜儀（小型轉(zhuǎn)印槽1703930，美國(guó)Bio-Rad公司），細(xì)胞培養(yǎng)箱（371，美國(guó)Thermo fisher Scientific），實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（StepOne，美國(guó)ABI公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 CCK8法檢測(cè)

將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的人iPS按1∶6比例傳代至96孔板，每孔加100 μL細(xì)胞懸浮液，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。于10 mg淫羊藿苷和10 mg白藜蘆醇粉末中加1 mL DMSO溶解，再加9 mL PBS稀釋，分別得到濃度為1×10-3mol/L和3×10-3mol/L的母液。然后用培養(yǎng)液將淫羊藿苷母液稀釋為0.05、0.1、1、10 μmol/L，將白藜蘆醇母液稀釋為10、25、50、100 μmol/L。將不同濃度含淫羊藿苷和白藜蘆醇的培養(yǎng)液加到對(duì)應(yīng)標(biāo)記的細(xì)胞中，每孔100 μL。分別于培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加10 μL CCK8溶液處理2 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞活性，讀取450 nm波長(zhǎng)處OD值。

2.2 淫羊藿苷和白藜蘆醇誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)

將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的人iPS按1∶6比例傳代至12孔板，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)90%～98%時(shí)，開始誘導(dǎo)分化。同前配制不同濃度淫羊藿苷（0.01、0.05、0.1、1、10 μmol/L）和白藜蘆醇（0.01、0.1、1 μmol/L）溶液。將不同濃度淫羊藿苷和白藜蘆醇溶液加至相應(yīng)孔中，每孔1 mL，連續(xù)誘導(dǎo)7 d，每日換液。正常組常規(guī)培養(yǎng)，不加誘導(dǎo)劑。

2.3 RT-qPCR檢測(cè)

Trizol法提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)酶標(biāo)儀測(cè)定RNA濃度。取1 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄后獲得cDNA。采用SYBR Green qPCR Mix進(jìn)行PCR檢測(cè)。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性10 s、55 ℃退火20 s、72 ℃延伸20 s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參對(duì)各基因表達(dá)校正并進(jìn)行比較。引物序列由上海生工合成，見表1。

表1 PCR各基因引物序列

基因名稱引物序列（5’～3’）產(chǎn)物長(zhǎng)度/bp TNNI3 上游：TGTGGACAAGGTGGATGAAG下游：TGCCTCGAAGGTCAAAGAT103 CX43上游：CAAAATCGAATGGGGCAGGC下游：GCTGGTCCACAATGGCTAGT135 α-actinin上游：CCTGGGTATGATCTGGACCATC下游：TCCAAGGCCATCTTTCCAGC165 Oct4上游：TCTGAGACATGATGCTCTTCCTT下游：TCACTCAAGTATCACCCCCAG102 GAPDH上游：GTCAAGGCTGAGAACGGGAA下游：AAATGAGCCCCAGCCTCCTC162

2.4 白藜蘆醇和淫羊藿苷聯(lián)合常規(guī)誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)

選擇0.05 μmol/L淫羊藿苷和0.1 μmol/L白藜蘆醇用于后續(xù)的分化實(shí)驗(yàn)。將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞傳代至培養(yǎng)皿，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為正常組、淫羊藿苷組、白藜蘆醇組、淫白聯(lián)合組、常規(guī)誘導(dǎo)組、淫白聯(lián)合＋常規(guī)誘導(dǎo)組。正常組：只加正常培養(yǎng)液培養(yǎng)，不進(jìn)行誘導(dǎo)。淫羊藿苷組：當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)90%～98%時(shí)，更換成0.05 μmol/L淫羊藿苷溶液進(jìn)行誘導(dǎo)，每日換液，連續(xù)7 d。白藜蘆醇組：當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)90%～98%時(shí)，更換成0.1 μmol/L白藜蘆醇溶液進(jìn)行誘導(dǎo)，每日換液，連續(xù)7 d。淫白聯(lián)合組：當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)90%～98%時(shí)，更換成含0.05 μmol/L淫羊藿苷和0.1 μmol/L白藜蘆醇的溶液進(jìn)行誘導(dǎo)，每日換液，連續(xù)7 d。常規(guī)誘導(dǎo)組：當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)90%～98%時(shí)，使用人iPS分化培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)分化。步驟：PBS洗2遍，每孔加2 mL誘導(dǎo)分化試劑Ⅰ，48 h后吸掉誘導(dǎo)分化試劑Ⅰ，PBS輕洗2遍；每孔加2 mL誘導(dǎo)分化試劑Ⅱ，48 h后吸掉誘導(dǎo)分化試劑Ⅱ，PBS輕洗2遍；每孔加2 mL誘導(dǎo)分化試劑Ⅲ，48 h后換新鮮的誘導(dǎo)分化試劑Ⅲ，之后液體變黃便更換新鮮誘導(dǎo)分化試劑Ⅲ，直至出現(xiàn)細(xì)胞跳動(dòng)。淫白聯(lián)合＋常規(guī)誘導(dǎo)組：當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)90%～98%時(shí)，在常規(guī)誘導(dǎo)的基礎(chǔ)上，添加0.05 μmol/L淫羊藿苷和0.1 μmol/L白藜蘆醇溶液進(jìn)行聯(lián)合誘導(dǎo)分化，連續(xù)7 d。

2.5 Western blot檢測(cè)

誘導(dǎo)7 d，用刮刀將細(xì)胞刮下，轉(zhuǎn)至15 mL離心管，1000 r/min離心5 min，吸掉上清液，加入500 μL含磷酸酶抑制劑的蛋白裂解液RIPA，反復(fù)吹打，冰上靜置10 min。4 ℃、12 000 r/min離心10 min，收集總蛋白。BCA法測(cè)定蛋白濃度，加入5×蛋白上樣緩沖液，98 ℃變性5 min，電泳后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入一抗，4 ℃搖床孵育過夜，0.01 mol/L PBST洗3次，加入對(duì)應(yīng)的二抗，室溫孵育1 h。0.01 mol/L PBST洗3遍，ECL化學(xué)發(fā)光，對(duì)蛋白條帶拍照并對(duì)條帶灰度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2.6 miRNA表達(dá)檢測(cè)

經(jīng)miRcute miRNA提取分離試劑盒提取各樣本miRNA，通過miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)1 μg miRNA行反轉(zhuǎn)錄。將2×miRcute Plus miRNA Premix、50×ROX Reference Dye和Reverse Primer冰上溶化，配制反應(yīng)體系。按下述程序進(jìn)行qPCR反應(yīng)：95 ℃變性15 min；94 ℃、20 s，60 ℃、34 s，45個(gè)循環(huán)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

4 結(jié)果

4.1 淫羊藿苷和白藜蘆醇對(duì)誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞增殖的影響

結(jié)果顯示，0.1 μmol/L淫羊藿苷在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)均可促進(jìn)iPS增殖，0.05 μmol/L淫羊藿苷對(duì)iPS增殖無(wú)明顯影響；1 μmol/L淫羊藿苷48、72 h可促進(jìn)iPS增殖，10 μmol/L淫羊藿苷72 h有利于iPS增殖；25、50、100 μmol/L白藜蘆醇24、48、72 h均可降低iPS增殖。結(jié)果見圖1。

注：與正常組比較，*P＜0.05

4.2 淫羊藿苷和白藜蘆醇單獨(dú)誘導(dǎo)對(duì)誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的影響

不同濃度淫羊藿苷和白藜蘆醇處理7 d，光鏡觀察和RT-qPCR檢測(cè)人iPS向心肌細(xì)胞的分化。鏡下可見，隨著淫羊藿苷和白藜蘆醇處理時(shí)間的增加，iPS發(fā)生明顯改變，由圓形逐漸變?yōu)殚L(zhǎng)梭形，淫羊藿苷組較白藜蘆醇組形態(tài)發(fā)生改變更明顯，且時(shí)間更早，見圖2。RT-qPCR結(jié)果顯示，不同濃度淫羊藿苷處理后均可顯著下調(diào)干細(xì)胞標(biāo)志物Oct4的表達(dá)，顯著上調(diào)心肌標(biāo)志物TNNI3、α-actinin和Cx43的表達(dá)；白藜蘆醇可下調(diào)Oct4的表達(dá)，并上調(diào)TNNI3、α-actinin和Cx43的表達(dá)。見圖3。

4.3 淫羊藿苷和白藜蘆醇聯(lián)合誘導(dǎo)對(duì)誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的影響

根據(jù)“4.2”項(xiàng)下檢測(cè)結(jié)果可知，0.05 μmol/L淫羊藿苷未促進(jìn)iPS增殖，且能顯著抑制Oct4的表達(dá)，上調(diào)TNNI3和α-actinin的表達(dá)；0.1 μmol/L白藜蘆醇顯著下調(diào)Oct4的表達(dá)，上調(diào)TNNI3和α-actinin的表達(dá)。因此，選擇0.05 μmol/L淫羊藿苷和0.1 μmol/L白藜蘆醇對(duì)iPS聯(lián)合誘導(dǎo)，光鏡觀察和RT-qPCR、Western blot檢測(cè)淫羊藿苷和白藜蘆醇誘導(dǎo)人iPS向心肌細(xì)胞分化的作用。與人iPS心肌細(xì)胞常規(guī)誘導(dǎo)方法比較，添加淫羊藿苷和白藜蘆醇聯(lián)合誘導(dǎo)后iPS-CMs更易連接成片，有利于誘導(dǎo)后期的搏動(dòng)；淫羊藿苷和白藜蘆醇聯(lián)合誘導(dǎo)較淫羊藿苷和白藜蘆醇單獨(dú)誘導(dǎo)α-actinin mRNA表達(dá)升高；與常規(guī)誘導(dǎo)類似，淫羊藿苷和白藜蘆醇聯(lián)合誘導(dǎo)可顯著降低Oct4的表達(dá)，且α-actinin mRNA和cTnT蛋白的表達(dá)顯著升高（＜0.05）。結(jié)果見圖4。

圖2 淫羊藿苷和白藜蘆醇誘導(dǎo)iPS向心肌細(xì)胞分化后形態(tài)（標(biāo)尺＝100 μm）

注：與正常組比較，*P＜0.05

注：A.光鏡觀察（標(biāo)尺=50 μm）；B、C. RT-qPCR；D、E. Western blot；與正常組比較，*P＜0.05；與淫白聯(lián)合組比較，#P＜0.05；與常規(guī)誘導(dǎo)組比較，△P＜0.05

4.4 淫羊藿苷和白藜蘆醇聯(lián)合誘導(dǎo)對(duì)miR-1和miR-133表達(dá)的影響

與常規(guī)誘導(dǎo)組比較，添加淫羊藿苷和白藜蘆醇聯(lián)合處理可明顯上調(diào)miR-1的表達(dá)，顯著下調(diào)miR-133的表達(dá)，見圖5。

注：與常規(guī)誘導(dǎo)組比較，△P＜0.05，△△P＜0.0

5 討論

心肌梗死在心血管疾病中最為嚴(yán)重，大部分心肌梗死由冠狀動(dòng)脈堵塞導(dǎo)致。冠狀動(dòng)脈堵塞后，局部心肌缺血缺氧，導(dǎo)致心肌細(xì)胞壞死，壞死的心肌組織膠原沉積，形成纖維化瘢痕，導(dǎo)致心肌收縮能力下降，甚至引起心力衰竭和死亡。雖然干細(xì)胞移植治療心肌梗死越來越受到重視，但也存在一些問題。如干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化和增殖問題，移植后干細(xì)胞在體內(nèi)存活，以及干細(xì)胞遷移和歸巢問題。干細(xì)胞治療可直接移植未分化的干細(xì)胞，也可在體外先將干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞，再移植到體內(nèi)。在體外誘導(dǎo)干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞，得到的心肌細(xì)胞其成熟度不高，移植后與宿主心肌細(xì)胞不能形成電偶聯(lián)，可能導(dǎo)致宿主心律不齊、心律失常[13]。

iPS-CM成熟至關(guān)重要，它是衡量一個(gè)細(xì)胞具有生理功能的基礎(chǔ)，也是決定干細(xì)胞移植治療成功與否的關(guān)鍵因素之一。有研究發(fā)現(xiàn)，電刺激可提高iPS向心肌分化的效率并促進(jìn)心肌細(xì)胞成熟。電刺激預(yù)處理心肌細(xì)胞成為臨床應(yīng)用于心肌梗死治療的有前景的方法[14]?，F(xiàn)代藥理研究表明，淫羊藿苷通過Wnt信號(hào)通路調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞雙向分化（促進(jìn)向成骨細(xì)胞分化，抑制向脂肪細(xì)胞分化）而發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松的作用[15]；并可通過介導(dǎo)激酶信號(hào)傳遞途徑促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的自我更新與分化[16]。淫羊藿苷可誘導(dǎo)小鼠ESC分化為搏動(dòng)功能性心肌細(xì)胞[9]。淫羊藿苷能部分通過調(diào)節(jié)JP2促進(jìn)心肌分化，并改善心肌細(xì)胞的Ca2+調(diào)節(jié)功能[8]。白藜蘆醇可抑制經(jīng)典Wnt信號(hào)通路，激活SRF-miR-1軸，促進(jìn)人iPS向心肌細(xì)胞分化[17]。TNNI3和α-actinin作為心肌細(xì)胞的特異標(biāo)志物，是檢測(cè)干細(xì)胞向心肌分化的重要指標(biāo)[18-19]。此外，Cx43參與偶聯(lián)心肌細(xì)胞間的電、化學(xué)信號(hào)的傳遞，也可作為心肌發(fā)育晚期的標(biāo)志物[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿苷和白藜蘆醇均可上調(diào)TNNI3、Cx43、α-actinin的表達(dá)，并且淫羊藿苷和白藜蘆醇聯(lián)合誘導(dǎo)比淫羊藿苷和白藜蘆醇單獨(dú)誘導(dǎo)進(jìn)一步上調(diào)α-actinin的表達(dá)。此外，與常規(guī)誘導(dǎo)比較，添加淫羊藿苷和白藜蘆醇聯(lián)合處理可顯著上調(diào)α-actinin mRNA和cTnT蛋白的表達(dá)。

miR-1在心臟疾病中扮演著重要角色[21]。有研究表明，miR-1通過下調(diào)Dll-1-Hes-1/Notch信號(hào)調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化[22]。與miR-1相反，miR-133可通過靶向抑制SRF的表達(dá)促進(jìn)成肌細(xì)胞的增殖并抑制其分化[23]。我們通過RT-qPCR檢測(cè)miR-1和miR-133的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加淫羊藿苷和白藜蘆醇聯(lián)合處理可明顯上調(diào)miR-1的表達(dá)，顯著下調(diào)miR-133的表達(dá)。這可能是淫羊藿苷和白藜蘆醇聯(lián)合處理促進(jìn)iPS-CMs成熟的作用機(jī)制之一。

此外，iPS在體外誘導(dǎo)分化的程度可影響iPS移植治療心肌梗死的效果。有研究比較誘導(dǎo)4、8、20、30 d后iPS-CMs移植的效果，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)20 d后iPS-CMs在宿主小鼠心臟中具有最高的植入率、增殖力和治療潛力[24]。本研究將淫羊藿苷和白藜蘆醇聯(lián)合處理誘導(dǎo)時(shí)間為7 d，淫羊藿苷和白藜蘆醇聯(lián)合處理時(shí)間延長(zhǎng)是否會(huì)有更好的效果值得進(jìn)一步探討。

綜上所述，淫羊藿苷和白藜蘆醇聯(lián)合誘導(dǎo)可進(jìn)一步促進(jìn)iPS向心肌細(xì)胞的分化，其機(jī)制可能與上調(diào)miR-1和下調(diào)miR-133的表達(dá)有關(guān)。本研究為解決iPS-CMs移植治療心肌梗死等缺血性心臟病面臨的關(guān)鍵問題提供了新的策略和手段。

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Study on Effects and Mechanism of Icariin Combined with Resveratrol forDifferentiation of Induced Pluripotent Stem Cells into Cardiomyocytes

XUAN Shousong, LUO Zhirong, LI Han, ZHAO Tiantian, MOU Fangfang, SHAO Shuijin, GUO Haidong

To study whether the combination of icariin and resveratrol can further improve the effects of differentiation of induced pluripotent stem cells (iPS) into cardiomyocytes; To discuss its possible mechanism.CCK8 assay was used to detect the effects of icariin and resveratrol on the proliferation of iPS. Different concentrations of icariin and resveratrol were chosen to induce the differentiation of iPS into cardiomyocytes, and RT-qPCR was used to detect the changes of cardiomyocyte markers TNNI3, Cx43, α-actinin and stem cell marker Oct4. On the basis of conventional induction, the combination of 0.05 μmol/L icariin and 0.1 μmol/L resveratrol were added to induce iPS; the expression of cTnT was detected by western blot; the expression of miR-1 and miR-133 were detected by RT-qPCR.0.05 μmol/L icariin had no significant effect on the proliferation of iPS. 0.1 μmol/L, 1 μmol/L and 10 μmol/L icariin could promote the proliferation of iPS, while resveratrol could inhibit the proliferation of iPS. Different concentrations of icariin could down-regulate the expression of Oct4, but up-regulate the expressions of TNNI3, Cx43 and α-actinin; resveratrol also could decrease the expression of Oct4 and increase the expressions of TNNI3, Cx43 and α-actinin. Compared with the conventional induction method, the combination of icariin and resveratrol could significantly increase the expressions of α-actinin mRNA, cTnT protein and miR-1, but significantly inhibit the expression of miR-133.The combination of icariin and resveratrol can further promote the differentiation of iPS into cardiomyocytes, and the mechanism may be related to the regulation of expressions of miR-1 and miR-133.

icariin; resveratrol; induced pluripotent stem cells; differentiation; miRNA

R285.5

A

1005-5304(2020)08-0057-06

10.3969/j.issn.1005-5304.202004037

國(guó)家自然科學(xué)基金（81673729、81704157）；上海市進(jìn)一步加快中醫(yī)藥事業(yè)發(fā)展三年行動(dòng)計(jì)劃（ZY (2018-2020)-CCCX-2001-01）

國(guó)海東，E-mail：hdguo@shutcm.edu.cn

（2020-04-01）

（2020-04-22；編輯：華強(qiáng)）