秦芳芳 曹 勇 張 喆 唐與濃

克羅恩病(CD)是一種腸道慢性炎性疾病，發(fā)病率呈逐年升高趨勢(shì)[1]。CD的發(fā)病原因尚未完全明確，其具有復(fù)發(fā)率高、并發(fā)癥多等特點(diǎn)[2-3]。隨著CD的進(jìn)展，患者可出現(xiàn)腸道狹窄、瘺管等腸道結(jié)構(gòu)性損傷，嚴(yán)重者可發(fā)生癌變[4]。因此，盡早評(píng)估CD患者的病情，對(duì)于制定有效干預(yù)措施，從而改善患者的預(yù)后具有重要意義。有研究顯示，血清膽堿酯酶、紅細(xì)胞沉降率(ESR)等指標(biāo)評(píng)估CD嚴(yán)重程度的敏感度均較低[5]。因此，急需探尋敏感度、準(zhǔn)確度較高的生物學(xué)標(biāo)志物用于評(píng)估CD的嚴(yán)重程度。有研究指出，Toll樣受體可通過(guò)調(diào)節(jié)B細(xì)胞的促炎活性參與CD的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程[6-7]，另有細(xì)胞研究表明環(huán)狀RNA-102685(hsa-circRNA-102685)可能參與了Toll樣受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[8]，因此推測(cè)hsa-circRNA-102685可能參與了CD的發(fā)生和發(fā)展。本文探討了hsa-circRNA-102685在CD黏膜組織中的表達(dá)水平及意義，并分析其與CD嚴(yán)重程度及患者預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013年6月至2018年6月中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院及遼寧省金秋醫(yī)院收治的共104例CD患者作為研究對(duì)象(設(shè)為CD組)，CD診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《中國(guó)炎癥性腸病診斷治療規(guī)范的共識(shí)意見(jiàn)》[9]。結(jié)腸鏡檢查結(jié)果顯示，CD患者中緩解期41例，活動(dòng)期63例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合CD的診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)初次確診為CD；(3)年齡≥18歲；(4)入組前未服用免疫抑制劑、非甾體類(lèi)抗炎藥等；(5)簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并消化道惡性腫瘤；(2)合并嚴(yán)重的心、肝、腎功能障礙；(3)合并全身感染性疾病；(4)隨訪失聯(lián)。選取同期在本院接受單發(fā)息肉切除術(shù)的100例結(jié)腸息肉患者作為對(duì)照組。104例CD患者中男性64例，女性40例，年齡18～36歲，平均年齡為(27.93±3.19)歲。對(duì)照組中男性58例，女性42例，年齡20～34歲，平均年齡為(28.44±3.23)歲。兩組在性別(χ2=0.266，P=0.606)、年齡(t=1.135，P=0.258)方面比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 檢測(cè)方法

抽取患者入組次日清晨空腹外周靜脈血10 mL，室溫下4 000 r/min離心10 min，離心半徑為8 cm，分離上層血清，置于-20 ℃冰箱，待測(cè)。采用免疫比濁法檢測(cè)血清C反應(yīng)蛋白(CRP)水平，試劑盒購(gòu)自北京世紀(jì)沃德生物科技有限公司；采用Sysmex XE-5000全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀(購(gòu)自日本希森美康)測(cè)定血液ESR、白蛋白、血紅蛋白水平。

采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測(cè)CD組和對(duì)照組的hsa-circRNA-102685相對(duì)表達(dá)量。采集患者黏膜組織后，30 min內(nèi)將保存組織樣本的凍存管置于液氮罐中保存待檢。在液氮中研磨CD患者的炎性組織及對(duì)照組的正常黏膜組織，采用TRIzol試劑法提取總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的純度及表達(dá)水平。應(yīng)用核酸蛋白儀和瓊脂糖電泳對(duì)提取的RNA進(jìn)行分析。取5 μL總RNA，85 ℃水浴5 min后加入反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，44 ℃孵育60 min后終止，留取產(chǎn)物待用。擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參，用2-ΔΔCt表示hsa-circRNA-102685的相對(duì)表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.3 CD嚴(yán)重程度評(píng)估

根據(jù)克羅恩病活動(dòng)指數(shù)(CDAI)評(píng)分評(píng)估疾病活動(dòng)期的嚴(yán)重程度，主要包括腹痛、腹部包塊、腹瀉及伴隨疾病4個(gè)方面[9]。腹痛按輕度、中度、重度疼痛分別記為1、2、3分；腹部包塊按照可疑、確定、伴觸痛分別記為1、2、3分；腹瀉每日1次記1分；伴隨疾病包括關(guān)節(jié)痛、虹膜炎、結(jié)節(jié)性紅斑、壞疽性膿皮病、阿弗他潰瘍、裂溝、新瘺管、膿腫，每種癥狀記1分。CDAI評(píng)分≤4分為緩解期，>4分為活動(dòng)期。CDAI評(píng)分5～7分為輕度，8～16分為中度，>16分為重度。

1.4 隨訪

采用復(fù)診方式對(duì)CD患者進(jìn)行為期3年的跟蹤隨訪，記錄患者預(yù)后情況。本研究將復(fù)發(fā)、CD相關(guān)再入院及發(fā)生CD相關(guān)結(jié)直腸癌定義為預(yù)后不良。隨訪起始時(shí)間為2013年6月20日，截止時(shí)間為2018年6月13日。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兩組hsa-circRNA-102685相對(duì)表達(dá)量的比較

CD組患者h(yuǎn)sa-circRNA-102685的相對(duì)表達(dá)量為4.27±0.93，高于對(duì)照組(2.35±0.62)，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=17.280，P<0.05)。

2.2 不同病變部位CD患者h(yuǎn)sa-circRNA-102685相對(duì)表達(dá)量的比較

CD組患者中，病變位于回腸末段(n=37)、結(jié)腸(n=34)、回結(jié)腸(n=33)者的hsa-circRNA-102685相對(duì)表達(dá)量分別為4.31±1.02、4.26±0.95、4.24±0.89。不同病變部位hsa-circRNA-102685相對(duì)表達(dá)量的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.014，P=0.991)。

2.3 不同嚴(yán)重程度CD患者h(yuǎn)sa-circRNA-102685相對(duì)表達(dá)量的比較

緩解期CD患者h(yuǎn)sa-circRNA-102685的相對(duì)表達(dá)量為3.72±0.87，低于活動(dòng)期(4.62±0.95)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.878，P<0.001)。63例活動(dòng)期CD患者按照CDAI評(píng)分評(píng)估為輕度組19例、中度組25例、重度組19例。輕度組、中度組、重度組CD患者的hsa-circRNA-102685相對(duì)表達(dá)量分別為3.93±0.90、4.55±0.94、5.40±1.03，3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=11.768，P<0.001)，其中重度組hsa-circRNA-102685的相對(duì)表達(dá)量高于中度組及輕度組，且中度組高于輕度組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。

2.4 hsa-circRNA-102685與CD患者預(yù)后的關(guān)系

104例CD患者在隨訪期間的預(yù)后不良發(fā)生率為54.81%(57/104)，其中CD復(fù)發(fā)23例(22.12%)、CD相關(guān)再入院33例(31.73%)、結(jié)腸癌變1例(0.96%)。預(yù)后不良組患者h(yuǎn)sa-circRNA-102685的相對(duì)表達(dá)量為4.83±1.02，高于預(yù)后良好組(3.59±0.96)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.335，P<0.001)。Hsa-circRNA-102685評(píng)估CD患者預(yù)后的ROC曲線下面積(AUC)、敏感度、特異度和最佳截?cái)帱c(diǎn)分別為0.806(95%CI：0.716～0.877)、84.21%、68.09%和3.81。見(jiàn)圖1。

圖1 hsa-circRNA-102685評(píng)估CD患者預(yù)后的ROC曲線

2.5 不同預(yù)后患者的基本資料比較

預(yù)后良好組與預(yù)后不良組在年齡、性別、體質(zhì)指數(shù)(BMI)、病變部位、腸道損傷、治療方案、治療時(shí)間方面比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；預(yù)后不良組中吸煙、肛周病變、腸切除術(shù)史、疾病穿透行為的占比及CRP、ESR水平高于預(yù)后良好組，而白蛋白、血紅蛋白水平低于預(yù)后良好組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。具體見(jiàn)表2。

表2 不同預(yù)后患者的基本資料比較

2.6 影響CD患者預(yù)后的因素分析

根據(jù)CRP、ESR、白蛋白、血紅蛋白、hsa-circRNA-102685評(píng)估CD患者預(yù)后的最佳截?cái)嘀祵⑵滢D(zhuǎn)換為二分類(lèi)變量。將吸煙(否=0，是=1)、肛周病變(無(wú)=0，有=1)、腸切除術(shù)史(無(wú)=0，有=1)、疾病行為(非狹窄非穿透、狹窄=0，穿透=1)、CRP(<80.37 μmol/L=0，≥80.37 μmol/L=1)、ESR(<12.59 mm/h=0，≥12.59 mm/h=1)、白蛋白(≥28.53 g/L=0，<28.53 g/L=1)、血紅蛋白(≥124.15 g/L=0，<124.15 g/L=1)、hsa-circRNA-102685(<3.82=0，≥3.82=1)作為自變量，將CD患者的預(yù)后情況(預(yù)后良好=0，預(yù)后不良=1)作為因變量，納入多因素Logistic回歸模型，結(jié)果顯示吸煙、肛周病變、腸切除術(shù)史、疾病行為、hsa-circRNA-102685與CD患者的預(yù)后密切相關(guān)。見(jiàn)表3。

表3 影響CD患者預(yù)后的因素分析

3 討論

circRNA是區(qū)別于傳統(tǒng)線性RNA的一類(lèi)新型非編碼RNA，具有閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，在人類(lèi)細(xì)胞中廣泛表達(dá)[10-11]。circRNA可通過(guò)吸附miRNA調(diào)控靶基因的表達(dá)[12]。近年來(lái)，關(guān)于circRNA用于疾病診斷及靶向治療已成為臨床研究的熱點(diǎn)。Hsa-circRNA-102685作為circRNA家族一員，可參與細(xì)胞凋亡過(guò)程。有研究表明，hsa-circRNA-102685對(duì)p53基因具有調(diào)節(jié)作用，而p53基因的異常表達(dá)與CD的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[8]。目前有關(guān)hsa-circRNA-102685在CD中的表達(dá)水平及與患者病情之間關(guān)系的報(bào)道較少，本文就hsa-circRNA-102685與CD嚴(yán)重程度的關(guān)系進(jìn)行了探討。

本研究結(jié)果顯示，CD組患者h(yuǎn)sa-circRNA-102685的相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組，提示hsa-circRNA-102685可能與CD的發(fā)生存在聯(lián)系。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，活動(dòng)期CD患者的hsa-circRNA-102685相對(duì)表達(dá)量高于緩解期，提示hsa-circRNA-102685可作為評(píng)估CD病情的潛在標(biāo)志物。隨后，本研究比較了不同嚴(yán)重程度CD患者的hsa-circRNA-102685相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示重度組患者的hsa-circRNA-102685相對(duì)表達(dá)量高于中度組及輕度組，而中度組高于輕度組，表明hsa-circRNA-102685可能與CD嚴(yán)重程度相關(guān)。本研究通過(guò)隨訪發(fā)現(xiàn)，預(yù)后不良組患者的hsa-circRNA-102685相對(duì)表達(dá)量高于預(yù)后良好組，提示檢測(cè)hsa-circRNA-102685相對(duì)表達(dá)量可能有助于評(píng)估CD患者的預(yù)后。因此，本研究進(jìn)一步構(gòu)建了hsa-circRNA-102685評(píng)估CD患者預(yù)后的ROC曲線，結(jié)果顯示hsa-circRNA-102685評(píng)估患者預(yù)后的AUC為0.806，提示效能較高。多因素Logistic回歸分析顯示，吸煙、肛周病變、腸道損傷、腸切除術(shù)史、疾病行為與CD患者的預(yù)后密切相關(guān)，與既往的研究結(jié)果相符[13-14]。

Toll樣受體可識(shí)別腸道內(nèi)致病菌的DNA，且活化后的Toll樣受體可通過(guò)激活腸道白細(xì)胞介素-10(IL-10)等炎性因子，參與腸道免疫反應(yīng)[15]。腸道菌群免疫失衡后被Toll樣受體識(shí)別，在機(jī)體免疫、腸道炎性反應(yīng)、遺傳基因等多種因素作用下表達(dá)升高，引起下游相關(guān)因子如IL-1、核因子-κB的變化，促使CD發(fā)生[16-17]，hsa-circRNA-102685可促進(jìn)Toll樣受體表達(dá)[8]。此外，hsa-circRNA-102685具有調(diào)節(jié)p53基因表達(dá)的作用，p53可促進(jìn)炎性因子聚集，且p53磷酸化后可促進(jìn)結(jié)腸黏膜細(xì)胞凋亡，并調(diào)節(jié)其下游基因，參與CD的病理生理過(guò)程[18]。由此推測(cè)，hsa-circRNA-102685可能通過(guò)調(diào)節(jié)Toll樣受體及p53的表達(dá)，參與CD的疾病進(jìn)展。

綜上所述，hsa-circRNA-102685與CD患者的嚴(yán)重程度及預(yù)后密切相關(guān)，檢測(cè)hsa-circRNA-102685表達(dá)水平有助于評(píng)估患者的預(yù)后。今后將對(duì)hsa-circRNA-102685參與CD患者嚴(yán)重程度及預(yù)后的病理生理機(jī)制作進(jìn)一步探討。