秦佳敏 陳小龍 敬朝強(qiáng)

潰瘍性結(jié)腸炎(UC)是常見的炎癥性腸病，是慢性腸道疾病的一種[1]，其發(fā)病機(jī)制尚未明確，近年來分子生物學(xué)研究認(rèn)為，腸道蛋白酶的水解作用異常增強(qiáng)，患者的蛋白酶以及抗蛋白酶比例失衡，造成患者腸道蛋白水平異常，構(gòu)成了疾病的病理基礎(chǔ)。細(xì)胞命運(yùn)決定子(Numb)通過促進(jìn)肌球蛋白輕鏈的磷酸化，影響腸道黏膜屏障功能，從而改變腸黏膜通透性，促進(jìn)患者腸道炎性反應(yīng)[2]。炎性小體NLRP3的生理作用主要是對機(jī)體損傷信號(hào)的有效識(shí)別，通過調(diào)控一系列炎性因子的釋放，最終導(dǎo)致患者細(xì)胞焦亡，且其表達(dá)水平與患者的腸道炎性反應(yīng)程度存在一定的相關(guān)性。有報(bào)道指出，NLRP3的異常激活與腸道炎性疾病相關(guān)[3]。白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)具有促炎性細(xì)胞分泌作用，通過增強(qiáng)結(jié)腸黏膜的炎性反應(yīng)，激活局部T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞，上調(diào)患者的免疫功能，加重患者的臨床癥狀[4]。本研究將通過觀察Numb、NLRP3及IL-1β在UC靜息狀態(tài)以及發(fā)病期的表達(dá)差異及臨床意義，為臨床治療和預(yù)后分析提供科學(xué)依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 基本資料

選取2015年2月至2018年2月期間在四川綿陽四〇四醫(yī)院就診的100例處于發(fā)病期的UC患者作為研究對象(設(shè)為發(fā)病組)，另選取同期100例無臨床癥狀的UC患者作為對照(設(shè)為靜息組)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合UC的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]；(2)經(jīng)結(jié)腸鏡確診；(3)簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)心、肝、腎功能嚴(yán)重不全者；(2)存在交流障礙的患者；(3)不配合本研究方案者。發(fā)病組患者中男性62例，女性38例，年齡為31～54歲，平均年齡(36.57±5.04)歲，平均體質(zhì)指數(shù)(BMI)為(24.06±3.76)kg/m2。根據(jù)《炎癥性腸病診斷與治療的共識(shí)意見(2012年·廣州)》[5]，將發(fā)病組患者分為輕度39例、中度33例、重度28例。靜息組患者中男性69例，女性31例，年齡為31～55歲，平均年齡(36.37±5.46)歲，平均BMI為(23.91±3.48)kg/m2。發(fā)病組及靜息組患者的性別、年齡、BMI之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 研究方法

1.2.1 IL-1β檢測 采集患者靜脈血4 mL，3 500 r/min離心15 min，取上清液，采用放射免疫分析法檢測患者的IL-1β水平，試劑盒購自北京市福瑞生物工程有限公司，操作方法嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.2.2 NLRP3蛋白檢測 采集患者靜脈血4 mL，3 500 r/min離心15 min，取患者的富血小板血漿再次離心，獲得患者血小板，采用組織/細(xì)胞快速裂解液(RIPA)進(jìn)行裂解后，繼續(xù)離心取上清液，以1∶4比例加入SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳蛋白后，沸水浴10 min，洗去轉(zhuǎn)膜液，加入Western封閉液2 h，分別以1∶200以及1∶500比例加入一抗及二抗，4 ℃孵育過夜。隨后加入洗滌劑洗滌3次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗稀釋液，在室溫條件下孵育2 h，再次加入洗滌液洗滌3次，最后采用發(fā)光試劑盒檢測NLRP3蛋白，試劑盒購自上海羅氏制藥有限公司，操作流程嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.2.3 Numb檢測 所有患者均行結(jié)腸鏡檢查，獲取患者的結(jié)腸黏膜組織，隨后進(jìn)行石蠟包埋，5 μm切片，采用兔抗人Numb多克隆抗體作為一抗，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗作為二抗，融化切片后，置于二甲苯以及乙醇中再次進(jìn)行脫蠟，隨后置入EDTA修復(fù)液中進(jìn)行高壓修復(fù)，修復(fù)完成后使用3%的過氧化氫進(jìn)行內(nèi)源性過氧化物酶去除，隨后使用PBS溶液封閉1 h，立即加入一抗，4 ℃孵育過夜。再次使用PBS溶液進(jìn)行洗滌，加入二抗，在室溫條件下孵育1 h，之后進(jìn)行DAB染色，蘇木精染核，乙醇分色，脫水后，使用中性樹脂進(jìn)行封片，待檢。使用光學(xué)顯微鏡觀察上述標(biāo)本，20倍放大后，隨機(jī)選擇4個(gè)視野，對染色陽性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。陽性細(xì)胞百分比≤5%記0分，6%～25%記1分，26%～75%記3分，>75%記4分。染色程度較弱記1分，中度染色記2分，強(qiáng)染色記3分。Numb的相對表達(dá)量為陽性細(xì)胞百分比與染色強(qiáng)度分?jǐn)?shù)的乘積。

1.3 觀察指標(biāo)

比較發(fā)病組和靜息組患者的Numb、NLRP3及IL-1β水平。比較發(fā)病組中不同疾病嚴(yán)重程度患者的Numb、NLRP3及IL-1β表達(dá)水平差異。分析不同疾病嚴(yán)重程度以及疾病狀態(tài)與患者的Numb、NLRP3及IL-1β表達(dá)水平的相關(guān)性。采用多因素Logistic回歸方法分析影響患者疾病嚴(yán)重程度以及疾病狀態(tài)的相關(guān)因素。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 發(fā)病組和靜息組患者的Numb、NLRP3及IL-1β表達(dá)水平比較

由表1可知，發(fā)病組患者的NLRP3及IL-1β表達(dá)水平顯著高于靜息組，而Numb表達(dá)水平低于靜息組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 兩組的Numb、NLRP3及IL-1β表達(dá)水平比較

2.2 不同疾病嚴(yán)重程度者的Numb、NLRP3及IL-1β表達(dá)水平比較

由表2可知，輕度、中度以及重度患者的Numb、NLRP3及IL-1β表達(dá)水平之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。通過兩兩比較發(fā)現(xiàn)，隨著患者病情的加重，患者的Numb水平顯著下降，NLRP3及IL-1β水平顯著上升，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。

表2 不同疾病嚴(yán)重程度患者的Numb、NLRP3及IL-1β表達(dá)水平比較

2.3 Numb、NLRP3及IL-1β表達(dá)水平與疾病嚴(yán)重程度的相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)性分析顯示，Numb與患者的疾病進(jìn)展以及疾病狀態(tài)呈負(fù)相關(guān)，NLRP3及IL-1β與患者的疾病進(jìn)展以及疾病狀態(tài)呈正相關(guān)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見表3。

表3 Numb、NLRP3及IL-1β表達(dá)水平與疾病嚴(yán)重程度的相關(guān)性分析

2.4 患者的疾病嚴(yán)重程度以及疾病狀態(tài)的多因素分析

將Numb、NLRP3及IL-1β表達(dá)水平納入多因素Logistic回歸模型，結(jié)果顯示Numb、NLRP3及IL-1β表達(dá)水平均為UC患者疾病嚴(yán)重程度以及疾病狀態(tài)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。詳見表4。

表4 患者的疾病嚴(yán)重程度以及疾病狀態(tài)的多因素分析

3 討論

UC患者的發(fā)病機(jī)制尚未明確，目前認(rèn)為腸黏膜上皮細(xì)胞損傷是其重要的病理生理學(xué)依據(jù)[6]。正常的腸黏膜組成了患者的腸道屏障，其腸黏膜上皮細(xì)胞、腸道菌群以及黏液處于相對穩(wěn)定狀態(tài)，在腸黏膜的表面附著有絨毛，而腸上皮細(xì)胞以及固有層在腸腔內(nèi)突起，此時(shí)絨毛與固有層之間形成的隱窩稱之為Lieberkühn隱窩[7]。在正常機(jī)體中，該隱窩中的干細(xì)胞通過新陳代謝以及細(xì)胞增殖的方式分化形成相應(yīng)的杯狀細(xì)胞、潘氏細(xì)胞以及內(nèi)分泌細(xì)胞，作為在新陳代謝中凋亡細(xì)胞的補(bǔ)充，而Numb作為重要的干細(xì)胞命運(yùn)決定子，對于患者腸黏膜細(xì)胞的分化起著決定性的作用[8]。此外，Numb是腸黏膜上皮細(xì)胞的特異性蛋白，在疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要作用。NLRP3與UC的易感性相關(guān)[9]，主要在患者的血小板中表達(dá)，通過血小板的炎性反應(yīng)參與了UC患者的病理生理過程。血液中活化的血小板可促進(jìn)患者炎性因子以及血管生成因子釋放，加重腸黏膜細(xì)胞及毛細(xì)血管的損傷程度，進(jìn)而調(diào)控患者的免疫反應(yīng)[10]。有研究證實(shí)，在激活患者的血小板后，可通過對患者的NLRP3、天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-1(caspase-1)的激活[11]，介導(dǎo)患者血小板微粒中IL-1β釋放入血，造成患者的IL-1β水平顯著升高，通過上調(diào)機(jī)體的IL-1β以及NLRP3水平，促進(jìn)疾病進(jìn)展。

本研究通過對不同疾病嚴(yán)重程度以及不同疾病狀態(tài)患者的分析顯示，隨著UC患者病情加重，患者的Numb水平顯著下降，IL-1β以及NLRP3水平顯著上升。相關(guān)性分析顯示，患者的疾病嚴(yán)重程度以及疾病狀態(tài)分別與患者的Numb水平呈負(fù)相關(guān)，與IL-1β以及NLRP3水平呈正相關(guān)，提示隨著UC患者疾病嚴(yán)重程度加重，腸道正常菌群平衡被打破，局部炎性反應(yīng)以及血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷情況加重，患者腸上皮細(xì)胞的自我更新程序遭到嚴(yán)重破壞，新陳代謝水平失衡，導(dǎo)致Numb水平顯著下調(diào)，并且隨著患者腸道炎性反應(yīng)加劇，IL-1β以及NLRP3水平顯著升高。張梟[12]的研究結(jié)果表明，患者的NLRP3水平與巨噬細(xì)胞的超活化水平具有一定的相關(guān)性。

綜上所述，在UC疾病進(jìn)展中，通過下調(diào)Numb水平，破壞了患者的腸道屏障功能，導(dǎo)致IL-1β以及NLRP3水平上調(diào)，發(fā)生腸道炎性反應(yīng)，促進(jìn)疾病進(jìn)展，在今后的疾病預(yù)后分析以及早期診斷中可作為診斷依據(jù)。