姜巖世，張永祥，劉利平，貢秋卓瑪，王然，王鵬杰

（1.西藏高原之寶牦牛乳業(yè)股份有限公司，拉薩 610000；2.三河福成生物科技有限公司，廊坊 065201；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)營(yíng)養(yǎng)與健康系，北京 100083）

益生菌系指活的微生物，當(dāng)攝取足夠數(shù)量時(shí)，對(duì)宿主健康有益[1]。益生菌在機(jī)體健康和疾病防治中發(fā)揮重要作用，主要包括抵抗致病菌感染、預(yù)防和治療炎癥性腸病、緩解過(guò)敏反應(yīng)、抵抗癌癥等[2～4]，其益生作用主要是通過(guò)直接或者間接地調(diào)整宿主腸道微生物的組成，激活宿主內(nèi)源性微生物群或者免疫系統(tǒng)的活性來(lái)實(shí)現(xiàn)的[5]。

免疫調(diào)節(jié)活性是篩選和評(píng)價(jià)益生菌的重要標(biāo)準(zhǔn)[6]。評(píng)價(jià)益生菌對(duì)免疫的調(diào)節(jié)作用主要包括系統(tǒng)免疫和黏膜免疫[7]。系統(tǒng)免疫包括血清中細(xì)胞因子和免疫球蛋白的產(chǎn)生，血液淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞反應(yīng)以及脾淋巴細(xì)胞刺激等[8]，已被廣泛用于評(píng)價(jià)益生菌的免疫調(diào)節(jié)作用。益生菌調(diào)節(jié)免疫的能力具有菌株特異性。研究表明，植物乳桿菌CJLP133和CJLP243能夠增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)，而鼠李糖乳桿菌LGG、植物乳桿菌CJNR26和格氏乳桿菌CJMF3沒(méi)有表現(xiàn)此種效果[9]。

本研究以分離自西藏牦牛乳的副干酪乳桿菌YLZB為研究對(duì)象，評(píng)價(jià)其對(duì)系統(tǒng)免疫的調(diào)節(jié)作用，為開(kāi)發(fā)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的益生菌相關(guān)產(chǎn)品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌種：副干酪乳桿菌YLZB，中國(guó)微生物菌種保藏中心保藏，CGMCC No.12939。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物：Balb/C小鼠，雄性，體重18～22g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.1.3 試劑：小鼠IgG ELISA試劑盒、小鼠LYZ ELISA試劑盒，購(gòu)自美國(guó)GBD公司；NK細(xì)胞活性檢測(cè)WST-8試劑盒，購(gòu)自日本D0JINDO公司；Giemsa染料，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，IgG ELISA試劑盒，武漢優(yōu)爾生公司，其余試劑均為分析純。

1.2 試驗(yàn)設(shè)備

酶標(biāo)儀（Biotek, ELX808）；超凈工作臺(tái)（新加坡ESCO公司）；CP21GⅡ高速冷凍離心機(jī)（日立公司）；恒溫培養(yǎng)箱（37℃、43℃）；G560E漩渦混合器（美國(guó)SCIENTIFIC Instruments公司）；HV-110高壓滅菌鍋（日本Hirayama公司）；Sartorius pH計(jì)（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 試驗(yàn)動(dòng)物分組及處理

將8周齡Balb/C小鼠隨機(jī)分為4組：空白對(duì)照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組，每組8只。空白對(duì)照組小鼠每只灌胃0.2mL生理鹽水，低、中、高劑量組分別灌胃5×106、5×108和5×1010CFU/mL的副干酪乳桿菌YLZB 0.2mL，每日灌胃1次，連續(xù)30d，期間小鼠自由飲水和采食。

1.3.2 血清樣本制備

小鼠處死前摘取眼球取血，血液樣本在室溫下放置2h，隨后在4℃條件下1 000r/min離心10min，收集血清，-20℃保存待測(cè)。

1.3.3 脾淋巴細(xì)胞懸液制備

無(wú)菌去小鼠脾臟，置于200目金屬篩網(wǎng)上，將篩網(wǎng)浸沒(méi)在含有RPMI-1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中。用玻璃注射器內(nèi)芯輕輕研磨脾組織，使其通過(guò)篩網(wǎng)，得到單細(xì)胞懸液。向單細(xì)胞懸液中添加1mL無(wú)菌水，輕晃20s以裂解其中的紅細(xì)胞，加入2×Hank’s液，將出現(xiàn)的黃白色組織團(tuán)塊吸除，剩余細(xì)胞用RPMI-1640培養(yǎng)基洗滌兩次后重懸于RPMI-1640培養(yǎng)基中，即得到脾淋巴細(xì)胞懸液。

1.3.4 脾淋巴細(xì)胞增殖能力檢測(cè)

利用MTT試劑盒對(duì)淋巴細(xì)胞懸液進(jìn)行測(cè)定，在490nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光值。ConA（刀豆蛋白）孔的光密度值減去不加ConA孔的光密度值代表淋巴細(xì)胞的增殖能力。受試樣品吸光值差值顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），判定陽(yáng)性。

淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化值＝ConA刺激孔值-對(duì)照孔值

1.3.5 巨噬細(xì)胞吞噬能力測(cè)定

分離小鼠腹腔細(xì)胞液，將細(xì)胞液與1%雞紅細(xì)胞等體積混和，滴加至載玻片的封閉圈內(nèi)，37℃培養(yǎng)20min，結(jié)束后迅速用生理鹽水將未貼壁細(xì)胞和未被吞噬的雞紅細(xì)胞沖掉，加甲醇固定1min，姬姆薩原液染色15min，脫色液（甲醇20mL、蒸餾水80mL、2mol/L HCl 2滴）脫色，蒸餾水沖洗干凈，晾干。用40×顯微鏡計(jì)數(shù)，吞噬率為每100個(gè)巨噬細(xì)胞中吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞所占的百分比。

1.3.6 NK細(xì)胞殺傷活性

脾臟分離出的NK細(xì)胞與YAC-1淋巴瘤細(xì)胞各100μL共同培養(yǎng)，利用WST-8試劑盒檢測(cè)NK細(xì)胞活力。

受試樣品的NK細(xì)胞活力顯著高于對(duì)照（P＜0.05），判定陽(yáng)性。

1.3.7 血清IgG濃度測(cè)定

根據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)IgG濃度。

1.3.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用SPSS17.0對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 淋巴細(xì)胞增殖能力

T細(xì)胞是獲得性免疫中細(xì)胞免疫的重要效應(yīng)細(xì)胞，脾淋巴細(xì)胞中的T細(xì)胞在ConA的刺激下增殖，增殖程度反映T細(xì)胞的活性[10]。淋巴細(xì)胞增殖能力結(jié)果如圖1所示，以副干酪乳桿菌YLZB灌胃小鼠30d后，中、高兩個(gè)劑量組小鼠的淋巴細(xì)胞增殖能力顯著高于對(duì)照組，并呈劑量依賴(lài)性，表明副干酪乳桿菌YLZB可以顯著促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞增殖。

圖1 淋巴細(xì)胞增殖能力

2.2 巨噬細(xì)胞吞噬能力

巨噬細(xì)胞是先天免疫的重要效應(yīng)細(xì)胞。當(dāng)病原入侵時(shí)，機(jī)體做出早期的防御反應(yīng)，通過(guò)計(jì)數(shù)巨噬細(xì)胞對(duì)雞紅細(xì)胞的吞噬率，可判斷巨噬細(xì)胞的吞噬能力，反映機(jī)體非特異性免疫功能的強(qiáng)弱[11,12]。巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的能力如圖2所示，以副干酪乳桿菌YLZB灌胃小鼠30d后，中、高兩個(gè)劑量組小鼠的巨噬細(xì)胞吞噬能力顯著高于對(duì)照組，并呈劑量依賴(lài)性，表明副干酪乳桿菌YLZB可以顯著刺激小鼠的巨噬細(xì)胞吞噬活性。

圖2 巨噬細(xì)胞吞噬能力

2.3 NK細(xì)胞殺傷能力

NK細(xì)胞是一種細(xì)胞毒淋巴細(xì)胞，能夠識(shí)別和控制多種病原菌，在免疫自穩(wěn)和免疫監(jiān)視方面起突出作用[13]。NK細(xì)胞殺傷能力如圖3所示，以副干酪乳桿菌YLZB灌胃小鼠30d后，低、中、高三個(gè)劑量組小鼠的NK細(xì)胞殺傷率能力顯著高于對(duì)照組，并呈劑量依賴(lài)性，表明副干酪乳桿菌YLZB可以顯著提高NK細(xì)胞的活性，從而提高機(jī)體抵御感染的能力。

圖3 NK細(xì)胞殺傷能力

2.4 血清IgG濃度

血清IgG是在抗原提呈細(xì)胞識(shí)別抗原后，B細(xì)胞被活化并分化成抗體分泌型漿細(xì)胞時(shí)產(chǎn)生的，可用于反映菌株對(duì)機(jī)體體液免疫的影響[14,15]。小鼠血清IgG濃度如圖4所示，隨著副干酪乳桿菌YLZB劑量升高，血清IgG濃度相應(yīng)增加，并呈劑量依賴(lài)性，表明副干酪乳桿菌YLZB能夠增加小鼠IgG含量，從而提高機(jī)體抵抗感染的能力。

圖4 血清IgG濃度

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以Balb/C小鼠為動(dòng)物模型，對(duì)副干酪乳桿菌YLZB的免疫調(diào)節(jié)作用進(jìn)行了評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，以副干酪乳桿菌YLZB灌胃小鼠30d后，可以有效促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖，提高吞噬細(xì)胞和NK細(xì)胞活力，增加血清IgG濃度，并呈劑量依賴(lài)效應(yīng)，表明副干酪乳桿菌YLZB菌具有調(diào)節(jié)小鼠免疫力的作用。