陳懷生，劉雪燕*，郭曉靜，洪澄英，李威，曹靜

1南方科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院/暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院/深圳市人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，廣東深圳 518020；2南方科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院/暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院/深圳市人民醫(yī)院病理科，廣東深圳 518020

膿毒癥是嚴(yán)重感染導(dǎo)致的致命性多臟器功能障礙綜合征[1]，病死率可達(dá)20%～30%[2]。大約60%的膿毒癥患者伴有心功能不全[3-5]，這類患者的病死率更高[4]。革蘭陰性桿菌感染是引起膿毒癥的主要原因。內(nèi)毒素即脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，是革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的成分，在膿毒癥、多臟器衰竭(multiple organ failure，MOF)的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用[6]。LPS通過與白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)2、4結(jié)合，調(diào)節(jié)TLR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，影響患者的免疫功能，從而引起全身炎癥反應(yīng)綜合征[7]。研究發(fā)現(xiàn)，心肌細(xì)胞表面可能表達(dá)LPS受體，或促進(jìn)TLR受體生成，通過損傷相關(guān)分子模式(damage associated molecular patterns，DAMP)誘導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，最終影響心肌細(xì)胞線粒體[5]和肌質(zhì)網(wǎng)功能，導(dǎo)致心功能不全。本研究擬通過觀察內(nèi)毒素致大鼠心肌肌質(zhì)網(wǎng)相關(guān)酶學(xué)改變情況，評(píng)價(jià)內(nèi)毒素對(duì)大鼠心肌肌質(zhì)網(wǎng)功能的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與設(shè)備 脂多糖(LPS fromEscherichia coliD55:B5)購自美國Sigma公司。無創(chuàng)心率計(jì)、血壓計(jì)購自上海宇揚(yáng)儀器公司；透射電子顯微鏡(Philips EM208s)購自荷蘭Philips公司。

1.2 膿毒癥大鼠模型的建立與分組 健康成年雄性SD大鼠10只，體重180～220 g，由華大基因公司提供。隨機(jī)分為空白對(duì)照組與內(nèi)毒素注射組，每組5只。內(nèi)毒素注射組從大鼠尾靜脈注射脂多糖(1 mg/ml，以生理鹽水為溶劑，按0.7 mg/kg給藥)，1次/d，連續(xù)2 d，建立膿毒癥大鼠模型；空白對(duì)照組不做處理。本實(shí)驗(yàn)過程符合國家和單位有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用的規(guī)定。

1.3 大鼠血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)監(jiān)測 每日于實(shí)驗(yàn)大鼠尾靜脈注射脂多糖2 h后，采用無創(chuàng)心率計(jì)和血壓計(jì)記錄兩組大鼠的心率(次/min)、平均動(dòng)脈血壓(mean atrial pressure，MAP，mmHg)。

1.4 大鼠心肌組織及細(xì)胞病理形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià) 第二次給予脂多糖4 h后，腹腔注射10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)處死動(dòng)物。取部分心肌組織，采用多聚甲醛固定，石蠟包埋、切片，HE染色后光鏡下觀察其病理結(jié)構(gòu)變化。另取部分心肌組織，經(jīng)戊二醛-多聚甲醛和鋨酸-亞鐵氰化鉀固定，乙醇、丙酮依次脫水，用乙氧基樹脂浸透包埋，然后制備電鏡切片，切片經(jīng)醋酸鈾、檸檬酸鉛染色，在透射電子顯微鏡下觀察心肌線粒體超微結(jié)構(gòu)。

1.5 大鼠心室肌細(xì)胞肌質(zhì)網(wǎng)鈣調(diào)節(jié)蛋白mRNA水平檢測 提取大鼠心室肌總RNA，以GAPDH為內(nèi)參，采用反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)定量PCR(reverse transcription-qPCR，RT-qPCR)檢測肌質(zhì)網(wǎng)肌鈣集蛋白(calsequestrin，CASQ1)、鈉-鈣交換體(Na+-Ca2+exchanger， NCX)、蘭尼堿受體2型(ryanodine receptor，RyR2)、鈣調(diào)蛋白磷酸酶1(protein phosphatase type 1α，ppplCa)、肌質(zhì)網(wǎng)Ca2+-ATP酶(sarcoplasmic reticulum Ca2+ATPase，SERCA2)、受磷蛋白(phospholamban，PLN)、ADP/ATP移位酶(mitochondrial carrier，adenine nucleotide translocator 25，member 4，slc25a4)的mRNA表達(dá)水平。引物序列見表1。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性10 s；94 ℃5 s，60 ℃ 35 s，40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量。

表1 大鼠心肌肌質(zhì)網(wǎng)鈣調(diào)節(jié)蛋白的引物序列Tab.1 The primer sequences of myocardial sarcoplasmic reticulum Ca2+ handling proteins in rats

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)變化 注射首日及次日內(nèi)毒素注射組大鼠的心率與空白對(duì)照組比較均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。內(nèi)毒素注射組大鼠注射首日MAP與空白對(duì)照組比較明顯降低(P<0.05)；注射次日兩組MAP差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖1)。

2.2 大鼠心肌組織病理形態(tài)學(xué)改變 空白對(duì)照組大鼠心肌組織致密，未見明顯血管擴(kuò)張，細(xì)胞排列整齊；電子顯微鏡下肌纖維排列有序，線粒體、肌質(zhì)網(wǎng)規(guī)則可見。內(nèi)毒素注射組大鼠心肌細(xì)胞排列疏松，細(xì)胞間可見炎性細(xì)胞浸潤；電鏡下心肌肌纖維斷裂，心肌細(xì)胞線粒體、肌質(zhì)網(wǎng)形態(tài)辨認(rèn)困難(圖2)。

圖1 內(nèi)毒素對(duì)大鼠心率及MAP的影響Fig.1 Effects of lipopolysaccharide on heart rate and mean arterial pressure of rats

圖2 內(nèi)毒素致大鼠心肌組織病理形態(tài)學(xué)的改變Fig.2 Changes of myocardial histopathology induced by lipopolysaccharide in rats

2.3 大鼠心室肌細(xì)胞肌質(zhì)網(wǎng)鈣調(diào)節(jié)蛋白mRNA表達(dá)情況 RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，注射脂多糖后，大鼠心室肌CASQ1、NCX、ppplCa、PLN、SERCA2 mRNA表達(dá)水平與空白對(duì)照組比較均明顯增加(P<0.05)，而兩組RyR2、slc25a4 mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，圖3)。

圖3 大鼠心室肌細(xì)胞肌質(zhì)網(wǎng)鈣調(diào)節(jié)蛋白mRNA表達(dá)情況Fig.3 mRNA levels of sarcoplasmic reticulum Ca2+ handling proteins in ventricular myocytes of rats

3 討 論

隨著心臟超聲在ICU的廣泛應(yīng)用，膿毒癥合并心功能不全更容易被發(fā)現(xiàn)[8]。超聲顯示，嚴(yán)重膿毒癥患者常合并以左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejective factor，LVEF)下降、心室擴(kuò)張為特征的心室功能減退[9]。鑒于引起膿毒癥的主要原因是革蘭陰性菌感染，本研究通過靜脈注射脂多糖建立膿毒癥大鼠模型，發(fā)現(xiàn)膿毒癥大鼠心率明顯增快，MAP降低；并可見較明顯的心肌損傷，其心肌細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞間出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤，電子顯微鏡下可見明顯的肌纖維斷裂，線粒體結(jié)構(gòu)受到不同程度的破壞。RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，膿毒癥大鼠出現(xiàn)心肌細(xì)胞肌質(zhì)網(wǎng)酶學(xué)異常變化，CASQ1、NCX、ppplCa、PLN、SERCA2等酶的mRNA水平較空白對(duì)照組升高。由此可見，膿毒癥心肌病的機(jī)制較為復(fù)雜，結(jié)合以往研究總結(jié)如下。

首先，內(nèi)毒素和炎性因子直接損傷膿毒癥機(jī)體心肌細(xì)胞。LPS可直接作用于心肌細(xì)胞LPS受體，通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用影響心肌收縮力；還可促進(jìn)心肌細(xì)胞TLR的表達(dá)[10]。LPS誘導(dǎo)的TLR以TLR4為主，可導(dǎo)致心肌細(xì)胞IL-1β和TNF-α mRNA表達(dá)上調(diào)[11]，血清IL-1β、TNF-α濃度增加，繼而引起心肌線粒體功能障礙。心肌TLR4表達(dá)缺乏的動(dòng)物對(duì)LPS反應(yīng)減弱，導(dǎo)致LPS對(duì)心肌功能影響較小[12]；敲除TLR4基因的大鼠注射LPS后，可觀察到心臟功能障礙弱于野生型[11]。另外，TNF-α可能與心肌細(xì)胞膜的特異性受體結(jié)合，促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放過多鈣離子，使心肌線粒體鈣離子內(nèi)流增加[13-14]、積聚、超負(fù)荷，導(dǎo)致線粒體腫脹、破壞。TNF-α還可啟動(dòng)心肌線粒體凋亡信號(hào)通路，使線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔呈高通透狀態(tài)，H+內(nèi)流，導(dǎo)致線粒體膜電位缺失，線粒體腫脹、破裂。

膿毒癥患者常出現(xiàn)心肌舒張功能障礙。正常狀態(tài)下心肌舒張時(shí)，心肌細(xì)胞通過SERCA2攝取胞質(zhì)內(nèi)的鈣離子進(jìn)入肌質(zhì)網(wǎng)，PLN磷酸化可促進(jìn)SERCA2對(duì)鈣離子的攝取。在這個(gè)過程中，2磷蛋白(2 phosphoproteins)、蛋白磷酸酶1抑制物(inhibitor-1 of protein phosphatise 1)和小熱休克蛋白20(small heat shock protein 20)也可發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[15]。膿毒癥狀態(tài)下，SERCA2a可出現(xiàn)代償性的活化增強(qiáng)，這種異常活化導(dǎo)致膿毒癥動(dòng)物的心臟舒張功能障礙[16]，某些PLN磷酸化階段的類似物則能夠影響SERCA功能[17]。

其次，細(xì)菌毒素和細(xì)胞因子對(duì)心功能具有間接抑制作用。膿毒癥患者TNF-α增高與心肌收縮和舒張功能障礙呈正相關(guān)，這一作用與TNF-α誘導(dǎo)一氧化氮合酶(nitric oxide synthetase，NOS)表達(dá)增加，導(dǎo)致心肌細(xì)胞NO濃度增高有關(guān)[18]。膿毒癥時(shí)這些細(xì)胞因子介導(dǎo)NOS類似物表達(dá)異常增加，進(jìn)而催化L-精氨酸合成增多，導(dǎo)致心肌細(xì)胞NO合成增多并失調(diào)[19]。NO對(duì)心肌細(xì)胞相關(guān)基因具有毒性效應(yīng)，可升高環(huán)磷酸鳥苷的水平，引起Ca2+內(nèi)流減少，抑制了心肌收縮功能[20]；同時(shí)可導(dǎo)致線粒體復(fù)合體Ⅰ和復(fù)合體Ⅱ受抑，影響線粒體的呼吸功能和能量代謝，直接損傷心肌細(xì)胞[21]；NO還可導(dǎo)致血管過度擴(kuò)張，其引起的低血壓加劇了心肌的低灌注。

再者，氧化應(yīng)激反應(yīng)在膿毒癥心肌抑制中扮演著重要角色。由于炎癥介質(zhì)和炎癥因子的介導(dǎo)，氧自由基(oxygen free radical，OFR)產(chǎn)生增多。OFR包括超氧陰離子自由基(>)和羥自由基(.OH)，在心肌組織超氧化物歧化酶的作用下，生成過氧化氫，后者可被過氧化氫酶或谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)滅活。膿毒癥時(shí)由于滅活機(jī)制異常，活性氧大量產(chǎn)生、積聚，清除困難，表現(xiàn)為丙二醛(malondialdehyde，MDA)增高、超氧化物岐化酶(superoxide dismutase，SOD)降低，從而影響心肌線粒體ATP的產(chǎn)生，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生致命的能量衰竭[22]。

最后，膿毒癥可導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡。發(fā)生膿毒癥時(shí)，TNF可通過內(nèi)、外源性途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，內(nèi)源性途徑主要由caspase-8介導(dǎo)，外源性途徑則由caspase-9介導(dǎo)，兩個(gè)途徑共同活化凋亡酶caspase-3及caspase瀑布，導(dǎo)致心肌細(xì)胞及其他細(xì)胞的凋亡[23]。

綜上所述，內(nèi)毒素可能通過多種機(jī)制，尤其是引起肌質(zhì)網(wǎng)鈣調(diào)節(jié)蛋白相關(guān)酶SERCA2a、CASQ1、NCX、ppplCa、PLN等的過度活化，導(dǎo)致肌質(zhì)網(wǎng)鈣調(diào)節(jié)異常，從而抑制心肌細(xì)胞舒張功能，最終收縮功能也受到影響。