外向鉀通道在納米SiO2致肺泡巨噬細胞損傷中的作用

趙 婧

山西醫(yī)科大學汾陽學院統(tǒng)計教研室，山西省汾陽市 032200

一項首次在全球范圍內(nèi)系統(tǒng)評估顆粒物空氣污染對居民健康的報告指出，環(huán)境顆粒物(Particulate matters,PM)的短期暴露與每日呼吸系統(tǒng)死亡率之間存在獨立相關性[1]。納米顆粒(Nano-sized particles,NSPs)在PM尤其 PM2.5中數(shù)量比重最大。隨著納米SiO2應用的不斷發(fā)展，預計未來對其安全、健康和風險評估研究的需求會更大[2-3]。目前關于納米顆粒物毒性效應的研究較多，炎癥似乎是顆粒物所致健康效應一個共同的病理生理過程[4-6]，但炎性反應機制依然不清楚。研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)粉塵或脂多糖激活的巨噬細胞，通過阻斷劑阻斷其K+通道可以減少其TNF-α和IL-6的釋放[7-8]，說明K+通道可能與炎性介質的釋放相關，可能是炎性反應的關鍵信號。在納米SiO2致肺損傷過程中，K+通道是否也有相似的作用？本研究通過加入K+通道阻斷劑，研究電壓依賴性外向鉀通道(voltage-dependent Potassium channel，Kv)在納米SiO2致NR8383細胞損傷中的調(diào)控作用，加深對納米顆粒致肺損傷機制的認識。

1 材料與方法

1.1 材料 NR8383細胞株購自上海研究所細胞中心；納米SiO2[粒徑(15±5)nm，純度>99%]購自杭州萬景新材料公司；K+通道阻斷劑：氯化四乙胺(TEA)和4-氨基吡啶(4-AP)均購自Sigma公司；Ham’sF-12購自美國sigma aldrich；胎牛血清購自美國Hyclone；細胞計數(shù)(Cell Counting Kit-8，CCK-8)試劑盒購自日本Dojindo；LDH試劑盒購自南京建成，TNF-α Elisa 試劑盒和IL-6 Elisa試劑盒均購自北京達科為。

1.2 實驗方法

1.2.1 納米SiO2懸液和K+通道阻斷劑的配制：用三蒸水配制2mg/ml納米SiO2母液，高壓滅菌，4℃保存?zhèn)溆?，使用前紫外照?0min，超聲15min，然后用培養(yǎng)液稀釋納米SiO2母液。無菌條件下，用三蒸水配制200mmol/L的TEA母液和50mmol/L的4-AP母液，使用前用培養(yǎng)液稀釋TEA和4-AP母液。

1.2.2 細胞培養(yǎng)及分組：細胞在含有2mmol/L谷氨酰胺和20%胎牛血清的Ham’sF-12培養(yǎng)基中，在37℃含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基每周更換2次，細胞每周傳代1次。將對數(shù)生長期細胞稀釋至5×105個/ml，然后接種于9孔培養(yǎng)板或24孔培養(yǎng)板，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)過夜。24h后按以下分組處理細胞：陰性對照組(添加培養(yǎng)液，沒有添加納米SiO2或阻斷劑)、陽性對照組(添加20μg/ml的納米SiO2)、納米SiO2組(添加5、10、20μg/ml納米SiO2)、阻斷劑組(添加20μg/ml納米SiO2+2.5、5.0、10.0、20.0mmol/L的TEA或添加20μg/ml納米SiO2+0.625、1.25、2.5、5mmol/L的4-AP)。

1.2.3 CCK-8試劑盒/Elisa試劑盒檢測：按上述分組方法處理24h后，取出96孔培養(yǎng)板，按照CCK-8試劑盒說明書測定細胞存活率；取出24孔培養(yǎng)板，離心5min(1 000r/min)，收集培養(yǎng)液上清，按照Elisa試劑盒說明書測定LDH活力、TNF-α和IL-6的釋放量。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0軟件進行方差分析(Dunnett-t檢驗)進行多重比較。P<0.05時差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 納米SiO2致細胞毒性效應 如表1所示，細胞存活率、LDH活力、TNF-α和IL-6的釋放量呈濃度依賴性變化(P<0.05)。與陰性對照組相比，10μg/ml和20μg/ml納米SiO2組細胞存活率降低(P<0.05)，LDH活性、TNF-α釋放量升高(P<0.05)，而所有納米SiO2組IL-6的釋放量均升高(P<0.05)。

表1 納米SiO2 致細胞毒性效應

2.2 TEA、4-AP對納米SiO2致細胞毒性效應的影響 如表2所示，與陽性對照組相比，阻斷劑組(TEA或4-AP)細胞存活率升高(P<0.05)，但高濃度阻斷劑組細胞存活率降低(P<0.05)；與陽性對照組相比，阻斷劑組LDH活力降低(P<0.05)，但高濃度阻斷劑組LDH活力升高(P<0.05)；與陽性對照組相比，當TEA濃度≥10mmol/L，TNF-α釋放量降低(P<0.05)，而所有4-AP組TNF-α釋放量均降低(P<0.05)；與陽性對照組相比，兩種阻斷劑所有濃度組IL-6釋放量均降低(P<0.05)。

表2 TEA、4-AP對納米SiO2 所致細胞毒性效應的影響

2.3 TEA、4-AP對納米SiO2致細胞毒性效應的標化比較 如表3所示，TEA和4-AP組細胞存活率最大標化比值分別是：121.7%、136.4%，TEA和4-AP組LDH活力最小標化比值分別是55.8%、21.6%，TEA和4-AP組TNF-α釋放量最小標化比值分別是46.1%、5.9%，TEA、4-AP組IL-6釋放量最小標化比值分別是5.5%、1.9%。

表3 TEA、4-AP對毒性效應指標影響的標化比較

3 討論

本研究利用兩種K+通道阻斷劑TEA、4-AP研究Kv通道在納米SiO2顆粒致NR8383細胞損傷中的作用，之所以選擇TEA和4-AP這兩種阻斷劑，是因為4-AP對Kv通道具有特異阻斷作用，TEA雖然對不同亞型K+通道都有阻斷作用，但是對外向K+通道作用僅限于胞內(nèi)抑制[9]。本次研究表明，納米SiO2導致細胞存活率降低，LDH活力和炎性介質升高，與孫悅等人[10]的結論一致。但是阻斷劑的加入使得納米SiO2顆粒所致上述毒性效應均有所減弱，且4-AP的抑制作用更大。

加入兩種阻斷劑后，細胞存活率上升，但高劑量組細胞存活率又降低，說明阻斷劑濃度過高對細胞的保護作用降低甚至產(chǎn)生毒副作用，為下一步實驗設置最佳阻斷劑濃度提供依據(jù)。LDH是一種穩(wěn)定的胞質酶，存在于所有細胞中,當細胞膜受損時，LDH被迅速釋放到細胞培養(yǎng)上清液中，這是細胞凋亡、壞死和其他形式細胞損傷的一個關鍵特征，因此測量受損細胞釋放的LDH活力是測定細胞毒性的一種常用方法[11]。研究結果表明，阻斷劑的加入使得LDH活力先降低后升高，說明阻斷K+通道可以減弱納米SiO2對細胞的膜損傷，但是濃度過高時，反而會破壞細胞膜。TNF-α是在早期炎癥反應過程中出現(xiàn)的炎性介質，能刺激靶細胞合成和分泌其他炎性介質；IL-6能促進T、B細胞增殖分化，是炎性反應的促發(fā)劑，加劇炎癥介質的產(chǎn)生，因此TNF-α和IL-6是評價細胞早期炎性反應的敏感指標[12]。阻斷劑阻斷K+通道后，由納米SiO2誘導的TNF-α和IL-6釋放量降低，說明K+通道可以減弱炎癥反應。標化結果顯示，TEA對各項指標有較小但是明顯的影響，考慮其原因可能是TEA通過阻斷其他類型的K+離子通道發(fā)揮作用，而4-AP對各項指標的影響更大，表明Kv通道在納米SiO2致細胞損傷過程中的保護作用更大，提示Kv通道與細胞生理功能的聯(lián)系更緊密一些。

顆粒物進入肺部以后引發(fā)長期持續(xù)的炎性反應是導致肺纖維化或肺癌的主要原因[13]，炎性反應由炎性體所介導，然而目前關于炎性體激活的具體途徑依然存在爭議，但可以確定的是肺泡巨噬細胞炎性體識別入侵的顆粒物并啟動相應的炎性反應，且細胞K+外流是炎性體激活的一個前提因素[14]。本研究結果表明，Kv通道可以調(diào)控巨噬細胞產(chǎn)生細胞因子，但是Kv通道如何具體調(diào)節(jié)細胞分泌細胞因子，是否經(jīng)激活炎性體或其某個組分，哪一種亞型K+通道起主要作用，仍然不清楚，還需要進一步研究。