景宏舒 彭媛 王振宇 李偉建 袁天杰 張洪丹 鄢和新 翟博

肝臟組織工程，是一個(gè)跨學(xué)科的綜合領(lǐng)域，涉及工程學(xué)、物理科學(xué)和生命科學(xué)等學(xué)科，旨在體外構(gòu)建出有功能的肝臟[1]。肝臟細(xì)胞、支架材料以及細(xì)胞生長(zhǎng)因子并稱為肝臟組織工程的三大基本組成要素[2]。組織脫細(xì)胞技術(shù)是運(yùn)用物理和化學(xué)方法，最大限度去除細(xì)胞成分，降低免疫原性，更好地保留細(xì)胞外基質(zhì)成分的一項(xiàng)工程技術(shù)[3,4]。

材料與方法

一、材料與試劑

C57BL/6雄性小鼠購自上海南方模式生物科技有限公司。新鮮臍帶取自上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院婦產(chǎn)科孕產(chǎn)婦，血清病毒指標(biāo)陰性，已簽署相關(guān)知情同意書。

TEM基于HepX Basal，補(bǔ)充成分N2和B27購自源培生物科技股份有限公司，F(xiàn)BS購自以色列BI公司，HGF、EGF、FGF 、A83-01、CHIR-99021和Y-27632均購自美國(guó)TargetMol公司，1% 丙酮酸鈉溶液、Nac、Vc均購自上海陶速生物科技有限公司。KCI、SDS、TritonX-100、三溴乙醇粉末、EGTA粉末、BSA粉末均購自美國(guó)Sigma-Aldrich公司，Percoll溶液購自上海索寶生物科技有限公司，Ⅳ型膠原酶購自美國(guó)worthington公司。細(xì)胞膜紅色熒光探針購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

二、實(shí)驗(yàn)方法

(一)臍帶脫細(xì)胞工藝處理 新鮮臍帶組織置于無菌TissueMateTM組織運(yùn)輸液內(nèi)，冰上保存并運(yùn)輸。取出臍帶，用無菌PBS溶液洗凈血污。切成長(zhǎng)度3 cm的小段，沿長(zhǎng)軸剖開，小心剔除2根臍動(dòng)脈和1根臍靜脈。依次浸沒在10 mM TBS低滲溶液、含1 M KCl和1 %(v/v)TritonX-100高滲溶液、0.03 %(w/v)SDS溶液、50 mM TBS等滲溶液內(nèi)，每個(gè)處理階段需震蕩作用12～24 h，最后用純化水反復(fù)沖洗，冷凍干燥24 h后制備臍帶脫細(xì)胞支架材料，25kGy低溫輻照滅菌，4 ℃長(zhǎng)期保存。

(二)小鼠原代肝細(xì)胞分離 麻醉雄性C57BL/6小鼠，400 mg/kg劑量腹腔注射2 %三溴乙醇溶液(阿拉丁)，開腹充分暴露肝臟。將留置針從門靜脈遠(yuǎn)心端穿刺，向肝臟方向依次灌注使用0.02% EGTA溶液和0.02% Ⅳ型膠原酶灌注液，肉眼觀察肝臟逐漸變軟時(shí)，停止灌注。剪下肝臟，放在內(nèi)盛TEM的培養(yǎng)皿內(nèi)，用1 mL注射器推桿鈍性碾磨肝臟，直至觀察無明顯塊狀組織，制得細(xì)胞懸液。用70 μm濾網(wǎng)濾棄組織碎片，低速離心，用等體積Percoll溶液純化得到小鼠原代肝細(xì)胞。

(三)肝前體樣細(xì)胞2D培養(yǎng)和標(biāo)記 分離得到的原代肝細(xì)胞，用轉(zhuǎn)化與擴(kuò)增培養(yǎng)基(Transition and Expansion Media, TEM)接種均勻培養(yǎng)。培養(yǎng)兩周后，在TEM培養(yǎng)體系下，添加0.2 μM DiL共孵育20 min，在熒光倒置顯微鏡(Nicon)下觀察小鼠肝前體樣細(xì)胞(Rodent hepatocyte-derived liver progenitor-like cells, rHepLPCs)的標(biāo)記情況。

(四)核酸、羥脯氨酸和糖胺聚糖定量分析 稱取冷凍干燥處理過的臍帶組織和臍帶脫細(xì)胞材料，使用DNA抽提試劑盒(QIAamp)、羥脯氨酸定量試劑盒(酸化法)和BlyscanTM 硫酸化糖胺聚糖定量試劑盒(Biocolar)，根據(jù)公式計(jì)算各個(gè)樣品內(nèi)各成分含量。

(五)石蠟包埋切片和化學(xué)染色 10%甲醛固定，不同濃度酒精脫水(75%、95%和100%)，二甲苯脫蠟，用熔化石蠟包埋樣品。用輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)切片、制片并烘干，常溫保存。Masson染色和HE染色選用相應(yīng)試劑盒并拍攝圖片。

(六)肝前體樣細(xì)胞3D培養(yǎng)和細(xì)胞增殖情況 制備rHepLPC細(xì)胞懸液，密度在5×107/mL，50 μL體積量接種在支架材料的華通膠面上，30 rpm水平搖晃培養(yǎng)，構(gòu)建三維支架上培養(yǎng)rHepLPCs復(fù)合體(3D-rHepLPCs)。使用alamarBlueTM細(xì)胞活力檢測(cè)試劑(Invitrogen)檢測(cè)細(xì)胞活性，酶標(biāo)儀讀取吸光度值定量分析細(xì)胞增殖情況，對(duì)照組為2D培養(yǎng)的rHepLPCs。

(七)熒光定量PCR 使用Trizol試劑裂解支架上的細(xì)胞，三氯甲烷和異丙醇提取總RNA，使用GoScript?反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega)合成cDNA，使用7300 plus實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(Life Technologies)和SYBR Green qPCR Mix(2X，High ROX)(碧云天生物科技有限公司)，以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行內(nèi)部控制計(jì)算相關(guān)基因的表達(dá)量，使用△△Ct方法分析基因轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)，引物由上海華津生物科技有限公司合成，引物序列選自PrimerBank數(shù)據(jù)庫。

(八)氨清除和尿素合成 換過新鮮培養(yǎng)基后，向TEM培養(yǎng)基中加入3 mM NH4CI，與細(xì)胞共同孵育24小時(shí)，氨成分(快速)試劑盒(Megazyme)檢測(cè)氨清除量，QuantiChromTM尿素測(cè)定試劑盒(BioAssay Systems)檢測(cè)尿素含量。

(九)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 通過GraphPad Prism 7軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用student’st檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、臍帶脫細(xì)胞材料的外觀和內(nèi)部結(jié)構(gòu)

將新鮮臍帶組織置于低-高滲透壓環(huán)境破壞細(xì)胞，使用TritonX-100和SDS有效去除殘留的細(xì)胞碎片，經(jīng)過冷凍干燥，增加材料內(nèi)部貫通程度，低溫輻照滅菌，制備臍帶脫細(xì)胞支架材料。H&E染色示材料孔隙增大，細(xì)胞核有效去除，而Masson染色示材料仍保留較多膠原成分，見圖1。

二、材料的核酸殘留量和細(xì)胞外基質(zhì)含量情況

經(jīng)定量分析，脫細(xì)胞處理前的臍帶組織核酸含量為(629.87±22.30)ng/mg (干重)，而臍帶脫細(xì)胞支架材料僅保留(60.20±1.42)ng/mg (干重)核酸含量，核酸去除率達(dá)到90.5 %以上，有統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異，P=0.0023；脫細(xì)胞處理前的臍帶組織羥脯氨酸含量為(4.97±1.41)μg/mg(干重)，臍帶脫細(xì)胞支架材料仍能保留(2.74±0.49)μg/mg(干重)羥脯氨酸含量，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.101 0)；脫細(xì)胞處理前的臍帶組織有(8.82±0.18)μg/mg(干重)糖胺聚糖含量，脫細(xì)胞處理后的支架材料含量為6.80±0.23)μg/mg(干重糖胺聚糖含量，有統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異(P=0.030 6)。脫細(xì)胞工藝去除核酸效果明顯，對(duì)羥脯氨酸和糖胺聚糖等成分含量影響較小。

三、rHepLPCs在臍帶脫細(xì)胞支架上的分布和增殖情況

新鮮分離的小鼠原代肝細(xì)胞胞質(zhì)大核深染，呈多邊形，形態(tài)不均一。在TEM體外培養(yǎng)14 d，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，呈魚梭形，核質(zhì)比增大，形態(tài)均一。用Dil標(biāo)記過的肝細(xì)胞在熒光顯微鏡鏡下分布均勻，易于定位追蹤。在TEM和三維培養(yǎng)下rHepLPCs(rHepLPCs-3D)，細(xì)胞培養(yǎng)情況見圖2。細(xì)胞增殖方面，第一天時(shí)支架上培養(yǎng)rHepLPCs細(xì)胞稍慢于平面培養(yǎng)，而培養(yǎng)14 d，細(xì)胞數(shù)量十分接近平面擴(kuò)增量，見表1。

表1 不同天數(shù)支架材料上培養(yǎng)肝前體樣細(xì)胞的吸光度值(±s)

四、rHepLPCs在臍帶脫細(xì)胞支架上的功能基因表達(dá)和氨代謝情況

QPCR分析小鼠原代肝細(xì)胞、2D培養(yǎng)下rHepLPCs和rHepLPCs-3D功能基因表達(dá)情況，見表2。TEM作用下原代肝細(xì)胞向肝前體樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中，肝細(xì)胞標(biāo)志物HNF4α表達(dá)明顯下降，膽管細(xì)胞標(biāo)志物CK19表達(dá)明顯升高，提示肝前體細(xì)胞在體外高效擴(kuò)增中部分丟失肝細(xì)胞功能，血漿蛋白Alb、氨代謝關(guān)鍵酶CPS和糖異生關(guān)鍵酶G6PC相應(yīng)地表達(dá)下調(diào)。在臍帶脫細(xì)胞支架上培養(yǎng)第7天和第14天，肝細(xì)胞功能基因表達(dá)部分恢復(fù)上調(diào)，膽管細(xì)胞標(biāo)志物明顯下調(diào)。

A：剖宮產(chǎn)婦臍帶；B：新鮮臍帶Masson染色；C：新鮮臍帶H&E染色；D：臍帶脫細(xì)胞支架材料；E：支架材料Masson染色；F：支架材料H&E染色，×40

A：原代肝細(xì)胞貼壁4 h；B：肝前體樣細(xì)胞2D培養(yǎng)下14 h；C：標(biāo)記過Dil的rHepLPCs；D：支架培養(yǎng)rHepLPCs第1天；E：支架培養(yǎng)rHepLPCs第7天；F：支架培養(yǎng)rHepLPCs第14天，×40

表2 2D和3D培養(yǎng)下肝前體樣細(xì)胞功能基因比較(±s)

氨代謝能力是肝細(xì)胞解毒功能的重要內(nèi)容，表現(xiàn)為氨解毒和尿素合成的兩個(gè)過程。2D培養(yǎng)下的rHepLPCs，氨清除量為(5.7±0.9)mg/(dL·106細(xì)胞·d)，而尿素含量為(7.1±2.5)mg/(dL·106細(xì)胞·d)，3D支架培養(yǎng)的rHepLPCs在培養(yǎng)1周時(shí)氨清除和尿素量達(dá)到2D培養(yǎng)的3倍水平，在培養(yǎng)2周時(shí)氨清除和尿素量達(dá)到2D培養(yǎng)的3倍水平近6倍，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05，見表3。

表3 2D和3D培養(yǎng)下肝前體樣細(xì)胞氨代謝能力比較[mg/( dL·106細(xì)胞·d)]

討 論

組織工程化肝臟的核心要素是細(xì)胞，原代肝細(xì)胞是最理想的種子細(xì)胞[5,6]。細(xì)胞支架材料的選擇，對(duì)3D培養(yǎng)體系下細(xì)胞功能提升和長(zhǎng)期存活至關(guān)重要。使用化學(xué)小分子調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)逆轉(zhuǎn)肝細(xì)胞命運(yùn)，實(shí)現(xiàn)肝前體樣細(xì)胞在體外高效擴(kuò)增和進(jìn)一步分化成熟，解決了肝細(xì)胞在體外不能長(zhǎng)期擴(kuò)增的難題[7,8]。rHepLPCs在臍帶脫細(xì)胞支架上培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)了肝細(xì)胞功能部分恢復(fù)，尤其在氨代謝方面表現(xiàn)突出。

臍帶組織(Umbilical Cord, UC)，屬于黏液結(jié)締組織，包含兩條動(dòng)脈和一條靜脈，周圍包繞著華通膠成分(Wharton’s jelly matrix, DWJM)。華通膠富含膠原(Collagen)、糖胺聚糖(Glycosaminoglycan, GAGs)和多種生長(zhǎng)因子[9]。此外，無血管滋養(yǎng)管、神經(jīng)、淋巴等結(jié)構(gòu)，使剝離臍帶血管、保留華通膠結(jié)構(gòu)成為可能[10]。從材料來源講，臍帶脫細(xì)胞支架作具有臨床上易獲得，醫(yī)學(xué)倫理爭(zhēng)議小等特點(diǎn)。

有多家國(guó)內(nèi)外研究團(tuán)隊(duì)報(bào)道臍帶脫細(xì)胞支架在軟骨重建和神經(jīng)損傷等組織修復(fù)方面，側(cè)面證明臍帶脫細(xì)胞支架材料的潛在應(yīng)用價(jià)值[11,12]。

從組織工程化肝臟的構(gòu)建方式講，采用多種培養(yǎng)策略，提高肝前體樣細(xì)胞在支架上再定植效率和分化成熟度[13-15]；多細(xì)胞培養(yǎng)模式，如肝細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)，對(duì)改善細(xì)胞的氧耗和新陳代謝和功能性血管網(wǎng)絡(luò)形成至關(guān)重要[16]。

綜上所述，聯(lián)合臍帶脫細(xì)胞支架的3D培養(yǎng)，肝前體細(xì)胞可以發(fā)揮氨代謝的優(yōu)勢(shì)，建立富有潛力的肝臟組織功能單元，為以血氨升高為特征的急性肝衰竭治療提供新選擇。