王 也，楊 磊，于 芳，姜睿盈，王 蓓，趙 玲，陳 皇，王曉偉，鐘定榮

（中日友好醫(yī)院 病理科，北京 100029）

肺癌是全世界發(fā)病和死亡率居于高位的惡性腫瘤[1]，其中絕大部分肺癌的病理類型為非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）[2]。目前，隨著各種驅(qū)動突變的發(fā)現(xiàn)以及相應(yīng)靶向藥物的問世，使得非小細(xì)胞肺癌患者特別是晚期肺腺癌患者獲得了更多的治療方案。同時(shí)，檢測技術(shù)的不斷更新?lián)Q代，也使一些罕見的驅(qū)動基因靶點(diǎn)慢慢進(jìn)入了大家的視線，如ROS1、RET、HER2、PIK3CA 等。與之對應(yīng)的靶向藥物也隨之進(jìn)入臨床研究中，并取得了明顯的療效。NCCN（美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)）指南中明確指出：在進(jìn)行靶向藥物治療之前需要對基因突變的狀態(tài)進(jìn)行檢測，以保證為患者提供更為精準(zhǔn)的治療方案。其中多數(shù)驅(qū)動基因的突變可以通過熒光實(shí)時(shí)定量PCR（RT-PCR）的方法進(jìn)行檢測[3]。本文通過回顧性收集630 例手術(shù)切除的非小細(xì)胞肺癌標(biāo)本，使用RT-PCR 法檢測EGFR、ALK、ROS1、RET、KRAS、NRAS、BRAF、PIK3CA 以及HER2 基因的突變情況，并對這些基因中的罕見突變或罕見突變位點(diǎn)進(jìn)行總結(jié)分析。

1 對象與方法

1.1 研究對象

收集中日友好醫(yī)院病理科2018年11月～2019年12月期間送檢的非小細(xì)胞肺癌患者手術(shù)標(biāo)本630 例。患者中男264 例（41.90%），女366例（58.10%）；年齡26～82 歲，平均59.72 歲，中位年齡61 歲。

組織學(xué)分型：原位腺癌9 例（1.43%）、微浸潤腺癌99 例（15.71%）、非黏液性浸潤性腺癌471例（74.76%）、黏液腺癌33 例（5.24%）、鱗癌14 例（2.22%）、大細(xì)胞癌4 例（0.63%）。

非黏液性浸潤性腺癌包括：附壁為主型80 例（16.99%）、腺泡為主型276 例（58.60%）、乳頭為主型62 例（13.16%）、實(shí)體為主型41 例（8.70%）以及微乳頭為主型12 例（2.55%）。

1.2 基因檢測方法

標(biāo)本經(jīng)過腫瘤含量評估后，切8～10μm 厚的石蠟卷5 片，裝入1.5ml EP 管中。脫蠟后，使用FFPE DNA/RNA 核酸共提取試劑盒（廈門艾德）進(jìn)行DNA 和RNA 的提取。并用超微量紫外分光光度儀（日本島津）進(jìn)行濃度測定。配制PCR 體系時(shí)，將DNA 濃度稀釋至2～3ng/μl，RNA 原始濃度上機(jī)。RT-PCR 使用擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)（amplification refractory mutation system，ARMS）法，試劑盒為5 種突變基因檢測試劑盒（廈門艾德）。實(shí)時(shí)定量PCR 儀為ABI 7500（美國）。PCR 程序：第一階段42°C 5min，95°C 5min，1 個循環(huán)；第二階段95°C 25s，64°C 20s，72°C 20s，10 個循環(huán)；第三階段93°C 25s，60°C 35s，72°C 20s，36 個循環(huán)。在第三階段60°C 時(shí)收集FAM 和VIC 熒光信號。結(jié)果參照試劑盒說明書進(jìn)行判讀。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，相關(guān)性分析采用χ2檢驗(yàn)或Fisher 精確檢驗(yàn)以及Logistic回歸分析。腫瘤大小為單向等級有序資料，采用秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 驅(qū)動突變檢測結(jié)果

熒光定量PCR 檢測結(jié)果見圖1～圖12（見封二），驅(qū)動基因突變時(shí)會出現(xiàn)相應(yīng)的一條S 型擴(kuò)增曲線（圖1～圖7），沒有突變時(shí)則沒有曲線（圖8）；融合基因檢測有內(nèi)質(zhì)控曲線一條（圖9～圖12中黑色曲線），發(fā)生融合時(shí)還有出現(xiàn)另一條擴(kuò)增曲線（圖9～圖11中紅色曲線）。

圖1～圖7 RT-PCR基因突變擴(kuò)增曲線，圖中S型曲線為驅(qū)動基因突變。圖1 EGFR18外顯子G719A/C/S伴21外顯子L861Q突變。圖2 EGFR20外顯子插入突變。圖3 KRAS外顯子2突變。圖4 NRAS外顯子3突變。圖5 BRAF突變。圖6 PIK3CA突變。圖7 HER突變。圖8 突變陰性病例。圖9～圖11 ALK、ROS1、RET融合基因擴(kuò)增曲線。圖12 融合陰性病例。

EGFR、KRAS、NRAS、BRAF、PIK3CA、HER2、ALK、ROS1 和RET 總體的突變陽性率分別為51.11% 、7.94% 、0.16% 、0.63% 、0.48% 、3.49% 、3.49%、1.11%和1.75%。標(biāo)本整體的突變陽性率為63.49%（400/630），融合陽性率為6.35%（40/630），全部野生型的病例占30.16%（190/630）。

罕見驅(qū)動基因改變占全部驅(qū)動基因改變的27.27%（120/440）。322 例EGFR 基因突變病例中出現(xiàn)常見敏感突變L858R 和19-del 共293 例（90.99%），G719X 或S768I 或L861Q 突變的病例18 例（5.59%），20-ins 突變12 例（3.73%） 以及T790M 突變1 例（0.31%，伴有L858R）。EGFR 罕見突變位點(diǎn)占9.63%（31/322）。

2.2 驅(qū)動基因共突變情況

L858R 與S768I、L858R 與T790M 共突變各1 例。EGFR 敏感性突變伴PIK3CA 突變2 例，其余檢測的驅(qū)動突變均未發(fā)生共突變情況。

2.3 驅(qū)動突變與臨床病理特點(diǎn)的相關(guān)性

12 例微乳頭為主型肺腺癌全部發(fā)生了驅(qū)動基因突變——包括EGFR 突變7 例，KRAS 突變2例，NRAS 突變1 例，HER2 突變1 例，RET 融合1例。33 例黏液腺癌中，出現(xiàn)EGFR 19-del 突變5例（其中1 例伴PIK3CA 突變），KRAS 突變10例，ALK 融合基因8 例。14 例鱗癌中見EGFR、KRAS、PIK3CA 突變各1 例。

表1 RAS、BRAF、PIK3CA、HER2 突變與臨床病理特征的相關(guān)性（n=630）

2.3.1 EGFR 基因罕見突變位點(diǎn)

EGFR 20-ins 突變在≤55 歲患者中的突變率（4.28%） 明顯高于＞55 歲的患者（0.93%）（P＞0.05），與年齡呈負(fù)相關(guān)（r=-0.108，P ＜0.05）。G719X、S768I、L861Q 以及T790M 突變與各項(xiàng)臨床病理信息之間的相關(guān)性不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。常見敏感突變（19-del 或L858R）與性別、腫瘤大小、組織學(xué)分型以及微乳頭成分之間的相關(guān)性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3.2 RAS、BRAF、PIK3CA 與HER2 基因

表1示，HER2 基因在≤55 歲組（8.72%）、無微乳頭成分組（4.37%)、女性組（4.37%）的陽性率均高于＞55 歲組（1.15%）、有微乳頭成分組（1.16%） 和男性組（2.27%）。此外，全部22 例HER2 陽性病例，均發(fā)生在腫瘤最大徑≤3cm 組和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組。HER2 突變與患者年齡呈負(fù)相關(guān)（r=-0.191，P＜0.05）。RAS 基因突變在黏液腺癌中陽性率最高，可達(dá)30.30%（10/33），并與腫瘤大小呈正相關(guān)（r=0.159，P＜0.05），與性別及組織學(xué)分型的相關(guān)性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。PIK3CA與組織學(xué)分型之間的相關(guān)性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3.3 ALK、ROS1、RET 融合基因

表2示，ALK、ROS1、RET 基因融合均與組織學(xué)包含微乳頭成分呈正相關(guān)（r=0.097、0.105、0.136，P＜0.05）。ALK 基因融合與組織學(xué)分型的相關(guān)性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），并與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)（r=0.222，P＜0.05）。在實(shí)體為主型腺癌和黏液腺癌中的突變率分別為14.63%（6/41）和24.24%（8/33），二者的突變病例數(shù)占總突變病例數(shù)的63.64%（14/22）。

表2 ALK、ROS1、RET 融合與臨床病理特征的關(guān)系（n=630）

3 討論

3.1 罕見基因突變的臨床意義

EGFR 是非小細(xì)胞肺癌最為常見的基因突變類型，除19 外顯子缺失及21 外顯子L858R 突變是常見的敏感性突變[4]之外，還存在一些罕見突變類型，如G719X、S768I、L861Q 等敏感性突變，以及T790M、20 外顯子插入突變等與耐藥相關(guān)的突變[5]。罕見突變常常與其他敏感突變發(fā)生雙突變，這部分患者在接受靶向治療后可能療效低于單突變的患者[6]。

HER2 基因在非小細(xì)胞肺癌中的改變方式包括擴(kuò)增、過表達(dá)以及突變。HER2 突變率為1.92%，在女性、未吸煙患者中常見[7]。有文獻(xiàn)報(bào)道HER2 突變的患者更容易從化療中獲益[8]。KRAS基因在白種人中突變率更高，在中國的突變率為5.9%～8.0%[9]。KRAS 通常與EGFR、BRAF 等基因突變互斥，與ALK 等基因融合亦不共存，并在實(shí)體為主型腺癌及浸潤性黏液腺癌中更為常見。PIK3CA 基因突變在肺腺癌中的陽性率為4.4%，文獻(xiàn)報(bào)告PIK3CA 基因可以和其他驅(qū)動突變發(fā)生共突變，這與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)論一致。NRAS 基因突變較為少見，文獻(xiàn)報(bào)道其突變率為0.29%[10]，其臨床意義尚待探討。BRAF 基因在肺腺癌中的突變類型主要包括V600E、L956V、G468A 等，突變率約為4.9%，大部分突變類型為V600E 突變[11]。BRAF 抑制劑維莫非尼對BRAF V600E 突變的患者有一定的治療效果[12]。

3.2 ALK、ROS1、RET 基因融合的檢測意義

用于檢測基因融合的方法包括RT-PCR、熒光原位雜交、免疫組織化學(xué)和測序等，在臨床上以前兩者最為常見。ALK 基因融合常發(fā)生在實(shí)體型、腺泡型腺癌伴細(xì)胞內(nèi)黏液的病理組織分型之中，突變率為6.6%～9.6%[13]。雖然ALK 融合的陽性率較低，但患者應(yīng)用靶向藥物之后的客觀有效率明顯高于化療。ALK 基因融合一般與EGFR 等基因發(fā)生共突變的概率極低，但亦有文獻(xiàn)報(bào)道這2 個驅(qū)動基因可以同時(shí)發(fā)生突變[14]。與ALK 相似，ROS1 基因融合多見于女性不吸煙的肺腺癌患者，亦不與EGFR、KRAS、ALK 等驅(qū)動突變發(fā)生共存，其在人群中的總體發(fā)生率約為1%～2%[15]，目前針對ROS1 融合的靶向藥物包括克唑替尼以及卡博替尼等[16]。此外，ALK 與ROS1 基因融合都更容易出現(xiàn)在浸潤性黏液腺癌中。RET 基因融合發(fā)生率為1%～2%，NCCN 指南推薦使用卡博替尼來治療RET 融合的患者[16]。