林 臻陳洪志趙 航劉 輝許妍妍劉海巖張 浩

(吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)系,長(zhǎng)春 130021)

帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是一種常見(jiàn)的中老年神經(jīng)退行性病變,隨著人口老齡化的加劇,患病人口日益增加[1]。 其病理學(xué)表現(xiàn)為中腦紋狀體和黑質(zhì)區(qū)域多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性減少。 現(xiàn)有多種機(jī)理的動(dòng)物模型可以模擬帕金森病的發(fā)生和進(jìn)展,其中藥物誘發(fā)化學(xué)損毀模型以其簡(jiǎn)便、快捷和較為經(jīng)濟(jì)的優(yōu)勢(shì),成為廣泛應(yīng)用的模型制備方法。 1-甲基-4 苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)經(jīng)腹腔注射后可造成小鼠黑質(zhì)和紋狀體區(qū)域多巴胺能神經(jīng)元死亡,酪氨酸羥化酶(TH)陽(yáng)性細(xì)胞和神經(jīng)纖維減少,能夠模擬帕金森病的病理學(xué)表現(xiàn),是一種常見(jiàn)的帕金森病模型誘導(dǎo)藥物[2]。 本研究擬通過(guò)對(duì)多種行為學(xué)表現(xiàn)的統(tǒng)計(jì)和評(píng)價(jià),以及將行為學(xué)和形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)相互印證,初步建立一個(gè)可以通過(guò)行為學(xué)數(shù)據(jù)評(píng)估小鼠帕金森模型效果的簡(jiǎn)便途徑。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)雄性 C57BL/6 小鼠 35 只,年齡 3 ～ 9 月齡,體重25～26 g,購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司[SCXK(遼)2015-0001]。 飼養(yǎng)于吉林大學(xué)(基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)[SYXK(吉)2018-0001]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審查((2016 年)研審第 001 號(hào)),依據(jù)優(yōu)化、減少、替代的3R 原則進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。

1.2 主要試劑與儀器

MPTP 購(gòu)自 Sigma 公司(貨號(hào):MO896,中國(guó))；亞克力材質(zhì)行為學(xué)評(píng)估水箱、支架、曠場(chǎng)環(huán)境,由吉林大學(xué)人體解剖學(xué)系自行制作。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物模型的制作

雄性C57BL/6 小鼠35 只隨機(jī)分為4 組,Ⅰ組為對(duì)照組5 只,給予計(jì)量為30 mg/kg 體重生理鹽水,持續(xù)7 d。 Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組為模型組,每組 10 只,分別給予計(jì)量為 35 mg/kg、30 mg/kg、25 mg/kg 體重的 MPTP 持續(xù) 7 d、8 d、10 d。

1.3.2 行為學(xué)檢測(cè)

(1)震顫麻痹評(píng)分

小鼠采用腹腔注射給藥,立即進(jìn)行觀察,持續(xù)3 h。 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為:0 分,與正常小鼠相似,無(wú)任何癥狀；1 分,出現(xiàn)豎毛、弓背、間斷性細(xì)小震顫,但活動(dòng)自如；2 分,出現(xiàn)吞咽頻繁,頻繁性震顫,后肢張開,顫尾,活動(dòng)逐漸受限；3 分,出現(xiàn)流涎、持續(xù)性震顫,四肢僵硬,活動(dòng)受限；4 分,因全身麻痹而死亡。

(2)曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)

給藥結(jié)束后第3 天開始,每天進(jìn)行一次實(shí)驗(yàn),持續(xù)到第7 天。 采用亞克力材質(zhì)50 cm×50 cm×50 cm方盒作為場(chǎng)地,均勻劃分為9 格,將小鼠放入曠場(chǎng)的正中格內(nèi),記錄小鼠三爪以上跨入鄰格的次數(shù),觀察持續(xù)2 min。 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為:0 分,跨入次數(shù)＞40 次；1 分,跨入次數(shù)為 31 ～ 40 次；2 分,跨入次數(shù)為 21 ～30 次；3 分,跨入次數(shù)＜21 次。

(3)爬桿實(shí)驗(yàn)

給藥前3 d,每天進(jìn)行一次爬桿訓(xùn)練。 給藥結(jié)束后第3 天開始,每天一次測(cè)量,持續(xù)到第7 天。 將一直徑為2.5 cm 的塑料球固定于長(zhǎng)50 cm、粗1.5 cm的亞克力桿頂端,纏上紗布以防打滑,然后將被測(cè)小鼠置于球上,記錄由球上爬至桿子底部所需時(shí)間。 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為:0 分,爬桿時(shí)間＜4.01 s；1 分,爬桿時(shí)間為 4.01～8.0 s；2 分,爬桿時(shí)間為8.01～12.0 s；3 分,爬桿時(shí)間＞12.00 s。

(4)懸掛實(shí)驗(yàn)

給藥結(jié)束后第3 天開始,每天進(jìn)行一次實(shí)驗(yàn),持續(xù)到第7 天。 被測(cè)小鼠倒置懸掛,將兩前爪置于30 cm 長(zhǎng),25 cm 高水平電線中點(diǎn),而后放開小鼠,記錄其抓握情況。 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為,0 分,兩后爪均可抓住電線；1 分,一只后爪可抓住電線；2 分,兩只后爪均不能抓住電線。 如出現(xiàn)后爪反復(fù)抓取電線,間斷可抓住現(xiàn)象,可記為0.5 分。

(5)游泳實(shí)驗(yàn)

給藥結(jié)束后第3 天開始,每天進(jìn)行一次實(shí)驗(yàn),持續(xù)到第7 天。 小鼠放于40 cm×25 cm×16 cm 的水箱中,水深15 cm,水溫為(27±2)℃,記錄 3 min 內(nèi)小鼠的漂浮時(shí)間。 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為:0 分,漂浮 0 ～30 s；1分,漂浮 31 ～ 90 s；2 分,漂浮 91 ～150 s；3 分,漂浮151～180 s。

1.3.3 形態(tài)學(xué)檢測(cè)

全部行為學(xué)測(cè)試結(jié)束后第1 天,將小鼠麻醉后,37℃ 80 mL 生理鹽水灌流,4℃ 100 mL 4%甲醛固定,取出全腦。 4%甲醛外固定3 d,后進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋切片,厚度為4 μm。 石蠟切片分別進(jìn)行HE 染色和免疫組化染色。

HE 染色:常規(guī)梯度乙醇脫蠟,PBS 沖洗3 min×3 次,經(jīng)蘇木精染色、氨水反藍(lán)、伊紅染色后,脫水透明封片。 觀察小鼠紋狀體和黑質(zhì)部分神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)、數(shù)量和分布。

免疫組織化學(xué)染色:按照免疫組化檢測(cè)試劑盒步驟進(jìn)行脫蠟、PBS 沖洗、3% H2O2抗原修復(fù)和血清封閉。 滴加一抗 TH 抗體(1 ∶300),4℃過(guò)夜后順次滴加試劑1(放大信號(hào))和試劑2(二抗),各孵育15 min,PBS 沖洗后進(jìn)行DAB 顯色、蘇木精復(fù)染,脫水透明封片。 觀察小鼠紋狀體和黑質(zhì)部分TH 陽(yáng)性細(xì)胞的形態(tài)、數(shù)量和分布。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用3 次測(cè)量取平均值的方式進(jìn)行采集,使用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析,用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,不同組之間的差異用t檢驗(yàn)比較分析,P＜0.05 為具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 震顫麻痹評(píng)分

腹腔注射MPTP 后5 ～30 min,小鼠相繼出現(xiàn)豎毛、弓背、間歇性小震顫,繼而可出現(xiàn)吞咽頻繁至流涎,后肢張開至四肢僵硬,震顫頻率逐漸增加,直至出現(xiàn)可持續(xù)數(shù)十秒的持續(xù)性震顫,60 min 后出現(xiàn)活動(dòng)減低。 由于連續(xù)7～10 d 給藥,隨著體內(nèi)積累藥量增加,小鼠出現(xiàn)活動(dòng)減低現(xiàn)象時(shí)間逐漸提前,其他現(xiàn)象則漸不明顯,所以將第一次給藥評(píng)分作為震顫麻痹評(píng)分,各劑量組均數(shù)作為該組震顫麻痹評(píng)分。 可見(jiàn)對(duì)照組無(wú)震顫麻痹現(xiàn)象,隨單體次藥劑量增加,小鼠震顫麻痹現(xiàn)象加重。 各組震顫麻痹評(píng)分見(jiàn)表1。 給藥過(guò)程中有小鼠由于藥物反應(yīng)死亡,后續(xù)檢測(cè)中30 mg/kg組和35 mg/kg 組實(shí)際測(cè)量分別為7 只、9 只。

2.2 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)

將曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)連續(xù)測(cè)量5 d 的評(píng)分計(jì)算均數(shù),作為單只受試鼠的評(píng)分,將各劑量組均數(shù)作為該組曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)評(píng)分,具體結(jié)果見(jiàn)表2。 可見(jiàn)與對(duì)照組相比,給藥組的評(píng)分明顯增高,但30 mg/kg 組評(píng)分高于35 mg/kg 組。

2.3 爬桿實(shí)驗(yàn)

通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),隨著不斷訓(xùn)練,小鼠爬桿實(shí)驗(yàn)完成時(shí)間會(huì)不斷變短,所以將停藥后第三天的爬桿實(shí)驗(yàn)評(píng)分作為最終記錄評(píng)分,各劑量組均數(shù)作為該組爬桿實(shí)驗(yàn)評(píng)分,見(jiàn)表3。 可見(jiàn)與對(duì)照組相比,給藥組的評(píng)分明顯增高,30 mg/kg 組與35 mg/kg 組無(wú)顯著性差異。

2.4 懸掛實(shí)驗(yàn)

小鼠由停藥第6 天開始,懸掛實(shí)驗(yàn)癥狀逐漸恢復(fù),現(xiàn)將懸掛實(shí)驗(yàn)停藥第3 ～5 天的評(píng)分計(jì)算均數(shù),作為單只受試鼠的評(píng)分,將各劑量組均數(shù)作為該組懸掛實(shí)驗(yàn)評(píng)分,具體結(jié)果見(jiàn)表4。 可見(jiàn)與對(duì)照組相比,給藥組的評(píng)分明顯增高,且隨著給藥劑量的增加,評(píng)分也隨之增高。

2.5 游泳實(shí)驗(yàn)

將游泳實(shí)驗(yàn)連續(xù)測(cè)量5 d 的評(píng)分計(jì)算均數(shù),作為單只受試鼠的評(píng)分,將各劑量組均數(shù)作為該組游泳實(shí)驗(yàn)評(píng)分,具體結(jié)果見(jiàn)表5。 可見(jiàn)與對(duì)照組相比,給藥組的評(píng)分明顯增高,但30 mg/kg 組評(píng)分高于35 mg/kg 組。

2.6 綜合統(tǒng)計(jì)

將各受試鼠的五項(xiàng)行為學(xué)測(cè)試評(píng)分加和,統(tǒng)計(jì)各組每只受試鼠行為學(xué)總得分。 見(jiàn)表6。

表1 震顫麻痹評(píng)分Table 1 Paralysis agitans score

表2 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)Table 2 Field test

表3 爬桿實(shí)驗(yàn)Table 3 Pole test

表4 懸掛實(shí)驗(yàn)Table 4 Traction test

表5 游泳實(shí)驗(yàn)Table 5 Swim test

表6 綜合得分Table 6 Comprehensive score

2.7 形態(tài)學(xué)檢測(cè)

將各組小鼠分別取腦,對(duì)黑質(zhì)和紋狀體分別行HE 和TH 抗體免疫組化染色,見(jiàn)圖1、圖2。

通過(guò)HE 染色,可以確定黑質(zhì)區(qū)域神經(jīng)元細(xì)胞以及紋狀體神經(jīng)纖維的分布和形態(tài)。 進(jìn)一步行TH抗體免疫組化染色,發(fā)現(xiàn)模型組在黑質(zhì)區(qū)域存在多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量減低,紋狀體區(qū)域出現(xiàn)TH 陽(yáng)性神經(jīng)纖維數(shù)量減少的現(xiàn)象,能夠在形態(tài)學(xué)上認(rèn)定帕金森模型制作成功。

圖1 黑質(zhì)HE 和TH 抗體免疫組化染色Note.The upper line corresponds to the HE staining results of control group and 23 ～35 mg/kg groups,respectively.The next line corresponds to the TH immunohistochemical results of control group and 23～35 mg/kg groups,respectively.Figure 1 HE staining results and TH immunohistochemical results of the substantia nigra

圖2 紋狀體HE 和TH 抗體免疫組化染色Note.The upper line corresponds to the HE staining results of control group and 23 ～35 mg/kg groups,respectively.The next line corresponds to the TH immunohistochemical results of control group and 23～35 mg/kg groups,respectively.Figure 1 Figure 2 HE staining results and TH immunohistochemical results of the corpus striatum

3 討論

MPTP 自上世紀(jì)80 年代發(fā)現(xiàn)以來(lái),已廣泛應(yīng)用于帕金森化學(xué)損毀模型的制備。 其可以引起靈長(zhǎng)類和嚙齒類動(dòng)物腦內(nèi)黑質(zhì)和紋狀體區(qū)域多巴胺能神經(jīng)元死亡,這與帕金森病的病理改變較為類似,由此也引起該動(dòng)物模型產(chǎn)生與帕金森病相類似的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)[3]。 TH 在多巴胺能神經(jīng)元中含量較高,其水平能夠反應(yīng)該神經(jīng)元的位置和功能,因此,檢測(cè)黑質(zhì)和紋狀體區(qū)域TH 表達(dá)的區(qū)域和變化,可以反映出多巴胺能神經(jīng)元的位置和數(shù)量,由此判斷MPTP 誘導(dǎo)的帕金森模型的嚴(yán)重程度[4]。

帕金森病癥狀是由多種原因相互影響產(chǎn)生的,例如肌張力增強(qiáng)可導(dǎo)致協(xié)調(diào)障礙,進(jìn)而引起運(yùn)動(dòng)減低。 而動(dòng)物的行為學(xué)表現(xiàn)又同時(shí)受到客觀能力和主觀意愿的影響,所以單一的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)很難準(zhǔn)確的反映出帕金森動(dòng)物模型是否成功及其嚴(yán)重程度[5]。 本實(shí)驗(yàn)選取了與帕金森病相關(guān)且較為常見(jiàn)和簡(jiǎn)便易測(cè)的五種行為學(xué)評(píng)價(jià)方法[6-9],包括了運(yùn)動(dòng)能力、協(xié)調(diào)性、肌力、主觀意愿等各個(gè)方面,以期通過(guò)多個(gè)實(shí)驗(yàn)來(lái)綜合評(píng)價(jià),為分析行為學(xué)檢測(cè)和形態(tài)學(xué)指標(biāo)的關(guān)聯(lián)性奠定基礎(chǔ)。

震顫麻痹評(píng)分是與給藥劑量直接相關(guān)的指標(biāo),多數(shù)研究對(duì)其以觀察現(xiàn)象為主,少有通過(guò)量表進(jìn)行評(píng)分[10],這主要由兩個(gè)因素造成,一是隨著給藥的次數(shù)增加,小鼠活動(dòng)減低時(shí)間前提并延長(zhǎng),很多癥狀趨于隱匿；二是相同給藥劑量情況下,小鼠表現(xiàn)較為相近,長(zhǎng)時(shí)間觀察區(qū)分較為困難。 針對(duì)這兩個(gè)問(wèn)題,本研究選取了多個(gè)給藥劑量,且以表現(xiàn)最為明顯的給第一次給藥作為觀察點(diǎn),震顫麻痹評(píng)分的區(qū)分度較好。 給藥組與對(duì)照組差別顯著,且劑量依賴性明顯,增大劑量后,評(píng)分也隨之增高,但同時(shí)發(fā)現(xiàn)30 mg/kg 以上劑量,會(huì)出現(xiàn)由于不耐受藥物而產(chǎn)生的動(dòng)物死亡,兩組累計(jì)死亡4 只,這與國(guó)外一般認(rèn)為的45 mg/kg MPTP 劑量以內(nèi)不會(huì)出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡的報(bào)道不相符[11]。

曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、爬桿實(shí)驗(yàn)和游泳實(shí)驗(yàn)中,除與對(duì)照組存在顯著性差異外,25 mg/kg 的低劑量組與30 mg/kg 和35 mg/kg 的中高劑量組也存在較為明顯的差異。 同時(shí)30 mg/kg 和 35 mg/kg 間差別不明顯,反而出現(xiàn)個(gè)別評(píng)分與劑量相反的情況,說(shuō)明給藥劑量存在一個(gè)較為明顯的閾值,超過(guò)該閾值后,這三個(gè)實(shí)驗(yàn)的行為學(xué)表現(xiàn)沒(méi)有明顯的增強(qiáng)趨勢(shì)。此外由于小鼠對(duì)爬桿實(shí)驗(yàn)適應(yīng)性較強(qiáng),反復(fù)測(cè)量會(huì)明顯降低評(píng)分[12],本研究在給藥前3 d 開始每天對(duì)小鼠進(jìn)行訓(xùn)練,使其適應(yīng)爬桿環(huán)境,間隔7 ～10 d 的給藥期和2 d 的穩(wěn)定期后,在給藥結(jié)束后第3 天直接測(cè)量爬桿實(shí)驗(yàn)評(píng)分,力求避免小鼠適應(yīng)性對(duì)爬桿實(shí)驗(yàn)評(píng)分的影響。

有研究顯示懸掛實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性較好,一般可以持續(xù)到給藥結(jié)束一到二周才會(huì)出現(xiàn)明顯的癥狀消退[13],本研究發(fā)現(xiàn)在懸掛實(shí)驗(yàn)評(píng)分在第6 天即出現(xiàn)明顯降低,模型動(dòng)物力量明顯升高,因此僅統(tǒng)計(jì)了停藥后3～5 d 的評(píng)分。 在每天評(píng)價(jià)中的三次測(cè)量基本得分一致,在停藥5 d 的跨度中變化也較小。懸掛實(shí)驗(yàn)主要反應(yīng)了小鼠的肌力情況,與對(duì)照組相比,給藥組有明顯的評(píng)分增高,而在給藥組內(nèi),三個(gè)劑量組也均有顯著差別,說(shuō)明肌力隨給藥劑量增加而持續(xù)下降。 但是抓握能力下降也與協(xié)調(diào)性和精細(xì)運(yùn)動(dòng)障礙有關(guān),所以此實(shí)驗(yàn)仍有其他因素加入,不能認(rèn)為僅反映肌力情況。

本研究將五個(gè)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)整合起來(lái),統(tǒng)計(jì)綜合得分,進(jìn)行組間對(duì)比,可見(jiàn)三個(gè)給藥組與對(duì)照組均存在顯著性差異,說(shuō)明即使給予低劑量藥物,也能引起動(dòng)物模型類帕金森病的行為學(xué)改變。 低劑量組與中高劑量組間也存在顯著性差異,說(shuō)明給予中高劑量藥物會(huì)使此類行為學(xué)改變顯著增強(qiáng)。 但是中高劑量組間無(wú)顯著性差異則說(shuō)明,給藥劑量存在某一閾值,給予超過(guò)閾值劑量的MPTP,行為學(xué)改變不會(huì)進(jìn)一步出現(xiàn)顯著性增強(qiáng),但會(huì)出現(xiàn)藥物致死現(xiàn)象。

以往研究中由于單一行為學(xué)評(píng)估手段的不穩(wěn)定性,多采用形態(tài)學(xué)手段進(jìn)行模型判定[3-5]。 這就要求必須抽樣處死一批造模動(dòng)物進(jìn)行判定,既增加了實(shí)驗(yàn)的復(fù)雜性,也不能保證存活動(dòng)物一定能夠達(dá)到模型成功標(biāo)準(zhǔn)。 本研究進(jìn)行整合行為學(xué)評(píng)分與形態(tài)學(xué)表現(xiàn)關(guān)聯(lián)分析,以形態(tài)學(xué)結(jié)果為判定標(biāo)準(zhǔn),進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)整合評(píng)分達(dá)到7.5 分以上的模型可以確定造模成功,6 分以下可以確定造模失敗,提示整合行為學(xué)評(píng)估手段對(duì)模型判定較以往單一行為學(xué)檢測(cè)方法更為準(zhǔn)確,與形態(tài)學(xué)檢測(cè)結(jié)果一致性更強(qiáng)。 同時(shí)在總體趨勢(shì)上整合行為學(xué)評(píng)分較高的個(gè)體形態(tài)學(xué)表現(xiàn)也更為明顯,可以認(rèn)為帕金森病嚴(yán)重程度較高,進(jìn)一步可以對(duì)模型的嚴(yán)重程度進(jìn)行簡(jiǎn)單的劃分。

因此,本研究采用的整合行為學(xué)評(píng)分方法可以提高M(jìn)PTP 誘導(dǎo)C57BL/6 小鼠帕金森動(dòng)物模型制備標(biāo)準(zhǔn)及其以此動(dòng)物模型為基礎(chǔ)的相關(guān)科學(xué)研究的科研數(shù)據(jù)的可靠性。 在今后的研究中,以此為切入點(diǎn),增強(qiáng)模型穩(wěn)定性,優(yōu)化整合評(píng)估手段,可以使MPTP 誘導(dǎo)C57BL/6 小鼠帕金森模型的制備和評(píng)估更加簡(jiǎn)便準(zhǔn)確。