張?jiān)姕Y

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院超聲科,南昌 330006)

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)作為一種具有潛在致命性的累及全身動(dòng)脈脂質(zhì)代謝紊亂的慢性炎癥疾病,是造成心腦血管惡性事件的主要原因之一,其中頸動(dòng)脈為多發(fā)部位。 頸動(dòng)脈粥樣硬化(carotid atherosclerosis,CAS)是缺血性腦卒中的危險(xiǎn)因素。 研究表明[1]AS 是一種炎癥性疾病,其發(fā)生、發(fā)展與動(dòng)脈內(nèi)膜中的脂質(zhì)沉積密切相關(guān),但目前AS 的病理生理機(jī)制尚未完全明確。 微小核糖核酸(microRNA,miRNA)是一種內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼 RNA。 研究表明[2]多種miRNA 參與調(diào)節(jié)心腦血管系統(tǒng)中細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、衰老等細(xì)胞生物學(xué)行為。 Li 等[3]研究表明miRNA-21 增強(qiáng)血管平滑肌的細(xì)胞增殖,推動(dòng)AS 的進(jìn)程。 Gao等[4]報(bào)道血漿中的miR-126 和miR-143 的含量可以作為動(dòng)脈粥樣硬化的新型生物標(biāo)志物。 近來miR-181b 與 AS 的關(guān)系引起關(guān)注。 Sun 等[5]研究表明miR-181b 調(diào)控Notch1 通路影響AS 血管內(nèi)皮組織的炎性反應(yīng)。 Zhong 等[6]研究證實(shí) miR-181b 聯(lián)合STAT3 通路影響 AS 細(xì)胞模型的凋亡率,但關(guān)于miR-181b 對(duì)AS 斑塊影響的作用機(jī)制未見報(bào)道。 肌肉過量蛋白-3(muscle excess protein-3,Mex3)作為早期胚胎發(fā)展中的一種RNA 結(jié)合蛋白,可以抑制細(xì)胞內(nèi)蛋白的表達(dá)。 研究表明[7]在四種人類Mex3 蛋白中,Mex3B 的表達(dá)與機(jī)體炎癥應(yīng)激密切相關(guān)。 本研究通過維生素D3 聯(lián)合高脂飲食法構(gòu)建動(dòng)脈粥樣硬化大鼠模型,探討miR-181b 和Mex3B 對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成的調(diào)控機(jī)制,以期為臨床研究提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

7 ～8 周無特殊病原體(specific pathogen free,SPF)級(jí)雄性 SD 大鼠 40 只,(200±20)g,由江西中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供[SCXK(贛)2018-0003],動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在南昌大學(xué)生命科學(xué)研究院[SYXK(贛)2015-0002]進(jìn)行；依照南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理辦法,室溫21℃～25℃下,濕度維持在60%左右,自然光照、標(biāo)準(zhǔn)飼料、自由飲水、單籠飼養(yǎng)一周后用于實(shí)驗(yàn)。 所有動(dòng)物福利和實(shí)驗(yàn)程序均嚴(yán)格遵守我院的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的護(hù)理和使用指南》及相關(guān)道德規(guī)范,本研究中涉及動(dòng)物的使用及操作按3R 原則給與動(dòng)物人道的關(guān)懷,并經(jīng)本院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(IACUC(贛)-2019-076)。

1.2 主要試劑與儀器

miR-181b 抑制物 miR-181b-inhibitor 及 miR-181b 抑制物陰性對(duì)照miR-181b-inhibitor-NC 由上海吉瑪技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)完成。

維生素D3 注射液(上海通用藥業(yè)有限公司,國藥準(zhǔn)字:H31022404,規(guī)格:1 mL:7.5 mg,以維生素D3 計(jì))；高脂飼料(81.3%基礎(chǔ)飼料+10%豬油+5%白糖+3% 膽固醇+0.5%膽酸鈉+0.2%丙基硫氧嘧啶,總能量為6 kcal/g。 等級(jí):A 級(jí))由我院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

LipofectamineTMRNAiMAX 轉(zhuǎn)染試劑(德國QIAGEN 公司)；全蛋白抽提試劑盒(日本TOYOBO公司)；PBS 緩沖溶液、雙熒光素酶測(cè)定試劑盒、蘇木精伊紅(hematoxylin eosin,E) 試劑盒(美國Invitrogen 公司)；腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factoR-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)抗體、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloprotein,MMP-9)抗體(美國 Abcamn 公司)；麻醉劑、Mex3B抗體(美國 Jackson 公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Western blot 試劑盒(美國 sigma 公司)；油紅 O 染色試劑盒(美國R&D 公司)；脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(terminal-deoxynucleotidyl transferase mediatednick end labeling,TUNEL)試劑盒(美 國 Amresco 公 司 )；增 強(qiáng) 化 學(xué) 發(fā) 光(electrochemiluminescence,ECL)化學(xué)發(fā)光顯色試劑盒(美國 Millipore 公司)。

YJ-875 A 醫(yī)用凈化工作臺(tái)、高速低溫離心機(jī)(北京六一儀器廠)；LIOOS600T 熒光顯微鏡(日本尼康公司)；Bio-rad 凝膠成像系統(tǒng)(Bio-rad 公司)；-80℃深冷冰箱(德國維根斯公司)；Leica RM2135 組織切片機(jī)(德國 Leica 公司)；RT-PCR 儀(美國 Palo Alto 公司)；LOGIQ7 型彩色多普勒超聲成像系統(tǒng)(美國GE 公司)；Vevo 2100 高分辨率小動(dòng)物超聲儀(加拿大 Visual Sonic 公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型構(gòu)建及實(shí)驗(yàn)分組

將40 只 SD 大鼠隨機(jī)分成 4 組,每組 10 只,分別為:正常組、模型組、miR-181b-inhibitor-NC 組(對(duì)照組)和miR-181b-inhibitor 組(實(shí)驗(yàn)組)。

準(zhǔn)確量取2.5 μL 的 LipofectamineTMRNAiMAX分別與 9 μL 的 miR-181b-inhibitor-NC 和 miR-181binhibitor 混合均勻,37℃下靜置2 h。 通過尾靜脈分別注射7 μL 混合液到對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物體內(nèi),注射速度維持在2 μL/min,留針時(shí)長5 min,正常組和模型組注射等劑量的生理鹽水,注射完畢24 h 后,模型組、對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組大鼠采用維生素D3 聯(lián)合高脂飲食法構(gòu)建動(dòng)脈粥樣硬化模型[8]。 具體操作如下:將維生素D3 以600000 U/kg 的劑量一次性腹腔注射進(jìn)大鼠體內(nèi)后每日以100 g 高脂飼料喂養(yǎng),正常組大鼠始終以等量基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)。 飲水、光照、溫度恒定不變。

1.3.2 Vevo 2100 超聲儀對(duì)各組大鼠的動(dòng)脈檢測(cè)

喂養(yǎng)60 d 后,頸動(dòng)脈超聲檢查觀察各組大鼠頸動(dòng)脈內(nèi)膜是否光滑、有無增生或者斑塊、斑塊部位、大小和回聲點(diǎn)。 沿血管長軸測(cè)量管腔動(dòng)脈后壁內(nèi)膜-中層厚度(intima-media thickness of the posterior wall of the artery,IMT)；將探頭在中點(diǎn)采樣,維持血流和聲速小于60 度,測(cè)量大鼠血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)指標(biāo)斑塊面積(square,S)等。

1.3.3 HE 染色、油紅O 染色檢測(cè)各組大鼠AS 病理改變

超聲檢查完畢后,大鼠禁食12 h,麻醉處理并在顯微鏡下無菌剝離各組大鼠的全主動(dòng)脈,剔除外膜的脂肪組織,80%的組織標(biāo)本進(jìn)行液氮封存,20%的組織標(biāo)本,56℃水浴1 h,生理鹽水沖洗10 min,10%甲醛溶液固定1 h,石蠟包埋10 min,切片,蒸餾水清洗3 次,依次進(jìn)行HE、油紅O 染色光鏡下觀察AS病變程度。

1.3.4 TUNEL 染色檢測(cè)各組大鼠中動(dòng)脈組織的細(xì)胞凋亡

取出10%各組組織標(biāo)本,10%甲醛固定,二甲苯浸洗兩次,梯度乙醇浸洗5 min,風(fēng)干后3%雙氧水-甲醇浸泡10 min,PBS 漂洗3 次,每次3 min,然后4℃預(yù)冷乙醇上進(jìn)行如下操作:0.1% TritonX-100、0.1%緩沖液處理2 min,PBS 漂洗3 次,每次3 min,加入TUNNEL 反應(yīng)混合液,加封口膜在暗濕盒中反應(yīng)1 h,溫度37℃,PBS 漂洗,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹脂封片,顯微鏡下觀察。

1.3.5 免疫組化檢測(cè)各組大鼠中動(dòng)脈組織中IL-6、TNF-α 和 MMP-9 的表達(dá)

取出10%各組組織標(biāo)本,常規(guī)方法固定,包埋,切片,脫蠟,修復(fù),雙氧水封閉,加入一抗,維持4℃孵育過夜,次日加入二抗,室溫孵育30 min,清洗。加適量顯色劑,蘇木素復(fù)染,PBS 清洗,脫水,中性樹膠封片,顯微鏡下觀察并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果；染色評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)以腫瘤細(xì)胞細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽性。

1.3.6 qRT-PCR 檢測(cè) miR-181b 和 Mex3B 蛋白的mRNA 的表達(dá)

取出10%各組組織標(biāo)本,提取標(biāo)本中細(xì)胞的總RNA,法測(cè)定RNA 濃度和檢測(cè)RNA 完整性后[9],上RT-PCR 儀檢測(cè)。 用 2-△△CT表示目的基因相對(duì)表達(dá)量；每個(gè)樣本獨(dú)立重復(fù)測(cè)量3 次,引物序列詳見表1。

1.3.7 熒光素酶報(bào)告基因分析

取出10%各組組織標(biāo)本,采用TRIzol 提取總RNA 并逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA,PCR 擴(kuò)增 Mex3B 的 3’-非翻譯區(qū),并構(gòu)建pGL3(pGL3-Mex3B-WT)載體,利用TaKaRa 技術(shù)在 pGL3(pGL3-Mex3B-WT)上 miR-181b 結(jié)合位點(diǎn)上構(gòu)建(pGL3-Mex3B-MUT)載體,利用轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000 將報(bào)告載體、mimic control、miR-181b mimic 轉(zhuǎn)染至人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(human aortic endothelial cells, HAEC)中,轉(zhuǎn)染成功48 h 后,用雙重?zé)晒馑孛笀?bào)告分析系統(tǒng)(dualluciferase reporter assay system)檢測(cè)不同重組質(zhì)粒的熒光活性從而評(píng)估啟動(dòng)子活性檢測(cè)相對(duì)熒光素酶活性,報(bào)告基因活性為螢火蟲熒光素酶/海腎熒光素酶活性值。

1.3.8 Western blot 檢測(cè)各組標(biāo)本中 Mex3B、IL-6、TNF-α 和 MMP-9 蛋白的表達(dá)

取出10%各組組織標(biāo)本,采用常規(guī)方法提取目標(biāo)蛋白 Mex3B、IL-6、TNF-α 和 MMP-9,經(jīng) BCA 試劑盒測(cè)定蛋白濃度后,準(zhǔn)確量取50 μg,電泳結(jié)束后,將樣品蛋白經(jīng)濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至PVDF 轉(zhuǎn)膜上,加入10%脫脂奶粉封閉3 h,以(1 ∶1500)比例稀釋后,維持4℃孵育過夜,洗滌加入二抗孵育3 h, 增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光ELC 顯色 30 min,經(jīng)曝光、顯影、定影后,以GAPDH 為內(nèi)參來表示蛋白的表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本實(shí)驗(yàn)采用SPSS 16.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,采用Graphpad 5.0 軟件作圖,兩組間比較采用t檢驗(yàn),多組間比較采用方差分析,P＜0.05 表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠的頸動(dòng)脈超聲檢測(cè)結(jié)果

各組大鼠頸動(dòng)脈超聲結(jié)果如圖1 所示,與正常組相比,模型組大鼠頸動(dòng)脈內(nèi)膜增生明顯,頸動(dòng)脈IMT 明顯增大,斑塊S 明顯增大；與模型組相比,實(shí)驗(yàn)組大鼠頸動(dòng)脈內(nèi)膜增生明顯減小,頸動(dòng)脈IMT 明顯減小,斑塊S 明顯減小,差異均具有統(tǒng)計(jì)意義(P＜0.05)；模型組和對(duì)照組相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.2 各組大鼠動(dòng)脈病理改變檢測(cè)結(jié)果

HE 染色結(jié)果如圖2 所示,正常組動(dòng)脈結(jié)構(gòu)完整,胞核性狀規(guī)則,內(nèi)膜、中膜以及外膜界限清晰；模型組動(dòng)脈管壁明顯增厚,僵硬度增加,管腔內(nèi)可見粥樣或者纖維斑塊,內(nèi)膜可見白色條紋或者黃白色斑塊；對(duì)照組動(dòng)脈內(nèi)膜細(xì)胞增厚明顯,泡沫狀的細(xì)胞大量填充；實(shí)驗(yàn)組動(dòng)脈壁彈性明顯恢復(fù),內(nèi)膜細(xì)胞性狀較模型組明顯好轉(zhuǎn),泡沫細(xì)胞的數(shù)量明顯減少,管腔內(nèi)脂斑沉積明顯減少。

油紅O 染色結(jié)果如圖3 所示,正常組主動(dòng)脈結(jié)構(gòu)完整,未見斑塊形成；模型組血管壁質(zhì)地脆,彈性較差,主動(dòng)脈內(nèi)膜中可見大量破損的泡沫細(xì)胞,在動(dòng)脈壁的中膜、內(nèi)膜均產(chǎn)生明顯的大小不等的AS斑塊,管腔明顯變窄??；對(duì)照組斑塊脂質(zhì)沉積明顯,斑片狀或點(diǎn)狀的斑塊向管腔凸起。 實(shí)驗(yàn)組的動(dòng)脈壁斑塊分布范圍明顯減小,內(nèi)膜基本沒有泡沫細(xì)胞,血管的彈性有所改善。

2.3 免疫組化檢測(cè)各組大鼠AS 中斑塊的穩(wěn)定

MMP-9 是AS 的形成和維系斑塊穩(wěn)定性中起關(guān)鍵性調(diào)節(jié)作用的酶。 本研究中采用免疫組化和Western blot 法檢測(cè)各組大鼠動(dòng)脈中MMP-9 的表達(dá)情況,結(jié)果如圖4 所示,與正常組相比,模型組大鼠MMP-9 的表達(dá)明顯升高(P＜0.05)；與模型組相比,實(shí)驗(yàn)組大鼠動(dòng)脈中MMP-9 的表達(dá)明顯下降,差異均具有統(tǒng)計(jì)意義(P＜0.05)；模型組和對(duì)照組相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。 推斷抑制miR-181b 的表達(dá),能抑制 MMP-9 的表達(dá),減小 AS 中斑塊的形成。

圖1 各組大鼠頸動(dòng)脈超聲結(jié)果(n=10)Note.A, normal group.B, model group.C, control group.D, experimental group.Compared with normal group, *P＜0.05.Compared with model group, #P＜0.05.Figure 1 Carotid ultrasound results of rats in each group

圖2 HE 染色檢測(cè)AS 病理改變(n=10)Note.A, normal group.B, model group.C, control group.D, experimental group.Figure 2 HE staining to detect AS pathological changes

圖3 油紅O 染色檢測(cè)各組大鼠動(dòng)脈壁上的脂質(zhì)沉積(n=10)Note.A, normal group.B, model group.C, control group.D, experimental group.Figure 3 Oil red O staining to detect lipid deposition on the arterial wall of each group of rats

圖4 免疫組化和Western blot 法檢測(cè)各組大鼠動(dòng)脈中MMP-9 的表達(dá)(n=10)Note.A, normal group.B, model group.C, control group.D, experimental group.Compared with normal group, *P ＜0.05.Compared with model group, #P＜0.05.Figure 4 Detection the expression of MMP-9 in the arteries of rats in each group by immunohistochemistry and Western blot

2.4 TUNEL 染色檢測(cè)各組大鼠動(dòng)脈細(xì)胞的凋亡

TUNEL 染色結(jié)果如圖5 所示,與正常組相比,模型組大鼠動(dòng)脈上的細(xì)胞凋亡率明顯上升(P＜0.05)；與模型組相比,實(shí)驗(yàn)組大鼠動(dòng)脈上的細(xì)胞凋亡率明顯下降,差異均具有統(tǒng)計(jì)意義(P＜0.05)；模型組和對(duì)照組相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.5 各組大鼠動(dòng)脈中 IL-6 和 TNF-α 的表達(dá)

IL-6 和TNF-α 作為在AS 中炎癥反應(yīng)的代表因子,本研究中采用免疫組化和Wetern blot 法檢測(cè)各組大鼠動(dòng)脈中IL-6 和TNF-α 的表達(dá)情況,結(jié)果如圖6、圖7 所示,與正常組相比,模型組大鼠 IL-6 和TNF-α 的表達(dá)明顯升高,與模型組相比,實(shí)驗(yàn)組大鼠動(dòng)脈中IL-6 和TNF-α 的表達(dá)明顯下降,差異均具有統(tǒng)計(jì)意義(P＜0.05),模型組和對(duì)照組相比,無明顯差異,不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.6 Western blot 檢測(cè)各組大鼠動(dòng)脈中Mex3B 蛋白的表達(dá)

Western blot 法檢測(cè)各組大鼠動(dòng)脈中蛋白Mex3B 的表達(dá)水平如圖8 所示:與正常組相比,模型組動(dòng)脈中蛋白Mex3B 的表達(dá)明顯升高(P＜0.05),與模型組相比,實(shí)驗(yàn)組大鼠動(dòng)脈中蛋白中Mex3B 的表達(dá)明顯下降(P＜0.05)。 模型組和對(duì)照組相比,無明顯差異,不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.7 qRT-PCR 檢測(cè)各組大鼠動(dòng)脈中miR-181b 和Mex3B 蛋白的 mRNA 的表達(dá)

本研究中采用RT-PCR 檢測(cè)各組大鼠動(dòng)脈中miR-181b 和 Mex3B 的 mRNA 表達(dá)水平,如圖 9 所示:與正常組比較,模型組 miR-181b 和 Mex3B 的mRNA 表達(dá)水平明顯升高(P＜0.05)；轉(zhuǎn)染 miR-181b-inhibitor 后,與模型組和對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組miR-181b 和Mex3B 的mRNA 表達(dá)水平明顯降低(P＜0.05)；模型組和對(duì)照組相比,無明顯差異,不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.8 熒光素酶報(bào)告基因分析結(jié)果

miR-181b 和Mex3B 蛋白的表達(dá)和mRNA 的變化趨勢(shì)一致,通過生物信息網(wǎng)站(www.microrna.org)上查詢miR-181b 和Mex3B 存在結(jié)合位點(diǎn)(如圖10示)。 采用雙熒光素酶報(bào)告基因分析來觀察兩者的關(guān)系結(jié)果如圖 11 示,轉(zhuǎn)染 miR-181b 后,野生型Mex3B 的熒光素酶活性被抑制(P＜0.05),突變型Mex3B 的熒光素酶活性無明顯變化(P＞0.05),說明miR-181b 與Mex3B 具有靶向調(diào)控關(guān)系。

3 討論

圖5 TUNEL 染色檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡(n=10)Note.A, normal group.B, model group.C, control group.D, experimental group.Compared with normal group, *P＜0.05.Compared with model group, #P＜0.05.Figure 5 TUNEL staining to detect cell apoptosis in each group

圖6 免疫組化和Western blot 法檢測(cè)各組大鼠動(dòng)脈中IL-6 的表達(dá)(n=10)Note.A, normal group.B, model group.C, control group.D, experimental group.Compared with normal group, *P＜0.05.Compared with model group, #P＜0.05.Figure 6 Detection the expression of IL-6 in the arteries of rats in each group by immunohistochemistry and Western blot

圖7 免疫組化和Western blot 法檢測(cè)各組大鼠動(dòng)脈中TNF-α 的表達(dá)(n=10)Note.A, normal group.B, model group.C, control group.D, experimental group.Compared with normal group, *P＜0.05.Compared with model group, #P＜0.05.Figure 7 Detection the expression of TNF-α in the arteries of rats in each group by immunohistochemistry and Western blot

圖8 各組大鼠動(dòng)脈中Mex3B 蛋白的表達(dá)(n=10)Note.A, normal group.B, model group.C, control group.D, experimental group.Compared with normal group, *P＜0.05.Compared with model group, #P＜0.05.Figure 8 Protein expression of Mex3B in the arteries of each group of rats

圖9 各組大鼠動(dòng)脈中miR-181b 和Mex3B 的mRNA 表達(dá)水平Note.A, normal group.B, model group.C, control group.D, experimental group.Compared with normal group, *P＜0.05.Compared with model group, #P＜0.05.Figure 9 mRNA expression levels of miR-181b and Mex3B in the arteries of rats in each group

圖10 生物信息網(wǎng)站預(yù)測(cè)miR-181b 和Mex3B 的關(guān)系Figure 10 Relationship between miR-181b and Mex3B predicted by bioinformatics websites

圖11 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果Figure 11 Detection results of the double luciferase reporter gene

AS 能通過引起動(dòng)脈血管管腔狹窄、循環(huán)血流量減少等進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體器官因供血不足而出現(xiàn)各種功能障礙。 因AS 而造成的易損斑塊、血栓脫落當(dāng)發(fā)生腦部位時(shí)極易誘發(fā)短暫性缺血性腦卒中危及患者生命[10]。 目前臨床上主要通過改善患者的生活方式、調(diào)節(jié)患者血脂、血糖和血壓緩解病程進(jìn)展,但尚無根治性手段。 因此開展針對(duì)AS 的靶向治療的研究在臨床上具有重大研究意義。

目前,針對(duì)AS 的靶向治療尚處于實(shí)驗(yàn)室研究階段。 研究證實(shí)[11]miRNA 不僅在AS 中細(xì)胞增殖與凋亡、自噬與分化中扮演重要角色,miRNA 作為調(diào)控因子影響AS 的各個(gè)階段,諸如動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷與功能障礙、泡沫細(xì)胞形成與表型轉(zhuǎn)換、脂質(zhì)沉積和斑塊形成等[12]。 Ma 等[13]研究證實(shí)miRNA-155 參與ApoE-/-小鼠頸動(dòng)脈粥樣硬化中的細(xì)胞自噬。 miR-181b 是miR-181 家族中與心血管疾病關(guān)系密切的成員。 研究表明[14]miR-181b 主要通過對(duì)血管炎癥以及免疫反應(yīng)的調(diào)控來參與AS 進(jìn)程。 Di等[15]研究表明miR-181b 能調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑-3(tissue inhibitor of metalloproteinase-3,TIMP-3)的表達(dá),影響AS 中微血管壁的穩(wěn)定。 Sun等[16]研究報(bào)道m(xù)iR-181b 參與調(diào)控ApoE-/-小鼠AS中由炎性誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。 黃志勇等[17]研究證實(shí)抑制miR-181b 的表達(dá)能明顯減輕ox-LDL 誘導(dǎo)的人臍靜脈細(xì)胞炎癥損傷。 本研究中轉(zhuǎn)染miR-181binhibitor 后采用維生素D3 聯(lián)合高脂飲食法構(gòu)建動(dòng)脈粥樣硬化大鼠模型,結(jié)果表明抑制miR-181b 的表達(dá)能明顯改善大鼠AS 病理癥狀,改善大鼠動(dòng)脈的脂質(zhì)沉積情況,降低動(dòng)脈中MMP-9 的表達(dá),縮小動(dòng)脈中斑塊的面積。

研究表明[18]動(dòng)脈血管壁進(jìn)展性、慢性的炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致AS 累及全身動(dòng)脈血管形成斑塊的重要原因。 Zampino 等[19]報(bào)道內(nèi)毒素誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)更容易導(dǎo)致動(dòng)脈血管發(fā)生AS 斑塊病變。 Yang 等[20]研究表明降低炎性因子的表達(dá)有助于改善AS 動(dòng)物模型的癥狀。 Gong 等[21]研究證實(shí)抑制AS 中炎性的發(fā)展能明顯改善AS 的斑塊的病變面積,促進(jìn)斑塊的消退。 紀(jì)利利等[22]臨床研究結(jié)果表明抑制炎性反應(yīng)能明顯降低頸動(dòng)脈粥樣硬化患者發(fā)生腦梗死的風(fēng)險(xiǎn)。 而MEX3B基因是四種人類同源MEX3 基因的一種。 最新研究表明[23]Mex3B 蛋白是新近發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞質(zhì)小體的組成部分,與炎性因子的mRNA轉(zhuǎn)錄、降解等生理過程密切相關(guān)。 He 等[24]研究表明在食管癌中,miR-181b 能夠與Mex3B 特異性結(jié)影響癌細(xì)胞 DNA 的復(fù)制以及細(xì)胞增殖。 Moududee等[25]研究指出Mex3B 蛋白中環(huán)指結(jié)構(gòu)域是泛素E3連接酶的特征結(jié)構(gòu)域,Mex3B 蛋白能通過泛素化作用參與細(xì)胞的炎性應(yīng)激。 Sun 等[26]研究指出miR-181b 影響泛素E3 連接酶的表達(dá)降低動(dòng)脈粥樣硬化中血管內(nèi)皮中炎性因子的表達(dá)。 本研究中RT-PCR和Western blot 結(jié)果表明在AS 模型組中 Mex3B 的mRNA 和蛋白的表達(dá)升高,炎性因子IL-6 和TNF-α大量表達(dá),AS 損傷明顯。 通過生物信息網(wǎng)站預(yù)測(cè)miR-181b 和Mex3B 存在靶向結(jié)合位點(diǎn),熒光素酶報(bào)告基因分析證實(shí) miR-181b 靶向調(diào)控 Mex3B 的表達(dá),Western blot 法結(jié)果表明抑制miR-181b 的表達(dá)后,Mex3B 的表達(dá)明顯下降,炎性因子表達(dá)下調(diào)。推斷說明miR-181b 通過靶向調(diào)控Mex3B 的表達(dá)參與AS 中炎性應(yīng)激,來抑制由炎性導(dǎo)致的AS 斑塊病變。

綜合上述,miR-181b 通過靶向調(diào)控Mex3B 的表達(dá)參與動(dòng)脈粥樣硬化中的炎性應(yīng)激,抑制miR-181b的表達(dá)能明顯抑制炎癥反應(yīng),減小動(dòng)脈粥樣硬化中斑塊的形成。 但如何將miR-181b 的靶向作用應(yīng)用到臨床對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的治療中還需進(jìn)一步的研究。