李祥磊孫秀萍

(北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心,中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所,衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實驗室,國家中醫(yī)藥管理局人類動物模型三級實驗室,北京 100021)

基于體積小,生殖周期短,易觀察且基因組與人類基因組高度同源等優(yōu)勢,實驗小鼠是復(fù)制人類疾病和研究基因功能的首選動物模型[1]。 在生命科學(xué),尤其是基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)、制藥等研究領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[2-4]。 實驗小鼠在培育過程中已分為多個品系,根據(jù)基因純合程度,可分為近交系、封閉群、雜交群三類[5]。 C57BL/6J、BALB/c 小鼠屬于近交系,ICR小鼠屬于封閉群,這三個品系小鼠在神經(jīng)精神等各類疾病模型中廣泛應(yīng)用[6]。 不同品系的小鼠,由于遺傳背景等差異,其生物學(xué)特點(diǎn)和行為表型差異也較大[7],導(dǎo)致在同一模型的建立中敏感度不同,三個品系小鼠在學(xué)習(xí)記憶能力方面研究數(shù)據(jù)又較少。故本文對這三個品系小鼠學(xué)習(xí)記憶的本底行為進(jìn)行研究,以期為神經(jīng)精神疾病動物模型的品系選擇提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

10 周齡體重 25 ～ 30 g SPF 級雄性 C57BL/6J、BALB/c、ICR 小鼠各10 只,購于北京華阜康科技股份有限公司[SCXK(京) 2019-0008]。 實驗在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所行為學(xué)分析平臺進(jìn)行[SYXK(京) 2018-0019],實驗經(jīng)本單位動物倫理批準(zhǔn)(QC18006),實驗動物的使用依據(jù)3R 原則給予人道的關(guān)懷,動物設(shè)施室內(nèi)溫度23℃～25℃,相對濕度55%±10%。 維持12 h 光照/12 h 黑暗的晝夜節(jié)律。

1.2 主要儀器

EthoVision XT9(Noldus,荷蘭)；條件恐懼實驗系統(tǒng)(MED,美國)。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組

C57BL/6J、BALB/c、ICR 小鼠按品系分為 3 組,每組10 只。 開始實驗前將動物放入檢測間適應(yīng)1 h,實驗在 9 ∶00 ～ 17 ∶00 之間進(jìn)行,每輪實驗后均需清除儀器內(nèi)殘留氣味,使用75%乙醇擦拭檢測儀器。

1.3.2 曠場實驗

曠場為邊長50 cm,高30 cm 正方體開口測試箱,測試箱頂部安裝攝像頭,監(jiān)測動物的活動狀態(tài)并將動物的行為信息采集傳輸至計算機(jī)系統(tǒng),圖像采集分析系統(tǒng)為EthoVision XT 9。 測試箱分為中央?yún)^(qū)、過渡區(qū)、邊緣區(qū)三個區(qū)域,中央?yún)^(qū)中心點(diǎn)為動物投放點(diǎn),每只小鼠在測試箱內(nèi)自由探索,記錄小鼠5 min 內(nèi)的移動距離、速度、中央?yún)^(qū)移動距離百分比、中央?yún)^(qū)停留時間、大運(yùn)動(速度大于6.6 cm/s)移動距離及小運(yùn)動(速度介于2.2 cm/s ～6.6 cm/s 之間)移動距離。

1.3.3 Barnes 迷宮實驗

Barnes 迷宮為直徑88 cm 圓盤,為避免燈光反射,設(shè)置為啞光材質(zhì),圓盤上有等距分布在圓盤邊緣的12 個直徑5 cm 圓洞,圓盤下固定逃避盒,規(guī)格為15 cm×6 cm×6 cm(長×寬×高),起始盒規(guī)格為10 cm×10 cm。 實驗圖像記錄分析軟件為EthoVision XT 9。 實驗時伴有噪音刺激(噪音錄音,80 db)和強(qiáng)光刺激(直射燈,250 lux)。 在Barnes 迷宮周圍放置幾何空間標(biāo)記物,方便小鼠空間定位,檢測間人員位置與物品擺放位置不變。 實驗分為適應(yīng)期、學(xué)習(xí)期和測試期。 適應(yīng)期,在迷宮中心放置實驗小鼠,扣上起始盒10 s 后,開啟噪音,隨之撤掉起始盒,人為干預(yù)引導(dǎo)小鼠行動路徑,進(jìn)入目標(biāo)洞后,立即關(guān)閉噪音。 小鼠在逃避盒適應(yīng)3 min 后取出,適應(yīng)期為1 d；學(xué)習(xí)期,在迷宮中心放置實驗小鼠,扣上起始盒10 s 后開啟噪音,隨之撤掉起始盒,開始實驗。每只實驗小鼠一次訓(xùn)練3 min,一天訓(xùn)練3 次,共4 d。 3 min 內(nèi)小鼠進(jìn)入目標(biāo)洞,程序停止,看作訓(xùn)練成功,小鼠從起始盒到進(jìn)入目標(biāo)洞時間為潛伏期(latency),如若3 min 內(nèi)沒有進(jìn)入目標(biāo)洞,潛伏期為3 min。 無論是否訓(xùn)練成功,均需將實驗小鼠放置在逃避盒里,適應(yīng)環(huán)境1 min；測試期,撤除逃避盒,實驗小鼠測試1 次,時間為1.5 min,操作方法同學(xué)習(xí)階段,共測試1 d,記錄目標(biāo)洞潛伏期和停留時間。

1.3.4 Y 迷宮實驗

Y 迷宮規(guī)格為30 cm×8 cm×15 cm(長×寬×高)的三個長方體拼接而成,角度互為120°,背景為白色。 圖像采集分析系統(tǒng)為EthoVision XT 9。 Y 迷宮基于動物喜愛探索新環(huán)境的特性而設(shè)計,在迷宮內(nèi)貼有3 個不同顏色,形狀標(biāo)記物,幫助小鼠進(jìn)行空間定位,檢測間人員位置與物品擺放位置不變。

自發(fā)性交替實驗實驗周期為1 d,將小鼠面壁放入起始區(qū),時間為5 min,記錄小鼠探索軌跡。 小鼠在Y 迷宮中,傾向于交替探索三個不同臂(分為A、B、C 三個臂),例如 ABC,ACB,BAC,BCA,CAB,CBA 等作為實際轉(zhuǎn)換次數(shù)(alternation),BCB、ACA、BAB 等不計入,探索進(jìn)臂總次數(shù)減兩次作為最大轉(zhuǎn)換數(shù)。 并計算轉(zhuǎn)換率=[正確交替反應(yīng)次數(shù)/(N-2)]×100%。

新異臂探索實驗一周后進(jìn)行新異臂探索實驗。將Y 迷宮三個臂分別命名為起始臂(start)、新異臂(novel)、其他臂(other)。 該實驗分為訓(xùn)練期和測試期。 訓(xùn)練期將新異臂用隔板擋住,將小鼠放入起始臂,在起始臂和其他臂中自由活動5 min,訓(xùn)練結(jié)束后歸籠。 15 min 后進(jìn)行測試期實驗。 測試期將新異臂擋板抽離,將小鼠放置起始臂,在三個臂中自由活動5 min,記錄每只小鼠在各個臂停留時間和次數(shù)。

1.3.5 條件恐懼實驗

實驗硬件由測試箱,控制器,電擊與聲音裝置構(gòu)成,計算機(jī),紅外攝像頭。 實驗周期為4 d,適應(yīng)期1 d,測試箱內(nèi)放入實驗小鼠,適應(yīng)10 min,不給予電擊和聲音刺激,學(xué)習(xí)期1 d,適應(yīng)3 min,確定三個品系小鼠之間的基線。 后對小鼠訓(xùn)練5 個循環(huán),每個訓(xùn)練包括聲音刺激(70 db,5000 Hz,30 s,條件性刺激)以及最后1 s 電擊刺激(0.5 mA,1 s,非條件性刺激),每輪訓(xùn)練間隔30 s ～60 s,訓(xùn)練結(jié)束30 s 后取出實驗小鼠；場景性條件恐懼實驗1 d,不給予電擊和聲音刺激,將小鼠放入測試箱5 min,結(jié)束后讓小鼠在箱內(nèi)停留30 s；線索性條件恐懼實驗1 d,改變測試箱氣味與環(huán)境條件,只給予聲音刺激,操作方法同訓(xùn)練期。 統(tǒng)計三個階段實驗小鼠的僵直時間。 僵直是嚙齒類動物的一種防御行為,通常呈現(xiàn)出較為刻板的蹲伏及搖擺,除正常呼吸外沒有其他肌肉活動,表達(dá)動物的恐懼行為[8]。 除實驗動物正常呼吸外,所處靜止?fàn)顟B(tài)的時間,是僵直時間判斷的標(biāo)準(zhǔn),它表明小鼠對條件恐懼刺激的記憶程度[9]。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。 實驗結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差()形式表示。 采用單因素方差分析進(jìn)行多組間比較,當(dāng)多組間有差異時,兩兩比較采用Fisher’s LSD post hoc 多重比較方法。P＜0.05 認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 C57BL/6J、BALB/c、ICR 小鼠曠場實驗數(shù)據(jù)比較

如圖1、2 所示,C57BL/6J 組小鼠移動距離與速度少于ICR 組小鼠和BALB/c 組小鼠,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01、P＜0.05),ICR 組和BALB/c組小鼠差異無統(tǒng)計學(xué)意義；如圖3 所示,C57BL/6J 組小鼠大運(yùn)動移動距離少于ICR 組小鼠,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01),C57BL/6J 組小鼠大運(yùn)動移動距離少于BALB/c 組小鼠,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01),ICR 組和BALB/c組小鼠,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義；如圖4 所示,C57BL/6J 組小鼠小運(yùn)動移動距離多于ICR 組小鼠和BALB/c 組小鼠,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01、P＜0.01),ICR 組和BALB/c組小鼠差異無統(tǒng)計學(xué)意義。 如圖5 所示,C57BL/6J組小鼠在中央?yún)^(qū)移動距離百分比最小、ICR 組小鼠其次,BALB/c 組小鼠最大,三組小鼠兩兩比較,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)；如圖6 所示,C57BL/6J 組小鼠在中央?yún)^(qū)停留時間少于BALB/c 組小鼠,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01),ICR 組小鼠在中央?yún)^(qū)停留時間少于BALB/c 組小鼠,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01),C57BL/6J 和ICR 組小鼠差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2 C57BL/6J、BALB/c、ICR 小鼠 Barnes 迷宮實驗數(shù)據(jù)比較

圖 1 C57BL/6J、ICR、BALB/c 小鼠在曠場實驗運(yùn)動距離的表現(xiàn)Note.C57BL/6J group compared with ICR group, ** P ＜0.01,* P＜0.05.C57BL/6J group compared with BALB/c group,## P＜0.01, # P＜0.05.ICR group compared with BALB/c group,$$ P＜0.01, $P＜0.05.The same as below.Figure 1 Performance of C57BL/6J, ICR, and BALB/c mice in the open field experiment

圖 2 C57BL/6J、ICR、BALB/c 小鼠在曠場實驗大運(yùn)動距離的表現(xiàn)Figure 2 Performance of C57BL/6J, ICR, and BALB/c mice in large range of movement in an open field experiment

圖 3 C57BL/6J、ICR、BALB/c 小鼠在曠場實驗小運(yùn)動距離的表現(xiàn)Figure 3 Performance of C57BL/6J, ICR, and BALB/c mice in small distance of movement in an open field experiment

圖 4 C57BL/6J、ICR、BALB/c 小鼠在曠場實驗運(yùn)動速度的表現(xiàn)Figure 4 Performance of C57BL/6J, ICR, and BALB/c mice in the field experiment

圖 5 C57BL/6J、ICR、BALB/c 小鼠在曠場實驗中央?yún)^(qū)運(yùn)動距離占總距離的百分比的表現(xiàn)Figure 5 The performance of C57BL/6J, ICR, and BALB/c mice in the percentage of the total distance in the central area of the open field experiment

圖 6 C57BL/6J、ICR、BALB/c 小鼠在曠場實驗中央?yún)^(qū)停留時間的表現(xiàn)Figure 6 Residence time of C57BL/6J, ICR, and BALB/c mice in the central area of the empty field experiment

如圖7 所示,在學(xué)習(xí)期,C57BL/6J 組小鼠進(jìn)洞潛伏期最短,其次是ICR 組小鼠,BALB/c 組小鼠最長,三組小鼠第1 天與第3 天進(jìn)洞潛伏期差異無統(tǒng)計學(xué)意義,第2 天與第4 天進(jìn)洞潛伏期差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；如圖 8 所示,在測試期,C57BL/6J 組小鼠在目標(biāo)區(qū)探索時間多于ICR 組小鼠,差異無統(tǒng)計學(xué)意義,C57BL/6J 組小鼠在目標(biāo)區(qū)探索時間多于

BALB/c 組小鼠,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01),ICR組小鼠在目標(biāo)區(qū)探索時間多于BALB/c 組小鼠,但差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

2.3 C57BL/6J、BALB/c、ICR 小鼠 Y 迷宮實驗數(shù)據(jù)比較

如圖9、圖10 和圖11 所示,三組小鼠在自發(fā)轉(zhuǎn)換率,進(jìn)臂停留時間與次數(shù)等實驗數(shù)據(jù)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖 7 C57BL/6J、ICR、BALB/c 小鼠在 Barnes迷宮實驗進(jìn)洞潛伏期的表現(xiàn)Figure 7 Performance of C57BL/6J, ICR, and BALB/c mice in Barnes maze experiment during burrow incubation period

圖 8 C57BL/6J、ICR、BALB/c 小鼠在 Barnes 迷宮實驗?zāi)繕?biāo)去探索時間的表現(xiàn)Figure 8 Performance of C57BL/6J, ICR, and BALB/c mice during Barnes maze experiment

圖 9 C57BL/6J、ICR、BALB/c 小鼠在 Y 迷宮自發(fā)性交替實驗轉(zhuǎn)換率的表現(xiàn)Figure 9 Spontaneous alternation rates of C57BL/6J,ICR, and BALB/c mice in the Y maze spontaneous alternating experiment

2.4 C57BL/6J、BALB/c、ICR 小鼠條件恐懼實驗數(shù)據(jù)比較

如圖12 所示為學(xué)習(xí)期前的適應(yīng)期,圖中僵直時間,作為三組小鼠的基線,差異無統(tǒng)計學(xué)意義；如圖13、圖14 和圖15 所示,三組小鼠在條件恐懼實驗學(xué)習(xí)期、場景性條件恐懼和線索性條件恐懼僵直時間,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖 10 C57BL/6J、ICR、BALB/c 小鼠在 Y 迷宮新異臂探索實驗進(jìn)臂停留時間的表現(xiàn)Figure 10 Time in arm visitss of C57BL/6J, ICR,and BALB/c mice in the Y maze experiment

圖 11 C57BL/6J、ICR、BALB/c 小鼠在 Y 迷宮新異臂探索實驗進(jìn)臂次數(shù)的表現(xiàn)Figure 11 The performance of C57BL/6J, ICR,and BALB/c mice in the experiment of Y maze new different arm exploration

圖 12 C57BL/6J、ICR、BALB/c 小鼠在條件恐懼實驗學(xué)習(xí)期的僵直時間基線Figure 12 Rigid time baseline of C57BL/6J, ICR, and BALB/c mice during conditioned fear experimental learning period

圖 13 C57BL/6J、ICR、BALB/c 小鼠在條件恐懼學(xué)習(xí)期的僵直時間表現(xiàn)Figure 13 Frezzing time of C57BL/6J, ICR, and BALB/c mice during conditioned fear learning period

圖 14 C57BL/6J、ICR、BALB/c 小鼠在場景性條件恐懼實驗的僵直時間表現(xiàn)Figure 14 Frezzing time performance of C57BL/6J, ICR,and BALB/c mice in the contextual fear conditioning experiment

圖 15 C57BL/6J、ICR、BALB/c 小鼠在線索性條件恐懼實驗的僵直時間表現(xiàn)Figure 15 Frezzing time performance of C57BL/6J, ICR,and BALB/c mice in the cued fear conditioning experiment

3 討論

曠場實驗因其操作相對簡單、應(yīng)激刺激小的特點(diǎn),用于檢測動物自發(fā)活動以及焦慮水平,在神經(jīng)精神疾病和神經(jīng)精神藥理方面應(yīng)用最多[10]。 本實驗結(jié)果表明,C57BL/6J 小鼠運(yùn)動距離、運(yùn)動速度及運(yùn)動時間均顯著低于其他兩組小鼠,說明其自發(fā)活動低于ICR 與BALB/c 小鼠。 基于嚙齒類動物的趨觸性,將實驗區(qū)域分為邊緣區(qū)和中央?yún)^(qū),發(fā)現(xiàn)C57BL/6J 小鼠中央?yún)^(qū)運(yùn)動距離與中央?yún)^(qū)時間均顯著低于ICR 與BALB/c 小鼠,說明在曠場實驗中其焦慮水平高于ICR 與BALB/c 小鼠,與李騰飛實驗結(jié)果一致[11]。 但也與另一些文獻(xiàn)[12-13]報道不一致。 可能與行為學(xué)測試方法不同等有關(guān)。 需要結(jié)合高架十字迷宮實驗、埋珠實驗等進(jìn)行進(jìn)一步分析。 每一種行為學(xué)檢測方法都需要實驗動物進(jìn)行運(yùn)動,曠場實驗雖然不能測試小鼠學(xué)習(xí)記憶能力,但可以測試小鼠的運(yùn)動能力是否正常,以免影響后續(xù)實驗結(jié)果。

1979 年美國學(xué)者 Carol A Barnes 發(fā)明 Barnes 迷宮實驗,用于檢測海馬依賴的空間參考記憶[14]。 與水迷宮實驗利用嚙齒類動物懼怕水的特性不同,Barnes 迷宮利用嚙齒類動物愛探索且避光的特性而設(shè)計,對動物應(yīng)激刺激較小。 實驗不需要水源,將動物放在空曠的Barnes 迷宮中央,通過使用躁聲與強(qiáng)光作為刺激手段,促使動物尋找目標(biāo)洞。 學(xué)習(xí)期結(jié)果表示,C57BL/6J 小鼠在進(jìn)洞潛伏期方面優(yōu)于ICR 小鼠和BALB/c 小鼠；測試期結(jié)果表示,C57BL/6J 小鼠在目標(biāo)區(qū)停留時間方面優(yōu)于ICR 小鼠和BALB/c 小鼠。 綜合結(jié)果,C57BL/6J 小鼠展示出的空間參考記憶能力優(yōu)于ICR 小鼠和BALB/c 小鼠。與劉雪芹等的[15]水迷宮測試結(jié)果一致。

Y 迷宮由Dellu 等發(fā)明,針對嚙齒類動物,Y 迷宮自發(fā)性交替實驗研究空間工作記憶能力,利用嚙齒類動物喜愛探索新環(huán)境,動物每次轉(zhuǎn)換探索方向時都要記住前一次探索的方向,而下一次就會探索另一方向[16]。 自發(fā)性交替轉(zhuǎn)換率越高,說明動物的工作記憶能力越強(qiáng)。 Y 迷宮新異臂探索實驗研究空間識別記憶能力,同樣利用嚙齒類動物喜愛探索新環(huán)境,傾向于探索新異臂的偏好。 對新異臂探索時間越長,次數(shù)越多,說明動物的空間識別記憶能力越強(qiáng)。 實驗中三組小鼠在自發(fā)性交替實驗的轉(zhuǎn)換率,沒有顯著性差異,提示三組小鼠在空間工作記憶沒有顯著性差異；新異臂探索實驗中,進(jìn)入各臂的次數(shù)與時間上均沒有顯著差異,表明在空間識別記憶能力上三組小鼠沒有顯著性差異。

條件性恐懼實驗三組小鼠僵直時間的基線沒有顯著差異；三組小鼠在學(xué)習(xí)階段、場景性條件恐懼測試和線索性恐懼測試中,僵直時間均沒有顯著性差異,三個測試階段沒有顯著差異,提示三組小鼠在條件性恐懼記憶的生成沒有顯著差異性。

本研究比較了三個品系小鼠焦慮水平、空間參考記憶能力、空間工作記憶能力以及條件性恐懼記憶能力。 豐富了實驗小鼠的生物學(xué)特性數(shù)據(jù),對動物實驗中小鼠品系選擇提供參考依據(jù)；尤其為神經(jīng)精神疾病動物模型的品系選擇提供數(shù)據(jù)支撐。