湯喜蘭,徐國(guó)良,董偉,李洪銘,邱俊輝,孫楠,劉芳,劉思宇,李冰濤*

(1. 江西科技師范大學(xué)藥學(xué)院,南昌 330013; 2. 江西中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)基礎(chǔ)理論分化發(fā)展研究中心,南昌 330004; 3. 江西中醫(yī)藥大學(xué)現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南昌 330004)

心臟肥大是心臟血流動(dòng)力學(xué)壓力和容量超負(fù)荷及神經(jīng)體液因素等引起的主要病理生理反應(yīng),表現(xiàn)為蛋白質(zhì)合成增加,肌節(jié)致密重組,心肌細(xì)胞體積增大,是各種心血管疾病心肌重構(gòu)過(guò)程中的關(guān)鍵階段。 持續(xù)的心臟肥大最終可導(dǎo)致心力衰竭,增加心血管疾病的發(fā)病率和死亡率,威脅人類健康[1]。因此,心臟肥大的發(fā)生機(jī)制是心血管疾病研究的重點(diǎn)。

異丙腎上腺素是一種β-腎上腺素能受體激動(dòng)劑,可作用于心肌組織,引起心肌損傷、心肌梗死、心肌肥厚甚至心力衰竭等[2]。 異丙腎上腺素誘導(dǎo)的大鼠心臟肥大模型是心臟肥大藥物評(píng)價(jià)的常用模型,尤其適用于研究心臟肥大過(guò)程中心肌結(jié)構(gòu)和功能的適應(yīng)性[3],受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的持續(xù)關(guān)注。 代謝組學(xué)是一門(mén)新的組學(xué)研究技術(shù),可以幫助我們了解各種心血管疾病狀態(tài)下發(fā)生的整體代謝和心臟特異性代謝的變化,明確心血管疾病的分子標(biāo)志物和代謝組學(xué)特征,已廣泛應(yīng)用于心血管疾病研究[4-5]。

本研究擬采用超高效液相色譜-四級(jí)桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心臟肥大大鼠血清代謝物的變化,通過(guò)主成分分析尋找潛在的生物標(biāo)志物并進(jìn)行代謝通路分析,探索心臟肥大大鼠體內(nèi)的代謝變化,為心臟肥大的防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物

16 只 SPF 級(jí) SD 雄性大鼠,5 ～ 6 周齡,體重200 ～220 g,由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供【SCXK(湘)2016-0002】,飼養(yǎng)于江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技中心屏障系統(tǒng)【SYXK(贛)2017-0004】。 飼養(yǎng)條件：溫度(22 ± 2)℃,濕度 50% ±5%,12 h 光照/黑暗循環(huán),自由攝食飲水。 所有操作均符合江西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理要求,滿足3R原則(審批號(hào)：JZLLSC2017_0109)。

1.1.2 試劑與儀器

異丙腎上腺素(上海源葉生物科技有限公司,TP0395)。

XS203S 萬(wàn)分之一電子天平(瑞士梅特勒-托利多),TGL20 M 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(鹽城市凱特實(shí)驗(yàn)儀器有限公司),安捷倫6538 A 超高效液相色譜-四級(jí)桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜(Ultra high performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight mass spectrometry, UHPLC-Q-TOF-MS, Agilent, 美國(guó)),色譜柱為 ZORBAXExtend-C18 柱(2.1×100 mm,3.5 μm, Agilent)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組與造模

16 只大鼠按體重隨機(jī)分為正常組和模型組,每組各8 只。 參考文獻(xiàn)[6],加以調(diào)整,給予模型組大鼠腹腔注射異丙腎上腺素30 mg/(kg·d),連續(xù)14 d建立大鼠心臟肥大模型。 正常組大鼠腹腔注射等體積生理鹽水。 以心臟重量指數(shù)包括心臟重量與體重比值(HW/BW)、左心室重量與體重比值(LVW/BW)以及右心室重量與體重比值(RVW/BW)判斷大鼠心臟肥大模型是否成功。 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,所有大鼠給予普通飼料進(jìn)行正常飼養(yǎng),每?jī)商旆Q重及更換墊料。

1.2.2 樣本采集與制備

觀察記錄大鼠一般行為學(xué)變化,包括精神狀態(tài),被毛,飲食等。 末次注射異丙腎上腺素后,大鼠禁食不禁水12 h,次日早晨麻醉,腹主動(dòng)脈取血,取心臟組織并稱重。

血清樣本的制備：血液4℃靜置2 h,4℃離心10 min(3000 r/min),分離血清。 各取 100 μL 血清樣本進(jìn)行混合制備QC 樣本。 從各血清樣本(含QC)取100 μL 血清,加入甲醇 300 μL,渦旋混勻 30 s,4℃恒溫靜置3 h,離心15 min(15 000 r/min,4℃),取上清于1.5 mL EP 管,真空濃縮離心,加水-甲醇濃度(水 ∶甲醇 =85 ∶15)200 μL 復(fù)溶,渦旋混勻30 s,離心15 min(15 000 r/min,4℃),取上清于樣品瓶,進(jìn)樣。

1.2.3 色譜和質(zhì)譜條件

安捷倫UHPLC-Q-TOF-MS;色譜柱為ZORBAX Extend-C18 柱(2.1 × 100 mm, 3.5 μm,Agilent),流動(dòng)相A 為 0.1%甲酸水,流動(dòng)相B 為0.1%甲酸乙腈,進(jìn)樣量4 μL,柱溫35℃,樣品室溫度4℃,流速0.4 mL/min,梯度洗脫條件：0 ～ 4 min,98% ～ 88%A,4 ～ 14 min,88% ～ 19% A,14 ～ 17 min,19% ～9% A,17 ～ 18 min,9% ～ 0% A,18 ～ 20 min,0% ～98% A,20 ～ 23 min,98% ～ 98% A。

質(zhì)譜條件：正離子模式下采集譜圖對(duì)前處理的樣品進(jìn)行分析,為保持儀器穩(wěn)定性,精密度和重現(xiàn)性,使用儀器配套的參比液進(jìn)行實(shí)時(shí)校正,采用Dual ESI 源,正離子模式下(4000 V),干燥氣溫度350℃,干燥氣流速：10 L/min;掃描(Full Scan)方式,掃描范圍：m/z 50 ～ 1200,噴霧室壓力：35 psig;碎片電壓：120 V;錐孔電壓：60 V。 儀器使用參比自動(dòng)校正,參比液以 5 μL/min 的速度通過(guò)自動(dòng)傳輸入口,參比離子m/z 121.05973 和m/z 922.09798。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

心臟重量指數(shù)采用Graphpad prism 6.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,數(shù)據(jù)以平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx ± s)表示,兩組間比較采用t 檢驗(yàn),P＜0.05 代表差異具有顯著性。采用Profinder B.06.0 軟件對(duì)原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行格式轉(zhuǎn)換(轉(zhuǎn)化為.cef 格式數(shù)據(jù)),數(shù)據(jù)導(dǎo)入MPP 軟件進(jìn)行峰提取、匹配、對(duì)齊和標(biāo)準(zhǔn)化處理,然后將處理后數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P 12.0 進(jìn)行主成分分析(PCA)和偏最小二乘法分析(PLS-DA),以相關(guān)性系數(shù)[P(coor)＞0.8]和變量重要性(VIP ＞1)為條件,進(jìn)一步通過(guò)組間t 檢驗(yàn)篩選差異代謝物(P＜0.05),采用Human Metabolome Database (HMDB)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異代謝物進(jìn)行定性,利用MetaboAnalyst 4.0 軟件進(jìn)行相關(guān)代謝通路分析。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況及心臟重量指數(shù)變化分析

正常組大鼠精神狀態(tài)良好,毛發(fā)有光澤,體重穩(wěn)定上升。 心臟肥大模型組大鼠精神萎靡,動(dòng)作遲緩,毛發(fā)失去光澤,體重增長(zhǎng)緩慢,明顯低于正常組大鼠體重增長(zhǎng)(見(jiàn)圖1)。 與正常大鼠相比,模型組大鼠HW/BW、LVW/BW 及 RVW/BW 顯著增加(P＜0.05),見(jiàn)圖2。

圖1 大鼠體重變化Figure 1 Body weight changes in rats

2.2 大鼠血清代謝輪廓分析

圖3 顯示了正常組大鼠與模型組大鼠血清樣本的總離子色譜圖。 從兩組總離子流圖的血清樣品分析中,可以看出樣品出峰均勻,強(qiáng)度適中,說(shuō)明此時(shí)液相質(zhì)譜條件適合正常組及模型組的血清樣品分析。

2.3 樣品及設(shè)備穩(wěn)定性分析

本研究采用QC 控制樣品檢測(cè)過(guò)程中樣品及設(shè)備的穩(wěn)定性。 采樣前,運(yùn)行1 次QC,采樣過(guò)程中,每檢測(cè)8 個(gè)樣品運(yùn)行1 次 QC,共運(yùn)行3 次 QC 樣品。圖4 顯示了3 次QC 樣品總離子流圖的疊加,可以看出主要樣品峰的強(qiáng)度、保留時(shí)間都能重合,沒(méi)有差異,說(shuō)明樣品檢測(cè)過(guò)程中樣品及儀器均穩(wěn)定。

2.4 大鼠血清代謝物主成分分析

用主成分分析方法考察異丙腎上腺素對(duì)大鼠血清內(nèi)源性代謝物質(zhì)的影響,正離子模式下PCA 得分圖顯示正常組與模型組分離明顯,組內(nèi)聚集程度較好,提示與正常組相比,異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心臟肥大大鼠內(nèi)源性代謝物發(fā)生了顯著變化(見(jiàn)圖5)。

2.5 潛在生物標(biāo)志物篩選

為進(jìn)一步研究異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心臟肥大大鼠血清中的內(nèi)源性代謝物質(zhì),我們采用基于正交信號(hào)校正偏最小二乘法的U-plot 來(lái)初步篩選符合異丙腎上腺素誘導(dǎo)心臟肥大模型大鼠血清中內(nèi)源性物質(zhì)狀態(tài)特征的生物標(biāo)志物群,選擇相關(guān)性系數(shù)大于0.8 且VIP 大于1 的變量作為候選生物標(biāo)志物變量,并對(duì)兩組中的候選生物標(biāo)志物變量進(jìn)行峰面積t檢驗(yàn),將P＜0.05 的化合物作為差異顯著的潛在生物標(biāo)志物,結(jié)果見(jiàn)圖6。

注：與正常組相比,*P ＜ 0.05。 (圖 7 同)圖2 大鼠心臟重量指數(shù)比較Note. Compared with normal group,*P ＜0.05.(The same in the Figure 7)Figure 2 Comparison of rat heart weight index

圖3 正離子模式下大鼠血清的總離子色譜圖Figure 3 UHPLC-Q-TOF-MS spectra of rat serum samples in ESI+ mode

圖4 QC 樣本疊加總離子流圖Figure 4 Superposition of total ion chromatogram of QC samples

2.6 潛在生物標(biāo)志物鑒定

共得到13 個(gè)生物標(biāo)志物,按照前期文獻(xiàn)[7-8],采用HMDB 數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)確定生物標(biāo)志物,共鑒定出10個(gè)潛在生物標(biāo)志物,3 個(gè)未通過(guò)鑒定。 10 個(gè)潛在生物標(biāo)志物分別為鞘氨醇-1-磷酸、二高-γ-亞麻酸、D-果糖-1,6-二磷酸、脫氧腺嘌呤核苷、N-乙酰蛋氨酸、植物鞘氨醇、尿囊素、3-酮基-β-D-半乳糖、辛烷和甘油(見(jiàn)表1)。 與正常組相比,心臟肥大模型組大鼠血清鞘氨醇-1-磷酸和二高-γ-亞麻酸下調(diào),其余8 個(gè)潛在生物標(biāo)志物上調(diào)(見(jiàn)圖7)。

注： ：正常組; ：模型組。圖5 正離子模式下大鼠血清PCA 得分圖Note. , Normal group. , Model group.Figure 5 PCA of metabolites in rats serum in ESI+ mode

2.7 生物標(biāo)志物代謝通路分析

將鑒定的 10 個(gè)潛在生物標(biāo)志物導(dǎo)入MetaboAnalyst 4.0 進(jìn)行 Pathway Analysis 分析,結(jié)果顯示生物標(biāo)志物主要參與鞘脂代謝、甘油脂代謝、半乳糖代謝、不飽和脂肪酸的生物合成和嘌呤代謝(見(jiàn)圖8)。

圖6 潛在生物標(biāo)志物篩選圖Figure 6 Screening for the potential biomarkers in ESI+ mode

表1 異丙腎上腺素誘導(dǎo)心臟肥大大鼠血清潛在生物標(biāo)志物Table 1 Potential serum biomarkers of cardiac hypertrophy rats model induced by isoproterenol

圖7 潛在代謝標(biāo)志物的相對(duì)含量變化Figure 7 Changes in the relative content of potential metabolic markers

圖8 相關(guān)代謝通路Figure 8 Relevant metabolic pathways

3 討論

本研究采用連續(xù)14 d 腹腔注射異丙腎上腺素30 mg/(kg·d)建立大鼠心臟肥大模型,研究結(jié)果顯示,異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心臟肥大大鼠的心臟重量、左心室重量和右心室重量顯著增加,結(jié)果表明模型建立成功。 我們進(jìn)一步基于UHPLC-Q-TOFMS 技術(shù)和數(shù)據(jù)分析,篩選出異丙腎上腺素誘導(dǎo)的大鼠心臟肥大10 個(gè)潛在生物標(biāo)志物,涉及鞘脂代謝、甘油脂代謝、半乳糖代謝、不飽和脂肪酸的生物合成和嘌呤代謝等代謝通路。

鞘氨醇-1-磷酸和植物鞘氨醇的含量變化反映了鞘脂代謝改變。 鞘氨醇-1-磷酸(sphingosine 1-phosphate, S1P)是神經(jīng)鞘磷脂經(jīng)過(guò)多步酶促反應(yīng)生成。 神經(jīng)鞘磷脂在鞘磷脂酶的催化下生成神經(jīng)酰胺,在神經(jīng)酰胺酶的催化作用下生成鞘氨醇,在鞘氨醇激酶的催化作用下生成鞘氨醇-1-磷酸[9]。 S1P參與調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞穩(wěn)態(tài),研究表明血漿S1P 尤其是高密度脂蛋白結(jié)合的S1P 含量與心血管疾病呈負(fù)相關(guān),可能成為心血管疾病的潛在標(biāo)志物[10-11]。Liu 等[12-13]研究表明異丙腎上腺素85 mg/kg 皮下注射誘導(dǎo)的大鼠心肌梗死模型和高膽固醇誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化家兔模型中血漿植物鞘氨醇含量顯著升高,另外,植物鞘氨醇蓄積可能是心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷最重要的特征,它促使心肌細(xì)胞線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開(kāi)放,導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡[14]。 本研究中異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心臟肥大大鼠血清中S1P下調(diào),植物鞘氨醇上調(diào),與上述文獻(xiàn)報(bào)道相一致。

心臟衰竭時(shí),心肌糖脂代謝失衡,能量供應(yīng)不足。 代謝組學(xué)研究表明心衰時(shí)與能量代謝相關(guān)的代謝途徑如甘油脂代謝、半乳糖代謝、脂肪酸的生物合成及嘌呤代謝等會(huì)發(fā)生顯著改變[15-16]。 本研究檢測(cè)到異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心臟肥大大鼠血清中糖脂代謝中間代謝產(chǎn)物甘油的含量顯著上調(diào),代謝通路分析結(jié)果表明甘油所參與的甘油脂代謝途徑和半乳糖代謝途徑都發(fā)生改變。 二高-γ-亞麻酸,屬N-6 系列多不飽和脂肪酸,是生物合成前列腺素E1 的前體物質(zhì)。 研究表明急性失代償性心力衰竭患者血清中二高-γ-亞麻酸(dihomo-γ-linolenic acid,DGLA)含量、花生四烯酸(arachidonic acid, AA)含量和DGLA/AA 比值越低,存活率越低。 N-6 系列多不飽和脂肪酸水平[17-18],尤其是DGLA 含量和DGLA/AA 比值與急性心血管疾病和急性失代償性心衰患者的臨床預(yù)后顯著相關(guān)[19]。 本研究發(fā)現(xiàn)異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心臟肥大大鼠血清中DGLA 含量顯著下調(diào),進(jìn)一步代謝通路分析結(jié)果表明不飽和脂肪酸合成代謝與異丙腎上腺素誘導(dǎo)的大鼠心臟肥大有關(guān)。 另外,心衰時(shí)嘌呤代謝也發(fā)生明顯改變。王真真等[20]研究表明在冠狀動(dòng)脈結(jié)扎誘導(dǎo)的大鼠心衰模型中,心肌黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase,XO)表達(dá)顯著上調(diào),本研究發(fā)現(xiàn)在異丙腎上腺素誘導(dǎo)的大鼠心臟肥大模型中,血清脫氧腺苷含量顯著增加,二者都體現(xiàn)了嘌呤分解代謝活躍的特點(diǎn)。 脫氧腺苷是腺嘌呤的一種代謝產(chǎn)物,其在心臟肥大發(fā)病中的作用尚有待進(jìn)一步研究。

本文采用代謝組學(xué)的分析手段檢測(cè)了異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心臟肥大大鼠血清代謝物的變化,通過(guò)多元統(tǒng)計(jì)分析,確定了鞘氨醇-1-磷酸、二高-γ-亞麻酸、D-果糖-1,6-二磷酸、脫氧腺嘌呤核苷、N-乙酰蛋氨酸、植物鞘氨醇、尿囊素、3-酮基-β-D-半乳糖、辛烷和甘油10 個(gè)生物標(biāo)志物,這些代謝物主要與鞘脂代謝、甘油脂代謝、半乳糖代謝、不飽和脂肪酸的生物合成和嘌呤代謝等途徑有關(guān)。 本研究為探索心臟肥大的發(fā)病機(jī)制和診斷防治提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。